張敏，薛正蓮，余飛，劉艷，王洲

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖，241000)

γ-氨基丁酸(GABA)是一種天然非蛋白質(zhì)類氨基酸，存在于動(dòng)物、植物及微生物內(nèi)，具有降血糖、降血壓及抗抑郁等重要的生理功能，目前主要作為功能性食品應(yīng)用，在市場(chǎng)上具有較廣前景[1-4]。其主要是由谷氨酸脫羧酶(GAD)催化L-谷氨酸形成。目前獲取GABA的方法主要為化學(xué)合成法、植物富集法及微生物發(fā)酵法[5-7]，但化學(xué)合成的GABA不能用于食品領(lǐng)域，只能用于化工和醫(yī)藥領(lǐng)域；植物富集法得到的GABA產(chǎn)量較低，不能大量提?。煌ㄟ^微生物發(fā)酵能夠產(chǎn)生大量的GABA，已報(bào)道的有酵母菌、乳酸菌、大腸桿菌[8-10]等，因大腸桿菌存在安全隱患，乳酸菌為食用菌且口感好，受到人們的廣泛青睞，因此利用乳酸菌生產(chǎn)GABA較為常見。

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)能夠研究發(fā)酵過程中底物的消耗速率、菌體的生長(zhǎng)速率與產(chǎn)物的合成速率之間的關(guān)系，通過分析發(fā)酵動(dòng)力學(xué)，可進(jìn)一步了解微生物的生理特性、菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成的最適條件，為后續(xù)工業(yè)化中發(fā)酵罐的過程控制以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供理論依據(jù)[11-12]。

糞腸乳酸球菌是兼性厭氧微生物，在有氧和無氧條件下均可生長(zhǎng)，但在厭氧條件可促進(jìn)GAD表達(dá)，并有利于乳酸菌的GABA合成，因而搖瓶水平一般采取靜置發(fā)酵的形式[13-14]。但是轉(zhuǎn)速直接影響基質(zhì)的利用，通常靜置發(fā)酵時(shí)菌株生長(zhǎng)緩慢且生物量較低，限制了GABA的大量合成。本文通過分析不同轉(zhuǎn)速下(0和100 r/min)的發(fā)酵曲線和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，基于不同轉(zhuǎn)速發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成的變化，發(fā)現(xiàn)72 h、0 r/min產(chǎn)量最高，穩(wěn)定期、100 r/min生物量最高。提出了兩階段轉(zhuǎn)速調(diào)控策略，并對(duì)影響此調(diào)控策略的發(fā)酵條件(階段時(shí)間、裝液量及轉(zhuǎn)速)進(jìn)行正交優(yōu)化，進(jìn)一步提高糞腸乳酸球菌合成GABA的產(chǎn)量，為進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)GABA提供了基礎(chǔ)條件。

1 材料與方法

1.1 菌種

糞腸乳酸球菌En1202由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試劑與材料

新華一號(hào)濾紙、正丁醇、冰醋酸、茚三酮、無水乙醇、CuSO4·5H2O，均購于上海生工(分析純)。

層析液：V(正丁醇)∶V(冰醋酸)∶V(水)=2∶1∶1，并在層析液中添加8 g/L的茚三酮。

洗脫液：V(75%乙醇)∶V(6 g/L CuSO4·5H2O)=39∶1。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉10，葡萄糖5，吐溫-80 0.1 mL，K2HPO40.2，檸檬酸二銨0.2，MgSO40.2，MnSO40.05，三水合乙酸鈉5，瓊脂粉20，pH 6.5；115 ℃，滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉10，葡萄糖5，吐溫-80 0.1 mL，K2HPO40.2，檸檬酸二銨0.2，MgSO40.2，MnSO40.05，三水合乙酸鈉5，pH 6.5；115 ℃，滅菌30 min，100 mL/250 mL搖瓶。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨5，酵母浸出粉5，葡萄糖10，丁二酸鈉5,MSG 10，pH 6.5；115 ℃，滅菌30 min，75 mL/250 mL搖瓶。

1.4 培養(yǎng)方法

將斜面活化后的糞腸乳酸球菌接種于種子培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h。以10 %(體積分?jǐn)?shù))接種量將種子液接入75 mL/250 mL搖瓶中，30 ℃靜置或100 r/min厭氧發(fā)酵72 h。

1.5 分析方法

1.5.1 生物量測(cè)定

按1.4培養(yǎng)方法，每隔2 h取樣在酶標(biāo)儀600 nm處檢測(cè)吸光度，并將菌液適當(dāng)稀釋后涂布于斜面上于30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察并計(jì)算平板單菌落數(shù)(×109CFU/mL)，建立菌液吸光度與生物量的標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]，后續(xù)操作按此方法測(cè)定生物量。

1.5.2 GABA產(chǎn)量的測(cè)定

采用紙層析-酶標(biāo)儀法[16]，用微量取樣器吸取1 μL發(fā)酵上清液滴在濾紙上，待濾紙干后將濾紙放進(jìn)已飽和12 h的層析缸內(nèi)進(jìn)行層析，一段時(shí)間后取出并吹干，然后將GABA斑點(diǎn)剪下并放進(jìn)5 mL洗脫液中洗脫，洗脫條件為40 ℃、80 r/min洗脫30 min，用酶標(biāo)儀于512 nm處測(cè)定吸光度。

1.5.3 殘余還原糖的測(cè)定

利用3,5-二硝基水楊酸法檢測(cè)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖1 菌體生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of bacterial biomass

由圖1可見，糞腸乳酸球菌菌液的吸光度與平板單菌落數(shù)(×109CFU/mL)之間的線性關(guān)系良好，回歸方程為y=2.263 5×x-0.202 9 (R2=0.997 8)，后續(xù)試驗(yàn)的菌體生物量可用平板單菌落數(shù)(×109CFU/mL)表示。

2.2 不同轉(zhuǎn)速下GABA發(fā)酵曲線及動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

試驗(yàn)研究了不同的轉(zhuǎn)速下(0和100 r/min)菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成的關(guān)系，結(jié)果見圖2，圖中各試驗(yàn)點(diǎn)為3組重復(fù)試驗(yàn)后的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差?？梢钥闯?，當(dāng)轉(zhuǎn)速為0時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，32 h才達(dá)到穩(wěn)定期(此時(shí)生物量為(2.755±0.055)×109CFU/mL，穩(wěn)定期僅能維持4 h)；GABA產(chǎn)量在72 h達(dá)到最大((5.985±0.116)g/L)且趨于穩(wěn)定，此時(shí)葡萄糖已基本消耗殆盡，無法繼續(xù)提供菌體生長(zhǎng)所需能量，菌體大量衰亡(此時(shí)生物量?jī)H為(0.751±0.017)×109CFU/mL)，雖然菌體自溶會(huì)釋放一定量的GAD，但由于之前GABA的積累、GAD參與的耐酸機(jī)制[18](主要體現(xiàn)在2方面：一是細(xì)胞進(jìn)入GABA合成期時(shí)，谷氨酸脫羧合成GABA需要消耗H+，二是生成的產(chǎn)物GABA的堿性強(qiáng)于底物L(fēng)-谷氨酸)對(duì)環(huán)境pH起到了調(diào)節(jié)效果，pH呈上升趨勢(shì)，此時(shí)pH接近中性(pH=6.80±0.05)，GAD失去活性[19]，無法繼續(xù)催化L-谷氨酸合成GABA。

圖2 不同恒定轉(zhuǎn)速條件下糞腸乳酸球菌產(chǎn)GABA發(fā)酵進(jìn)程曲線Fig.2 Times courses of GABA production by Enterococcus lactic acid faecalis at various constant rotational speed

而適當(dāng)增加轉(zhuǎn)速(100 r/min)時(shí)，12 h內(nèi)菌體迅速生長(zhǎng)，20 h便達(dá)到穩(wěn)定期(此時(shí)生物量為(3.964±0.079)×109CFU/mL，穩(wěn)定期能維持28 h)；GABA產(chǎn)量在72 h后仍再繼續(xù)增長(zhǎng)，雖然此時(shí)葡萄糖已基本消耗殆盡，無法繼續(xù)提供菌體生長(zhǎng)所需能量，菌體開始衰亡(此時(shí)生物量為(3.484±0.065)×109CFU/mL)，發(fā)酵初期由于厭氧發(fā)酵導(dǎo)致乳酸等有機(jī)酸積累，引起pH下降并激活GAD開始生產(chǎn)GABA，雖然GAD參與的耐酸機(jī)制會(huì)對(duì)環(huán)境pH起到調(diào)節(jié)效果，使pH呈上升趨勢(shì)，但此時(shí)pH=4.70±0.04(LI等[20-24]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中控制pH=5.0左右，更有利于GABA的合成)，還未衰亡的菌體仍可利用L-谷氨酸繼續(xù)合成GABA。

綜上所述，最適菌體生長(zhǎng)和GABA合成的最佳轉(zhuǎn)速并不一致，0 r/min有利于GABA的合成，100 r/min有利于菌體的生長(zhǎng)，發(fā)酵過程中設(shè)定單一的轉(zhuǎn)速，不能使菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成同時(shí)達(dá)到理想狀態(tài)。為在保證菌體生長(zhǎng)的同時(shí)提高GABA產(chǎn)量，提出了一種兩階段轉(zhuǎn)速控制策略。

2.3 不同轉(zhuǎn)速下發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立與分析

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究菌體生長(zhǎng)、底物消耗以及產(chǎn)物生成之間的關(guān)系，通過數(shù)學(xué)建模的方法來分析參數(shù)變化及發(fā)酵規(guī)律，將復(fù)雜的發(fā)酵過程通過數(shù)學(xué)方程簡(jiǎn)化，有利于進(jìn)一步探究菌體新陳代謝過程，從而對(duì)發(fā)酵過程中的參數(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)或?qū)ΜF(xiàn)有工藝進(jìn)行改進(jìn)[11-12]。

本試驗(yàn)通過建立不同轉(zhuǎn)速下(0和100 r/min)的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，比較不同轉(zhuǎn)速發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成的變化，并驗(yàn)證菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成之間是否為偶聯(lián)或部分偶聯(lián)關(guān)系，為后續(xù)兩階段轉(zhuǎn)速調(diào)控策略的優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。

2.3.1 菌體生長(zhǎng)模型

Logistic方程是典型的S型曲線，可以很好地反應(yīng)菌體濃度的增加對(duì)自身生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制作用，且達(dá)到穩(wěn)定期后菌體停止生長(zhǎng)，因此微生物生長(zhǎng)過程可以用Logistic方程來描述[25]，如公式(1)所示：

(1)

式中：X,菌體生物量(×109CFU/mL);μm,最大菌體比生長(zhǎng)速率(h-1);Xm,最大菌體濃度(×109CFU/mL)。

2.3.2 產(chǎn)物生成模型

菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物形成之間的關(guān)系有3種，當(dāng)α≠0,β=0時(shí)為一類發(fā)酵，又稱偶聯(lián)模型；當(dāng)α≠0,β≠0時(shí)為二類發(fā)酵，又稱部分偶聯(lián)模型；當(dāng)α=0,β≠0時(shí)為三類發(fā)酵，又稱非偶聯(lián)模型。由式2可知，菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成之間符合部分偶聯(lián)型的特征，因此可以采用Luedeking-Piret方程來描述產(chǎn)物的積累過程并進(jìn)一步驗(yàn)證其是否為部分偶聯(lián)關(guān)系[25]：

(2)

式中:P,產(chǎn)物濃度(g/L)；α,菌體生長(zhǎng)有關(guān)的產(chǎn)物生成比例常數(shù)；β,菌體濃度有關(guān)的產(chǎn)物生成比例系數(shù)。

2.3.3 底物消耗模型

GABA發(fā)酵過程中葡萄糖的消耗主要用于菌體生長(zhǎng)及細(xì)胞代謝，假設(shè)葡萄糖參與產(chǎn)物的形成過程，那么還原糖消耗模型可以表示為公式(3)[26]：

(3)

式中:S,葡萄糖濃度，g/L;Yx/s,對(duì)基質(zhì)的細(xì)胞得率系數(shù);Yp/s,對(duì)基質(zhì)的產(chǎn)物得率系數(shù)，即產(chǎn)物GABA得率系數(shù)；ms，微生物維持系數(shù)；此模型主要反映關(guān)鍵底物消耗與菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成的關(guān)系。

2.3.4 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)公式的求解

當(dāng)t=0時(shí)，X=X0,P=P0,S=S0求得的方程(4)、(5)和(6)分別為：

(4)

(5)

(6)

選取48 h的發(fā)酵參數(shù)作為試驗(yàn)數(shù)據(jù)，此階段菌體生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期且有衰退趨勢(shì)，符合Logistic方程所描述的模型，用1stOpt軟件對(duì)上述動(dòng)力學(xué)方程采用Levenberg-Marquardt加通用全局優(yōu)化算法，以方程誤差的平方和最小化為目標(biāo)，無需設(shè)置初始值，根據(jù)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)求出模型最優(yōu)參數(shù)估計(jì)值，結(jié)果見表1與表2。

由表1和表2可以看出，0 r/min分批發(fā)酵的參數(shù)估計(jì)值明顯小于100 r/min，進(jìn)一步說明0 r/min分批發(fā)酵比100 r/min分批發(fā)酵的合成GABA多，但生物量低；2種培養(yǎng)的參數(shù)估計(jì)值均不等于0，證實(shí)了菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成之間為部分偶聯(lián)關(guān)系，部分相關(guān)型發(fā)酵過程較復(fù)雜，數(shù)學(xué)模型只能描述其動(dòng)態(tài)趨勢(shì)；對(duì)于以獲得更大GABA產(chǎn)量的菌種培育工作來講，從1-3式可知，通過培養(yǎng)條件和培養(yǎng)工藝的改善，盡可能降低維持系數(shù)ms，獲得更大的u值及更長(zhǎng)um維持時(shí)間，以及更高菌體生物量X，是提高GABA產(chǎn)量的有效手段，因此ms在工業(yè)上要求越小越好，所以100 r/min分批發(fā)酵相對(duì)0 r/min分批發(fā)酵更加耦合動(dòng)力學(xué)模型；通過比較0與100 r/min分批發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)值與模型擬合值，從表3和表4可看出,細(xì)胞的生長(zhǎng)、產(chǎn)物的合成和底物的消耗均能很好地與實(shí)驗(yàn)值吻合，說明該模型均能較好地反映糞腸乳酸球菌在250 mL搖瓶水平上0和100 r/min分批發(fā)酵過程中的生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。

表1 0 r/min分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)估計(jì)值Table 1 Parameter estimation of the shake flask (0 r/min)batch fermentation kinetics model

表2 100 r/min分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)估計(jì)值Table 2 Parameter estimation of the shake flask (100 r/min)batch fermentation kinetics model

表3 0 r/min分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值比較Table 3 The experimental value of zhake flask (0 r/min) fermentation was compared with the predicted value

表4 100 r/min分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值比較Table 4 The experimental value of shake flask(100 r/min) fermentation was compared with the predicted value

表5 試驗(yàn)因素水平表Table 5 Factor level table

2.4 兩階段轉(zhuǎn)速控制策略發(fā)酵條件的優(yōu)化

根據(jù)上述不同轉(zhuǎn)速下(0和100 r/min)GABA發(fā)酵曲線及動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析可知72 h、0 r/min時(shí)產(chǎn)量最高，穩(wěn)定期、100 r/min時(shí)生物量最高；結(jié)合不同轉(zhuǎn)速下發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的理論驗(yàn)證，證實(shí)了菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成之間為部分偶聯(lián)關(guān)系。現(xiàn)提出兩階段轉(zhuǎn)速調(diào)控策略，并對(duì)影響其的發(fā)酵條件(階段時(shí)間、裝液量及轉(zhuǎn)速)進(jìn)行正交優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)水平，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法[27]，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

由表6正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析可知，3個(gè)因素影響糞腸乳酸球菌發(fā)酵產(chǎn)GABA的主次順序?yàn)锳(階段時(shí)間/h)、B(裝液量/mL)、C(轉(zhuǎn)速/(r/min))。正交試驗(yàn)的最優(yōu)組合為試驗(yàn)3，且從表中可以直觀看出試驗(yàn)3最優(yōu)：裝液量100 mL，在發(fā)酵前期(0～12 h)控制轉(zhuǎn)速150 r/min，發(fā)酵后期(12～72 h)控制轉(zhuǎn)速0 r/min，GABA產(chǎn)量可達(dá)到(6.713±0.135)g/L，比優(yōu)化前(0 r/min和100 r/min分批發(fā)酵)分別提高了12.2%與60.1%。由此可見，該方案穩(wěn)定可行，兩階段轉(zhuǎn)速控制策略可以有效地提高糞腸乳酸球菌合成GABA的能力，對(duì)GABA工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的參考價(jià)值和指導(dǎo)意義。

表6 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 The Orthogonal test result of Shake flask fermentation

3 結(jié)論

本文通過分析不同轉(zhuǎn)速下發(fā)酵曲線和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，基于不同轉(zhuǎn)速發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成的變化，且利用建立的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型驗(yàn)證了菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成之間為部分偶聯(lián)關(guān)系，提出了兩階段轉(zhuǎn)速控制策略，并對(duì)影響此調(diào)控策略的發(fā)酵條件進(jìn)行正交優(yōu)化。結(jié)果表明，裝液量100 mL，在發(fā)酵前期(0～12 h)控制轉(zhuǎn)速150 r/min，發(fā)酵后期(12～72 h)控制轉(zhuǎn)速0 r/min，GABA產(chǎn)量可達(dá)到(6.713±0.135)g/L，比優(yōu)化前(0和100 r/min分批發(fā)酵)分別提高了12.2%與60.1%?；趦呻A段轉(zhuǎn)速控制策略，糞腸乳酸球菌合成GABA的能力顯著提高，為下一步大規(guī)模生產(chǎn)GABA提供了基礎(chǔ)條件和理論依據(jù)。