王遠(yuǎn)山，龔美華，曹成浩，薛亞平

1(生物有機(jī)合成浙江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(浙江工業(yè)大學(xué))，浙江 杭州，310014)2(教育部生物轉(zhuǎn)化與生物凈化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(浙江工業(yè)大學(xué))，浙江 杭州，310014 3(手性生物制造國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心(浙江工業(yè)大學(xué))，浙江 杭州，310014)

脫酰基酶(decetylase,EC 3.5.1.X)是一類能夠催化底物脫去酰胺的水解酶，其中脫乙酰基酶是一類能催化幾丁質(zhì)或蛋白質(zhì)水解脫去乙?；?，形成殼聚糖或脫乙酰基蛋白質(zhì)的水解酶[1-2]。脫?；笍V泛存在于動(dòng)物、植物以及微生物體內(nèi)，被應(yīng)用于?；幕衔锸中圆鸱?，以生產(chǎn)光學(xué)純的醫(yī)藥、臨床、食品等領(lǐng)域的產(chǎn)品或者中間體，工業(yè)應(yīng)用前景廣闊[3-5]。如殼聚糖脫乙?；缚梢杂糜谒饧讱に刂苽錃ぞ酃烟荹6-8]。來(lái)源于鏈霉菌(Streptomycespulverzceus)的棘白霉素B(ECB)脫?；竅9-11]可催化ECB脫酰基獲得棘白霉素B母核。然而，像絕大多數(shù)外源基因一樣，脫乙?；富蛟诖竽c桿菌、酵母菌等表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)時(shí)，易在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成不溶的、無(wú)活性、高密度、無(wú)定形[12]、非水溶性、可溶于變性劑物質(zhì)如尿素、鹽酸胍的包涵體[13]。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)因其無(wú)致病性、遺傳背景清晰、分泌蛋白能力強(qiáng)、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、耐高溫等優(yōu)點(diǎn)，成為異源表達(dá)和分泌外源蛋白的理想宿主[14-16]。目前利用枯草芽孢桿菌表達(dá)脫乙?；傅难芯炕疚匆?jiàn)報(bào)道，因此，可以嘗試?yán)每莶菅挎邨U菌的組成型分泌表達(dá)系統(tǒng)可溶性表達(dá)脫乙酰基酶。

本實(shí)驗(yàn)室已篩選到一個(gè)能夠立體選擇性水解乙酰化氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸的脫乙?；窷AP-Das 2.3，但在E.coli表達(dá)系統(tǒng)中會(huì)形成大量包涵體。為實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[17-20]，將NAP-Das 2.3編碼基因克隆至枯草芽孢桿菌構(gòu)建重組工程菌，優(yōu)化了工程菌的培養(yǎng)及產(chǎn)酶條件，實(shí)現(xiàn)了異源高效可溶性表達(dá)，為脫乙?；傅拈_發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

pP43NMK質(zhì)粒，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送；E.coliJM109和B.subtilisWB800，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要工具酶、試劑和試劑盒

限制性內(nèi)切酶XhoI、BamHI、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、ClonExpress?II一步克隆試劑盒等，Vazyme公司；質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒等，Axygen生物技術(shù)有限公司；DNA Marker、protein Marker、TaqDNA Polymerase、染色劑Gold View等，TaKaRa公司；卡那霉素、氨芐青霉素等，大連寶生物公司；溶菌酶，生工生物工程(上海)有限公司；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

Biometra PCR儀，Biometra公司；SevenMulti pH計(jì)，瑞士Mettler-Toledo；Sorvall Lynx 4 000高速冷凍離心機(jī)，Thermo Scientific公司；5 L全自動(dòng)發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；Mini-Protean II型電泳儀、GelDoc凝膠成像儀，Bio-Rad公司；30 kDa超濾離心管，Millipore公司；BioLogic LP蛋白純化儀，美國(guó)Bio-Rad公司；5417R小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司。MS-100恒溫金屬振蕩反應(yīng)器，杭州奧盛儀器有限公司；NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀，美國(guó)Thermo公司；ExpressPlusTM聚丙烯酰胺蛋白預(yù)制膠，金斯瑞生物科技有限公司；UltiMate3000高效液相色譜，美國(guó)戴安公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 脫乙?；妇幋a基因的獲得及其重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

脫乙?；妇幋a基因nap-das2.3由本實(shí)驗(yàn)室以Arenimonasmalthae的amidohydrolase(GenBank登錄號(hào)WP 043803585.1)為模板合成，克隆至載體pET 28b(+)的限制性酶切位點(diǎn)XhoI和BamHI之間，并將重組質(zhì)粒pET 28b/nap-das2.3轉(zhuǎn)入E.coliBL21，獲得重組菌E.coliBL21/pET 28b/nap-das2.3。將E.coliBL21/pET 28b/nap-das2.3及實(shí)驗(yàn)室保藏的E.coliDH5α/pP43NMK用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pET 28b/nap-das2.3用XhoI、BamHI酶切獲得目的基因片段nap-das2.3。根據(jù)載體pP43NMK上目的基因插入位點(diǎn)兩端的序列及nap-das2.3序列設(shè)計(jì)PCR引物。插入片段擴(kuò)增引物(F1/R1)，上游引物F1：5′-GTAAGAGAGGAATGTACACATGATTAGATGGAGCTTTCAA-3′；下游引物R1：5′-CCTTTCGCCCGTCACTCAAGTGGTTGTTGTTAGAAGAGTA-3′。線性化克隆載體的擴(kuò)增引物(F2/R2)，上游引物F2：5′-CATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGATT-3′；下游引物R2：5′-CCTTTC GCCCGTCACTCAAGTGGTTGTTGTTAGAA-3′。PCR反應(yīng)采用50 μL體系，PCR反應(yīng)條件為：98 ℃、3 min；98 ℃、10 s；65 ℃、15 s；72 ℃、20 s，30個(gè)循環(huán)；71 ℃、10 min，隨后用DpnI消化10 min降解擴(kuò)增模板后置于65 ℃加熱20 min使DpnI失活。線性化克隆載體直接用于連接，目的基因擴(kuò)增片段經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒清洗之后用于連接?；厥蘸蟮哪康幕蚱魏途€性載體的濃度用NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定后，用ClonExpress?II一步克隆試劑盒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109，轉(zhuǎn)化液涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上37 ℃恒溫培養(yǎng)10～12 h，挑取轉(zhuǎn)化子用菌落PCR法鑒定并送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子pP43NMK/nap-das2.3。

1.2.2 重組工程菌株的構(gòu)建和驗(yàn)證

將重組質(zhì)粒pP43NMK/nap-das2.3通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法[21-22]轉(zhuǎn)化B.subtilisWB800感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)20 h左右，挑取轉(zhuǎn)化子，先用溶菌酶將細(xì)胞壁溶解后，再用菌落PCR法擴(kuò)增重組質(zhì)粒序列，PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件同上，產(chǎn)物經(jīng)9 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶大小正確的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的即為陽(yáng)性重組工程菌株B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3。

1.2.3B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3的培養(yǎng)和NAP-Das2.3表達(dá)

挑取LB平板上的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，分別接種于裝有5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，4 ℃、9 000 r/min離心10 min，收集上清液。在50 mL具塞三角反應(yīng)瓶中加入100 mmol/LN-乙酰-草銨膦的磷酸鈉緩沖溶液(100 mmol/L，pH 8.0)1 mL，4 mL磷酸鈉緩沖溶液(100 mmol/L,pH 8.0)，于35 ℃、180 r/min水浴搖床培養(yǎng)0.2 mL發(fā)酵上清液，每隔5 min，取1 mL至已加入10 μL 6 mol/L HCl的1.5 mL EP管中終止反應(yīng),再加6 mol/L NaOH調(diào)回反應(yīng)液pH，在12 000 r/min、4 ℃的條件下離心10 min，取上清反應(yīng)液，過(guò)0.22 μm濾膜，以未加入酶液的平行樣為空白對(duì)照組。200 μL反應(yīng)液與400 μL衍生化試劑在35 ℃反應(yīng)5 min，再加入400 μL超純水至終體積為1 mL，經(jīng)過(guò)0.22 μm孔徑的濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析。35 ℃下每分鐘催化生成1 μmolL-草銨膦所需要的酶量定義為1個(gè)活力單位(U)。發(fā)酵上清液加入等體積2×還原型SDS，沸水浴10 min后，用SDS-PAGE凝膠電泳分析蛋白表達(dá)情況。

生物量(細(xì)胞干重，DCW)測(cè)定：將發(fā)酵液離心去上清后，經(jīng)磷酸鈉緩沖溶液(100 mmol/L,pH 8.0)洗滌2次后收集菌體，置于烘箱中，80 ℃烘至恒重。

1.2.4 搖瓶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

保持種子活化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件不變(LB培養(yǎng)基、37 ℃、150 r/min培養(yǎng)10～12 h)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及產(chǎn)酶條件進(jìn)行考察，進(jìn)行單因子搖瓶?jī)?yōu)化實(shí)驗(yàn)，主要包括：不同碳氮源種類及濃度、磷酸鹽、金屬離子、初始培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)溫度對(duì)重組脫乙酰基酶的產(chǎn)酶情況及菌體生長(zhǎng)的影響。

1.2.5 5 L發(fā)酵罐中菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶情況

搖瓶發(fā)酵最優(yōu)條件確定后，在5 L發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大，種子液接種量2%(V/V)，優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基3 L，培養(yǎng)溫度37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量0.5 VVM，自然pH，連接pH電極及溶氧(DO)電極，每隔2.5 h取樣測(cè)定發(fā)酵液pH、菌體濃度和酶活力等參數(shù)。

1.3 分析方法

L-草銨膦的檢測(cè)：SinoPak-C18(4.6 mm×200 mm，5 μm，伊力特)色譜柱；高效液相色譜儀Dionex UltiMate 3 000；V(甲醇)∶V(0.05 mol/L乙酸銨溶液)=10∶90(pH 5.7)，流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm；柱溫35 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。

衍生化試劑的配制：分別準(zhǔn)確稱取0.1 g鄰苯二甲醛和0.12 gN-乙?；?L-半胱氨酸，用10 mL無(wú)水乙醇充分溶解，隨后用硼酸緩沖液(pH 9.8)定容至終體積50 mL，置于冰箱中4 ℃避光保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫乙酰基酶基因的獲得及其重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

2.1.1 線性化擴(kuò)增載體及目的基因片段的克隆

經(jīng)分別帶有載體末端序列的引物F1/R1及帶有目的基因末端序列的引物F2/R2擴(kuò)增后，得到8 000 bp線性化載體和1 299 bp目的片段。

2.1.2 重組質(zhì)粒pP43NMK/nap-das2.3構(gòu)建和鑒定

目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Clean up清洗試劑盒純化后與線性化載體擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)量濃度后，計(jì)算用量，在一步克隆試劑盒反應(yīng)體系中，相互連接，并轉(zhuǎn)化E.coliJM109，技術(shù)路線見(jiàn)圖2。菌落PCR呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。連接產(chǎn)物序列正確的菌株提取質(zhì)粒待用。

圖2 重組質(zhì)粒pP43NMK/nap-das2.3的構(gòu)建過(guò)程Fig.2 Construction of the recombinant plasmid pP43NMK/nap-das2.3

2.2 重組菌株的構(gòu)建和菌落PCR鑒定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到B.subtilisWB800感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化液涂布于50 μg/mL卡那霉素LB平板，隨機(jī)挑取單菌落提取質(zhì)粒，以F2/R2為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。菌落PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在8 000～12 000 bp之間有明亮的特異性條帶，與預(yù)期的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒大小吻合。

2.3 重組菌株的SDS-PAGE分析

挑取4個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)30 h，培養(yǎng)液經(jīng)9 000 r/min，4 ℃離心10 min，離心收集上清液。將全細(xì)胞培養(yǎng)液及離心上清液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。根據(jù)氨基酸序列推算出NAP-Das2.3理論分子量是48.5 kDa。全細(xì)胞培養(yǎng)液和離心上清液，均出現(xiàn)了分子量約50 kDa的蛋白質(zhì)條帶，與預(yù)期的目的蛋白質(zhì)大小相符，證明重組NAP-Das2.3的枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功，NAP-Das2.3成功表達(dá)。

M1,M2-marker；1,2-B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3發(fā)酵液；3,4-發(fā)酵上清液圖3 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE of the culture broth and supernatant of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

2.4 重組菌的酶活力的測(cè)定

經(jīng)檢測(cè)，重組菌B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3能夠可溶性表達(dá)NAP-Das2.3，但活力較低，發(fā)酵上清液中脫乙?；富盍?.25 U/L。由于NAP-Das2.3搖瓶發(fā)酵表達(dá)量及酶活較低，進(jìn)一步對(duì)菌體培養(yǎng)及產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化以提高表達(dá)量。

2.5 重組菌搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.5.1 碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

考察了不同有機(jī)碳源(葡萄糖、糊精、甘油、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、乳糖、D-果糖)和最優(yōu)碳源質(zhì)量濃度對(duì)重組菌B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響。由圖4-a可知，甘油和乳糖促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)酶，發(fā)酵液中NAP-Das2.3的相對(duì)酶活分別為18.68和18.45 U/L，與對(duì)照組(不添加碳源，比酶活為15.21 U/L)相比，酶活分別提高了22.81%和21.32%，因此選擇甘油作為最優(yōu)碳源。這與CHOU等[23]報(bào)道的添加甘油有利于降低包涵體并提高E.coli周質(zhì)青霉素G?；副磉_(dá)量一致。

雖然D-果糖、葡萄糖、糊精對(duì)菌體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用較大，但添加可溶性淀粉、D-果糖、山梨醇、麥芽糖、糊精和蔗糖不利于NAP-Das2.3的表達(dá)。由圖4-b可知，當(dāng)甘油質(zhì)量濃度為6 g/L時(shí)，發(fā)酵液中的NAP-Das2.3酶活達(dá)最高，為28.53 U/L，繼續(xù)增加甘油，生物量有所增大，但對(duì)NAP-Das2.3表達(dá)有抑制作用。故選擇甘油的濃度為6 g/L作為菌株后續(xù)優(yōu)化培養(yǎng)的碳源濃度。

圖4 碳源對(duì)B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of carbon sources on growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

2.5.2 氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

考察了14種有機(jī)氮源及其組合(豆粕、酵母膏、玉米粉、牛肉膏、花生粉、黃豆餅粉、蛋白胨、酵母浸出汁、酵母提取物、麩皮、麥芽浸汁、牛肉膏和蛋白胨、牛肉膏和酵母粉、蛋白胨和酵母粉)和無(wú)機(jī)氮源((NH4)2SO4、NH4H2PO4、NH4Cl、CH3COONH4、HCOONH4、NaNO2、NaNO3、尿素)以及最適氮源質(zhì)量濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響。由圖5-a可知，10 g/L牛肉膏、麥芽浸汁、黃豆餅粉、玉米粉添加后，NAP-Das2.3活力均有顯著提高。而且添加10 g/L牛肉膏和麥芽浸膏后，發(fā)酵液中分泌的粗酶液酶活與對(duì)照組相比分別提高了123.23%和115.07%。但組合氮源對(duì)重組菌產(chǎn)酶影響不顯著，花生粉、豆粕、麩皮的加入反而抑制產(chǎn)酶。

圖5 氮源對(duì)B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of nitrogen sources on growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

相比有機(jī)氮源，所測(cè)試的所有無(wú)機(jī)氮源都不利于菌體生長(zhǎng)，對(duì)外源蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著促進(jìn)作用，并且添加(NH4)2SO4、NH4Cl、CH3COONH4、NaNO2、HCOONH4、尿素等無(wú)機(jī)氮源不利于NAP-Das2.3的表達(dá)，結(jié)果如圖5-b。當(dāng)牛肉膏以30 g/L(質(zhì)量濃度)添加時(shí)，菌體生長(zhǎng)及蛋白表達(dá)量均達(dá)最高值，為2.75 DCW g/L和63.22 U/L，結(jié)果如圖5-c所示。

2.5.3 磷酸鹽對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

在上述優(yōu)化后的碳源和氮源的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了NH4H2PO4、NaH2PO4、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4五種磷酸鹽對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響，磷酸鹽的總添加量為10.0 g/L。由圖6所示，測(cè)試的磷酸鹽對(duì)產(chǎn)酶沒(méi)有顯著促進(jìn)作用，而且NaH2PO4對(duì)重組菌產(chǎn)酶還有抑制，所以培養(yǎng)基中不需要額外添加磷酸鹽。

圖6 不同磷酸鹽對(duì)B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of phosphorus sources on growth and NAP- Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

2.5.4 金屬離子對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

考察了13種金屬離子(Co2+、Mg2+、Fe2+、Ni2+、Ba2+、Li+、Zn2+、Mn2+、Sn2+、Ca2+、Fe3+、Cu2+、Cu+)的氯化鹽(2 mmol/L)和表面活性劑EDTA對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響。如表1所示，金屬離子Fe2+、Li+、Ca2+、Cu+、Cu2+等加入均抑制菌體生長(zhǎng)，對(duì)菌體有顯著毒害，其中EDTA對(duì)菌體抑制相對(duì)較小，但所有金屬離子對(duì)產(chǎn)酶沒(méi)有顯著影響(86.88%～107.10%)，所以培養(yǎng)基中不需要添加金屬離子及EDTA。

2.5.5 初始培養(yǎng)基pH對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

如圖7所示，研究了發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH(pH 5.0～9.5)對(duì)B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響。初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響，但對(duì)菌株產(chǎn)酶影響較為明顯。當(dāng)pH<6.5時(shí)，重組酶活力較低，初始pH在6.5～8.0，NAP-Das2.3活力較高，在pH 7.5時(shí)菌株的酶活力達(dá)到最高，為68.21 U/L。pH繼續(xù)增大時(shí)，酶活力下降趨勢(shì)明顯，因此選擇pH 7.5作為培養(yǎng)該菌株時(shí)的培養(yǎng)基初始pH。

表1 不同金屬離子及EDTA對(duì)B.subtilis WB800/ pP43NMK/nap-das2.3生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響Table 1 Effect of different metal ions and EDTA on growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/ pP43NMK/nap-das2.3

圖7 初始pH對(duì)B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of initial pH on growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

2.5.6 培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

在最適碳氮源及其最適濃度，以及最適培養(yǎng)初始pH條件下，進(jìn)一步研究了培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和NAP-Das2.3酶活力的影響。選擇20、25、28、30、35、37、40、45 ℃進(jìn)行考察，結(jié)果如圖8所示，溫度低于25 ℃時(shí)，不利于菌株的生長(zhǎng)和NAP-Das2.3的表達(dá)，溫度在28～37 ℃范圍內(nèi)，菌體生長(zhǎng)良好且酶活力隨著溫度的升高而大幅度增大，菌株在37 ℃條件下生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，且此時(shí)酶活力最高，發(fā)酵液中酶活力達(dá)106.42 U/L。溫度進(jìn)一步升高，酶活及菌體濃度降低，因此選擇培養(yǎng)溫度為37 ℃進(jìn)行菌體培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酶。

圖8 培養(yǎng)溫度對(duì)B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of temperature on growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3

2.6 5 L發(fā)酵罐中重組菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶情況

將保藏的B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3活化后接種500 mL搖瓶，37 ℃培養(yǎng)12 h作為發(fā)酵種子液，以2%接種量轉(zhuǎn)接至3 L優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，37 ℃，200 r/min，通氣量為0.5 VVM，自然pH，用pH電極及溶氧(DO)電極檢測(cè)發(fā)酵液的pH和溶氧，定時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液的pH、菌體濃度并測(cè)定酶活力等參數(shù),結(jié)果如圖9所示。

圖9 5 L發(fā)酵罐中B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶曲線Fig.9 Time course of cell growth and NAP-Das2.3 expression of B.subtilis WB800/pP43NMK/nap-das2.3 in 5 L bioreactor

在菌體培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)體系pH隨培養(yǎng)時(shí)間的增加先略微下降再逐漸升高，這可能因?yàn)樵谇捌诰w生長(zhǎng)過(guò)快，導(dǎo)致溶氧不足發(fā)生厭氧呼吸產(chǎn)生酸導(dǎo)致pH下降，后期隨著氮源的利用，釋放出氨及菌體自溶導(dǎo)致pH上升。發(fā)酵菌體生長(zhǎng)在22.5 h后開始穩(wěn)定產(chǎn)酶，此時(shí)菌體生長(zhǎng)處在穩(wěn)定中后期，說(shuō)明NAP-Das2.3主要是在穩(wěn)定中后期完成加工成熟。培養(yǎng)至25 h時(shí)，酶活力達(dá)到最大116.13 U/L并穩(wěn)定不變，而生物量在培養(yǎng)至27.5 h時(shí)達(dá)最大5.63 g/L，之后菌株進(jìn)入衰亡期開始裂解，生物量和比酶活開始下降。

目前，利用基因工程手段對(duì)脫?；高M(jìn)行異源重組表達(dá)的報(bào)道較多。如舒群峰等[24]將黏質(zhì)沙雷氏菌SerratiamarcescensY213來(lái)源的SmargE基因編碼的N-乙酰鳥氨酸脫乙?；冈贚-鳥氨酸生產(chǎn)菌株CorynebacteriumcrenatumSYPO-1中過(guò)量表達(dá)，顯著提高了酶活力，重組菌在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵96 h，L-鳥氨酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了33.2%，但該酶是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，對(duì)脫乙酰基酶催化的脫乙?；磻?yīng)而言，胞外可溶性表達(dá)可以減少酶的分離純化步驟，有利于酶的固定化等，使用酶蛋白進(jìn)行催化也可以減少副產(chǎn)物的形成。WANG等[25]將來(lái)自Aspergillusnidulans的幾丁質(zhì)脫乙?；富虍愒幢磉_(dá)于EscherichiacoliBL21，經(jīng)誘導(dǎo)后的酶活為4.17 U/mg，但是該酶以包涵體形式表達(dá)。而本研究利用枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了脫乙?；窷AP-Das2.3的分泌型可溶性表達(dá)，這與KANG等[26]將來(lái)自Colletotrichumlindemuthianum的幾丁質(zhì)脫乙?；富诋叧嘟湍?Pichiapastoris)GS115中異源分泌表達(dá)一樣，有助于脫乙?；傅募兓?、固定化及應(yīng)用。

3 結(jié)論

本文將具有立體選擇性的脫乙?；富蚩寺≈量莶菅挎邨U菌受體細(xì)胞中，構(gòu)建了重組菌B.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3，并成功實(shí)現(xiàn)胞外分泌。進(jìn)一步對(duì)重組菌培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，在此條件下，重組蛋白的表達(dá)水平由最初的0.25 U/L提高至106.42 U/L，優(yōu)化后酶活提高了424.68倍。在5 L發(fā)酵罐中用優(yōu)化的培養(yǎng)基培養(yǎng)30 h后，NAP-Das2.3活力達(dá)到116.13 U/L，較初始條件，酶活提高了463.52倍。

本研究構(gòu)建了能夠可溶性表達(dá)草銨膦特異性脫乙?；傅幕蚬こ叹鶥.subtilisWB800/pP43NMK/nap-das2.3，一定程度上解決了脫乙?；父咝М愒幢磉_(dá)形成包涵體及表達(dá)量低的問(wèn)題，且能直接組成型分泌表達(dá)脫乙?；赣诎l(fā)酵液中，為重組酶的分離純化帶來(lái)便利。綜上所述，本研究實(shí)現(xiàn)了重組脫乙?；傅母咝Э扇苄员磉_(dá)，為其在L-草銨膦合成應(yīng)用中提供了基礎(chǔ)，也為其他脫乙酰基酶的開發(fā)提供了借鑒。