徐 姍，胡 楠

1)南京醫(yī)科大學附屬常州第二人民醫(yī)院藥學部江蘇常州213000 2)常州市第一人民醫(yī)院藥劑科江蘇常州213000

心肌缺血再灌注損傷是指冠狀動脈阻塞后在一定時間又重新恢復血流時，缺血心肌雖恢復正常灌注，但組織損傷加重的病理過程。心肌缺血再灌注損傷往往造成心肌超微結(jié)構破壞、心功能障礙等，甚至可發(fā)生嚴重的心律失常而導致猝死［1］。目前普遍認為心肌缺血再灌注損傷的主要機制是氧化應激和炎癥反應［2］。其中，活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成過多以及清除不足是發(fā)生氧化應激反應的主要因素［3］。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過調(diào)控多種細胞因子、趨化因子、生長因子等的表達引起炎癥反應。而Toll樣受體4(toll-like receptor-4，TLR-4)作用于 NF-κB的上游調(diào)控因子，能夠激活NF-κB引起一系列炎癥反應，導致心肌細胞損傷及凋亡。鐵皮石斛多糖具有良好的抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用［4］。本實驗通過構建心肌細胞缺氧/復氧損傷模型模擬在體心肌缺血再灌注損傷，并以不同質(zhì)量濃度的鐵皮石斛多糖干預細胞，觀察細胞存活率、凋亡率、NF-κB p65及TLR-4蛋白表達的變化，旨在進一步探究鐵皮石斛多糖對心肌缺血再灌注損傷保護作用的機制。

1 材料與方法

1．1 細胞及試劑 H9c2大鼠心肌細胞(中國科學院上海生命科學學院研究所細胞資源中心);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國HyClone公司);胰蛋白酶(杭州四季青生物工程有限公司);鐵皮石斛多糖標準品(珍貴瀕危藥材湖南省工程研究中心，純度≥98%)，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基溶解鐵皮石斛多糖，制成不同質(zhì)量濃度的鐵皮石斛多糖溶液;MTT試劑(美國Sigma公司);MDA、ROS、LDH檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(大連寶生物工程有限公司);RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(蘇州新賽美生物科技有限公司);NF-κB p65、TLR-4抗體(美國 Abcam 公司);β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1．2 H9c2細胞培養(yǎng) 將H9c2細胞置于體積分數(shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀態(tài)，每隔1 d更換1次新鮮的培養(yǎng)基，待細胞生長至80% ～90%融合時，用2．5 g/L的胰蛋白酶進行傳代。每3～4 d傳代1次，取對數(shù)生長期的H9c2細胞進行后續(xù)實驗。

1．3 H9c2細胞分組和處理 將處于對數(shù)生長期的H9c2細胞分為5組:正常對照(Con)組、缺氧/復氧(H/R)組、缺氧/復氧+鐵皮石斛多糖低質(zhì)量濃度(H/R+LDP)組、缺氧/復氧+鐵皮石斛多糖中質(zhì)量濃度(H/R+MDP)組、缺氧/復氧+鐵皮石斛多糖高質(zhì)量濃度(H/R+HDP)組。Con組H9c2細胞用正常培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)在體積分數(shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。H/R組H9c2細胞置無血清、無糖、N2預處理缺氧的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、含體積分數(shù)95%N2、5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)3 h，換成正常培養(yǎng)基，置體積分數(shù)5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中復氧培養(yǎng)3 h。H/R+LDP組、H/R+MDP組、H/R+HDP組分別用0．1、0．2、0．4 μg/L 鐵皮石斛多糖預處理 H9c2 細胞30 min，然后行H/R處理(同H/R組)。

1．4 M TT法檢測H9c2細胞存活率 將H9c2細胞接種于96孔板中，每孔5×103個細胞，然后置37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照1．3方法分組和處理后，分別加入100μL MTT，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，去上清，再加入100μL二甲基亞砜，于振蕩儀上反應10 min，待結(jié)晶紫完全溶解后，在酶標儀上檢測490 nm處光密度(OD)值，以不含細胞的培養(yǎng)基作為空白組。細胞存活率=(實驗組OD值/空白組OD值)×100%。實驗重復3次。

1．5 H9c2細胞中MDA含量、ROS水平和上清液中LDH含量檢測 H9c2細胞按照1．3方法分組和處理后，分別收集細胞和細胞培養(yǎng)上清液，參照MDA、LDH、ROS檢測試劑盒說明書測定細胞中MDA含量和ROS水平以及培養(yǎng)上清液中LDH含量。實驗重復3次。

1．6 H9c2細胞凋亡率的檢測 H9c2細胞按照1．3方法分組和處理后，收集各組細胞，PBS洗滌2次，離心去上清，Binding Buffer重懸細胞，依次加入Annexin Ⅴ-FITC 5 μL、PI5 μL，輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1．7 W estern blot檢測 H9c2 細胞中 NF-κB p65和TLR-4蛋白表達水平 H9c2細胞按照1．3方法分組和處理后，收集各組細胞，分別加入RIPA裂解液提取細胞中總蛋白。通過BCA法檢測蛋白濃度。取40μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后以半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜置50 g/L脫脂奶粉封閉液中封閉2 h。依次加入一抗(NF-κB p65、TLR-4一抗均按1∶500稀釋)4℃過夜孵育。TBST洗膜后加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h。TBST洗膜后加入超敏ECL化學發(fā)光液，靜置5 min。采用凝膠成像系統(tǒng)成像拍照，Image J軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與βactin條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1．8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21．0進行數(shù)據(jù)分析。5組間細胞存活率、MDA含量、ROS水平、培養(yǎng)上清液中LDH含量、凋亡率、NF-κB p65和 TLR-4蛋白相對表達量的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 各組細胞存活率比較 與Con組比較，H/R組細胞存活率降低;與H/R組比較，H/R+MDP組、H/R+HDP組細胞存活率升高。見表1。

2．2 各組細胞中MDA含量、ROS水平及上清液中LDH含量比較 與Con組比較，H/R組細胞中MDA含量、ROS水平及上清液中LDH含量升高;與H/R組比較，不同質(zhì)量濃度的鐵皮石斛多糖預處理組細胞中MDA含量、ROS水平及培養(yǎng)上清液中LDH含量均降低。見表1。

表1 各組細胞存活率、細胞中MDA含量和ROS水平及上清液中LDH含量比較

2．3 各組細胞凋亡率比較 與Con組比較，H/R組細胞凋亡率升高;與H/R組比較，不同質(zhì)量濃度的鐵皮石斛多糖預處理組細胞凋亡率降低。見表2。

2．4 各組細胞 NF-κB p65、TLR-4蛋白表達的比較 結(jié)果見圖1和表2。與Con組比較，H/R組細胞中NF-κB p65和TLR-4蛋白表達水平升高;與H/R組比較，H/R+MDP組和H/R+HDP組細胞中NF-κB p65蛋白表達水平降低;與H/R組比較，不同質(zhì)量濃度的鐵皮石斛多糖預處理組H9c2細胞中TLR-4蛋白表達水平降低。

表2 各組細胞凋亡率及NF-κB p65和TLR-4蛋白相對表達量比較

圖1 各組細胞中NF-κB p65和TLR-4蛋白的表達

3 討論

缺血性心臟病具有較高的發(fā)病率和病死率，目前已成為世界公共衛(wèi)生健康問題。其治療手段是心肌缺血后再恢復血流灌注，然而，再灌注往往達不到預期效果，甚至加重心肌細胞壞死及組織損傷［5］。因此如何防治心肌缺血再灌注損傷成為臨床上治療缺血性心臟病不可忽視的問題。研究［6-7］表明中藥在預防心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。鐵皮石斛多糖是傳統(tǒng)珍貴中藥鐵皮石斛中的有效活性成分，具有廣泛的抗氧化、抗衰老、抗炎等生理活性。

本實驗結(jié)果顯示，與Con組比較，H/R組H9c2細胞在缺氧/復氧損傷后，細胞存活率降低，細胞中MDA含量及ROS水平均顯著升高，細胞外LDH漏出量增多，且細胞凋亡增多，提示成功構建了心肌細胞缺氧/復氧模型。以往研究［8］顯示，鐵皮石斛多糖可呈劑量依賴性降低高糖誘導的Müller細胞凋亡，提高細胞活力。結(jié)合以往實驗研究［9］及預實驗結(jié)果，本實驗選取0．1、0．2、0．4 μg/L 的鐵皮石斛多糖預處理H9c2細胞，結(jié)果顯示，與H/R組比較，鐵皮石斛多糖預處理組細胞存活率升高，細胞中MDA含量及ROS水平均明顯降低，培養(yǎng)上清液中LDH含量降低，細胞凋亡率降低。表明鐵皮石斛多糖能夠?qū)θ毖?復氧的H9c2細胞起到較好的保護作用，其作用機制與減少細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生及清除ROS有關，這與以往研究［10］結(jié)果一致。大量研究［11-14］表明，心肌缺血再灌注損傷過程中可產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)及趨化因子，包括 NF-κB和 TLR-4。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)缺氧/復氧處理后，H9c2細胞中NF-κB p65和TLR-4的表達水平顯著升高;而不同質(zhì)量濃度的鐵皮石斛多糖預處理后，細胞中NF-κB p65和TLR-4的表達水平明顯降低。提示鐵皮石斛多糖通過降低NF-κB p65和TLR-4的表達抑制H9c2細胞損傷和凋亡。

綜上，鐵皮石斛多糖對H9c2細胞缺氧/復氧損傷具有保護作用，其作用機制可能與清除細胞內(nèi)ROS、降低細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物、抑制TLR-4/NF-κB信號通路有關。本研究結(jié)果進一步證實了鐵皮石斛多糖對心肌缺血再灌注損傷的保護作用，為鐵皮石斛多糖在缺血性心臟病的臨床應用提供了實驗依據(jù)。