張瑞濤，史惠蓉，劉哲穎，張微微，姬鵬程，王文文

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科鄭州450052

微小RNA(microRNAs，miRNAs)突變和異常表達(dá)與多種人體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，miRNAs可作為癌基因或抑癌基因在腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用［1］。研究［2-3］表明，在胃癌和結(jié)直腸癌組織中miR-338-3p的表達(dá)水平明顯低于相應(yīng)的正常組織，miR-338-3p可能與胃癌和結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良相關(guān)。目前，有關(guān)miR-338-3p在卵巢上皮性癌組織中表達(dá)的報道較少，本研究采用qRTPCR技術(shù)檢測miR-338-3p在正常卵巢、良性卵巢上皮性腫瘤及卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與卵巢癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，探討其臨床意義。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本來源 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科2012年10月至2015年10月隨訪資料完整的105例手術(shù)新鮮卵巢組織標(biāo)本，其中正常卵巢組織20例，年齡32～69 歲，BMI為20．23 ～31．45 kg/m2;良性卵巢上皮性腫瘤組織20例(漿液性囊腺瘤16例，黏液性囊腺瘤4例)，年齡30～72歲，BMI為21．19～32．28 kg/m2;卵巢上皮性癌組織65例，年齡28～76歲，BMI為20．48 ～35．46 kg/m2。3 組患者的年齡、BMI等一般資料均衡。本研究獲得患者或家屬知情同意，并經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院道德倫理委員會批準(zhǔn)。入組卵巢上皮性癌患者中位年齡50歲。早期(Ⅰ～Ⅱ期)患者12例，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)患者53例;臨床分期(FIGO 2014):Ⅰ期8例，Ⅱ期4例，Ⅲ期48例，Ⅳ期5例;組織分化:高分化38例，低分化27例;組織類型:漿液性癌52例，黏液性癌13例;有腹水49例，無腹水16例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例。卵巢上皮性癌患者術(shù)后依據(jù)臨床分期均接受規(guī)范化療(多西他賽聯(lián)合順鉑或卡鉑)3～6個療程，耐藥或復(fù)發(fā)患者采用二線化療藥物(多西他賽、吉西他濱、依托泊苷、脂質(zhì)體、阿霉素、奧沙利鉑等)單藥或聯(lián)合化療。

1．2 主要試劑 Trizol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，Taqman miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品，Revert aid first strand cDNA合成試劑盒為加拿大Fermentas公司產(chǎn)品，SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司。

1．3 m iR-338-3p的qRT-PCR檢測 Trizol提取組織總RNA，純化后以分光光度計定量，取2μg總RNA，參照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物參照SYBR Green熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行PCR反應(yīng)，以U6為內(nèi)參。PCR所用引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1，PCR反應(yīng)體系為:SYBR Premix EX TaqTMⅡ10 μL、上下游引物各 0．8 μL、ROX Reference Dye 0．4 μL、cDNA 模板 2 μL、ddH2O 6 μL，總體積 20 μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s，60℃退火60 s，共40個循環(huán)。實驗重復(fù)3次，相對表達(dá)量采用 2－ΔΔCt計算。

表1 引物序列

1．4 生存分析 隨訪截至2018年2月底。入組65例卵巢癌患者隨訪時間為16～61個月，中位隨訪時間38個月，研究分析的終點事件分別為死亡和無進(jìn)展生存。死亡時間定義為隨訪開始至因腫瘤原因而引起死亡的時間;無進(jìn)展生存時間定義為隨訪開始至因腫瘤原因引起的進(jìn)展或復(fù)發(fā)時間。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用 SPSS 21．0和 GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖，miR-338-3p在不同卵巢組織中表達(dá)的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗;以卵巢上皮性癌組織中miR-338-3p表達(dá)水平的中位數(shù)為依據(jù)，高于中位數(shù)的為高表達(dá)，低于中位數(shù)的為低表達(dá)。miR-338-3p表達(dá)與卵巢上皮性癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗分析miR-338-3p表達(dá)對卵巢癌患者生存的影響，檢驗水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 不同卵巢組織中m iR-338-3p的表達(dá) 卵巢上皮性癌組織中miR-338-3p的表達(dá)明顯低于正常卵巢組織和良性卵巢上皮性腫瘤組織，見表2。

表2 不同卵巢組織中m iR-338-3p的表達(dá)

2．2 卵巢上皮性癌組織中m iR-338-3p表達(dá)與病床臨床病理參數(shù)的關(guān)系 臨床分期越晚、組織分化高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢上皮性癌組織中miR-338-3p的表達(dá)較低(表3)。

2．3 Kap lan-M eier生存分析 miR-338-3p低表達(dá)卵巢上皮性癌患者的總體生存率、無進(jìn)展生存期均短于 miR-338-3p高表達(dá)患者(χ2=5．348 和 4．347，P=0．021 和0．037)，見圖1、2。

表3 卵巢上皮性癌組織中m iR-338-3p表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 例(%)

圖2 不同m iR-338-3p表達(dá)的卵巢上皮性癌患者無進(jìn)展生存曲線比較

3 討論

卵巢癌是發(fā)病率及病死率較高的婦科惡性腫瘤，是威脅女性生殖健康的重要疾病之一，大部分卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時臨床期別較晚，盆腹腔存在癌灶廣泛侵犯和轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致患者治療效果不佳和預(yù)后較差的重要原因之一。

miRNAs是一種內(nèi)源性非編碼小RNA，在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成、腫瘤細(xì)胞微環(huán)境等惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)過程關(guān)系密切，參與包括卵巢癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性過程，可作為惡性腫瘤治療的潛在靶點［4-7］。研究［8-13］表明，在胃癌、非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤細(xì)胞中，miR-338-3p可以抑制上述腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移;增加腫瘤細(xì)胞中miR-338-3p的表達(dá)水平，可逆轉(zhuǎn)上述腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，提示miR-338-3p在上述惡性腫瘤細(xì)胞中扮演抑癌基因的角色。

本研究結(jié)果顯示與正常卵巢組織和卵巢良性上皮性腫瘤相比，卵巢上皮性癌組織中miR-338-3p表達(dá)明顯降低，臨床分期越晚，miR-338-3p表達(dá)越低，提示miR-338-3p異常低表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。進(jìn)一步分析顯示，miR-338-3p低表達(dá)患者的總體生存率和無進(jìn)展生存期明顯縮短，提示miR-338-3p低表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后不良相關(guān)，miR-338-3p可作為卵巢癌預(yù)后和復(fù)發(fā)的標(biāo)記物。

綜上所述，卵巢上皮性癌組織中存在miR-338-3p低表達(dá)，且與患者的預(yù)后不良相關(guān)，可作為卵巢癌預(yù)后和復(fù)發(fā)的標(biāo)記物。在此基礎(chǔ)上深入研究卵巢癌細(xì)胞中miR-338-3p靶向調(diào)控腫瘤相關(guān)基因，參與卵巢癌發(fā)病的分子機(jī)制，可為臨床探尋新的有效治療卵巢癌的分子靶點，也可為卵巢癌的精準(zhǔn)治療提供新的方向。