紀(jì) 藝，姜媛媛，汪小福，徐曉麗，徐俊鋒，李玥瑩，陳笑蕓，*

(1.沈陽(yáng)師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌)，浙江 杭州 310021)

肉和肉制品是人類生活的重要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。近年來(lái)，隨著食品工業(yè)的迅猛發(fā)展，在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，國(guó)內(nèi)外一些不法分子為牟取暴利，肉制品摻假屢禁不止，引發(fā)人們對(duì)食品安全的恐慌[1-7]。因此，開展食品摻假鑒定是保證食品安全的重要措施。以檢測(cè)DNA為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可定量和自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，已被廣泛用來(lái)鑒定食品中的動(dòng)物源性成分[10-13]。從動(dòng)物肌肉組織中提取高質(zhì)量的DNA，是開展肉制品摻假檢測(cè)和監(jiān)測(cè)工作的前提與基礎(chǔ)。

目前用于提取動(dòng)物肌肉組織DNA的方法有很多，主要包括改良CTAB法、SDS法、異硫氰酸胍法、PVP法及以上述方法為基礎(chǔ)的試劑盒法[14-28]。本研究對(duì)改良CTAB法和常見商品化試劑盒進(jìn)行比較分析，為日常肉制品摻假檢測(cè)提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)對(duì)象

生鮮牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和鴨肉，購(gòu)自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑

CTAB裂解液配方為：1%十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，50 mmol·L-1Tris/HCl(pH 8.0)，0.7 mol·L-1NaCl，10 mmol·L-1EDTA(pH 8.0)；TE緩沖液(pH 8.0)配方為：10 mmol·L-1Tris/HCl(pH 8.0)，1 mmol·L-1EDTA(pH 8.0)；飽和酚:氯仿:異戊醇體積比為25∶24∶1；異丙醇；70%乙醇。Premix Ex Taq(Probe qPCR)預(yù)混液購(gòu)自日本TaKaRa公司，引物和探針由杭州尚亞賽生物科技有限公司合成。

1.3 主要儀器

NanoDrop 2000核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，CFX96熒光定量PCR儀和QX200型數(shù)字PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司，DYCP-31C型核酸電泳儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司，ZF-258全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海嘉鵬科技有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品處理和DNA提取

按照試劑盒說(shuō)明書或方法要求稱取一定量的樣品，用無(wú)菌手術(shù)刀將試驗(yàn)材料切成小塊，先在液氮中將樣品迅速冷凍并研磨成粉末備用。采用改良CTAB法及目前國(guó)內(nèi)外使用較廣泛的7個(gè)動(dòng)物組織DNA提取試劑盒分別對(duì)5個(gè)常見動(dòng)物肌肉組織樣品進(jìn)行DNA提取，每個(gè)動(dòng)物樣品設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。

改良CTAB法參考文獻(xiàn)[28]進(jìn)行，稱取50 mg樣品于2 mL離心管中磨碎，加入600 μL CTAB裂解液充分振蕩混勻，加入等體積的飽和酚-氯仿-異戊醇混合液，充分振蕩30 s，12 000 r·min-1離心3 min后取上清液，加0.8倍體積的異丙醇，輕輕搖動(dòng)30 s，12 000 r·min-1離心4 min后取沉淀，加入500 μL 70%乙醇清洗1次，常溫干燥10～20 min后加入100 μL TE溶液(pH 8.0)溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑盒檢測(cè)共選取7款商品化動(dòng)物組織DNA提取試劑盒，其中國(guó)外品牌3個(gè)(代號(hào)為F1～F3)，4個(gè)國(guó)內(nèi)品牌(代號(hào)為D1～D4)。其中，D1、F1～F3的原理為蛋白酶K法，D2和D3的原理為SDS法，D4是DNA快速萃取法，即從組織中快速分離但不提純DNA，并可立即用于熒光定量PCR反應(yīng)。稱取不同試劑盒所需的動(dòng)物肌肉組織粉末并置于2 mL離心管中，具體操作詳見試劑盒說(shuō)明書。

1.4.2 DNA質(zhì)量和濃度測(cè)定

取1 μL DNA樣品溶液，用NanoDrop 2000進(jìn)行DNA濃度、純度和鹽殘留等指標(biāo)的檢測(cè)。

1.4.3 DNA完整性檢測(cè)

配制1%瓊脂糖凝膠，吸取5 μL提取的鴨DNA樣品溶液與上樣緩沖液混勻后加入上樣孔，120 V電泳20 min后在凝膠成像分析系統(tǒng)拍照留存。

1.4.4 DNA提取物對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的抑制作用

由于目前市面上常用廉價(jià)的鴨肉作為肉制品摻假物，本試驗(yàn)圍繞8種提取方法提取的鴨肌肉組織DNA，檢測(cè)其是否會(huì)抑制PCR反應(yīng)。以鴨肌肉組織DNA為模板，利用TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR體系來(lái)檢測(cè)不同的DNA提取物是否會(huì)抑制鴨IL-2核基因的PCR擴(kuò)增。參考文獻(xiàn)[29]合成引物和探針序列，核基因引物序列上游序列為5′-GGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACA-3′，下游序列為5′-GTGTGTAGAGCTCAAGATCAATCCC-3′，探針序列為FAM-TGGGAACAAGCATGAATGTAAGTGGATGGT-BHQ1。將鴨肌肉組織DNA稀釋至同一濃度后作為模板，再進(jìn)行TaqMan法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板2 μL，2×TaqMan反應(yīng)液12.5 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各2 μL，10μmol·L-1探針0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足到25μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性10 s，58 ℃退火延伸32 s，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)Ct值的變化來(lái)探討不同方法提取的DNA溶液是否會(huì)抑制PCR反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對(duì)生鮮肌肉組織樣品DNA完整性的影響

PCR擴(kuò)增對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求較高。用1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)核酸提取質(zhì)量(圖1)，改良CTAB法、3個(gè)國(guó)外品牌(F1～F3)、3個(gè)國(guó)內(nèi)品牌(D1～D3)均可提純得到條帶相對(duì)單一、高分子量的肌肉組織DNA條帶。與改良CTAB法和F1相比，其他試劑盒法提取的DNA條帶更亮，表明提取的DNA濃度更高。而DNA快速萃取法(D4)提取的DNA無(wú)清晰條帶，表明在DNA提取過(guò)程中已發(fā)生較大程度的降解。

1，改良CTAB組；2～4，F(xiàn)1～F3；5～8，D1～D4。1， CTAB-based group; 2-4， F1-F3; 5-8， D1-D4.圖1 不同方法提取的鴨源性DNA電泳檢測(cè)圖Fig.1 Electrophoresis detection of duck DNA extracted by eight DNA extraction methods

2.2 不同提取方法對(duì)生鮮肌肉組織樣品DNA濃度和純度的影響

采用NanoDrop 2000核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定DNA濃度。鑒于每種方法的初始取樣量不同，因此將濃度均換算為每25 mg樣品所提取的DNA濃度。如表1所示，國(guó)外品牌F1試劑盒的DNA總量最低，與魚加工制品中的結(jié)論一致[30]；改良CTAB法提取的DNA總量高于F1試劑盒；其他方法提取的DNA總量要高于改良CTAB法和F1，且提取平均總量相當(dāng)。

采用NanoDrop 2000測(cè)定所提取DNA的雜質(zhì)去除情況，D260/D280可用來(lái)衡量蛋白質(zhì)的去除情況，D260/D230可用來(lái)衡量鹽分去除情況。如表1所示，DNA快速萃取法獲得的DNA純度最低，所有被檢樣本DNA的D260/D280為1.08～1.45，表明提取的DNA中存在較多的蛋白殘留。對(duì)改良CTAB法而言，牛羊肉肌肉組織中提取核酸的純度較低(1.6

2.3 不同提取方法提取的DNA提取物對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的抑制作用

如圖2所示，不同方法所提取的鴨源性DNA均能用于PCR擴(kuò)增。當(dāng)鴨肌肉組織DNA稀釋至同一濃度后，進(jìn)行TaqMan法實(shí)時(shí)熒光PCR時(shí)，除DNA快速萃取法(D4)外，其他7種方法的Ct值都在26.83～27.30之間(表2)，說(shuō)明這7種方法所提取的DNA質(zhì)量均較好，不影響PCR擴(kuò)增。而DNA快速萃取法的Ct值要比其他7種方法的Ct值大，表明該方法雖然在提取速度上占有優(yōu)勢(shì)，但提取的DNA中可能存在某些PCR抑制因子，能顯著抑制PCR反應(yīng)。

2.4 不同DNA提取方法的比較

表1 不同肉源品種DNA提取的比較

Table1Comparison of DNA extraction from different meat sources

提取方法Extraction methods樣品種類SpeciesD260/D280D260/D230DNA濃度DNA concentration/(ng·μL-1)DNA總量DNA content/μg改良CTAB法鴨肉 Duck1.91±0.010.63±0.01129.6±1.012.96±0.10CTAB-based method牛肉 Beef1.61±0.020.75±0.0153.6±2.05.36±0.20羊肉 Mutton1.66±0.010.53±0.0162.8±1.06.28±0.10雞肉 Chicken1.79±0.010.66±0.01100.1±1.510.01±0.15豬肉 Pork1.78±0.010.77±0.0153.9±1.05.39±0.10F1鴨肉 Duck1.88±0.012.18±0.0118.0±0.71.80±0.07牛肉 Beef1.85±0.011.85±0.026.00±0.20.60±0.02羊肉 Mutton1.81±0.012.02±0.0111.1±1.01.11±0.10雞肉 Chicken1.87±0.012.29±0.0126.9±1.02.69±0.10豬肉 Pork1.85±0.021.94±0.016.6±0.30.66±0.03F2鴨肉 Duck1.98±0.011.99±0.01532.5±5.053.25±0.50牛肉 Beef2.00±0.012.11±0.0118.0±1.01.80±0.10羊肉 Mutton1.94±0.012.11±0.0136.0±1.03.60±0.10雞肉 Chicken2.02±0.012.11±0.02327.7±3.032.77±0.30豬肉 Pork1.90±0.011.97±0.0146.2±1.04.62±0.10F3鴨肉 Duck1.98±0.012.78±0.01416.8±3.041.68±0.30牛肉 Beef2.06±0.012.76±0.0329.4±1.02.94±0.10羊肉 Mutton2.02±0.022.24±0.0183.8±1.08.38±0.10雞肉 Chicken2.10±0.012.19±0.01201.0±3.020.10±0.30豬肉 Pork2.00±0.012.10±0.0181.4±1.08.14±0.10D1鴨肉 Duck2.07±0.012.24±0.01413.8±1.041.38±0.10牛肉 Beef2.02±0.017.22±0.0132.2±1.03.22±0.10羊肉 Mutton2.01±0.013.13±0.01124.7±1.012.47±0.10雞肉 Chicken2.07±0.012.39±0.01208.4±2.120.84±0.21豬肉 Pork1.97±0.012.62±0.0186.0±1.08.60±0.10D2鴨肉 Duck2.02±0.011.58±0.01796.9±3.679.69±0.36牛肉 Beef1.85±0.010.84±0.0146.5±1.04.65±0.10羊肉 Mutton1.97±0.011.28±0.01100.9±3.010.09±0.30雞肉 Chicken2.01±0.011.47±0.01317.4±2.331.74±0.23豬肉 Pork1.95±0.011.17±0.01164.0±1.216.40±0.12D3鴨肉 Duck2.03±0.012.30±0.01560.1±2.356.01±0.23牛肉 Beef2.05±0.012.91±0.0124.6±0.62.46±0.06羊肉 Mutton1.95±0.012.62±0.0182.2±1.08.22±0.10雞肉 Chicken2.07±0.012.40±0.01163.2±1.216.32±0.12豬肉 Pork1.97±0.012.69±0.0185.9±1.08.59±0.10D4鴨肉 Duck1.35±0.030.37±0.01443.0±3.144.30±0.31牛肉 Beef1.08±0.010.14±0.01149.2±1.814.92±0.18羊肉 Mutton1.09±0.061.18±0.01152.2±1.215.22±0.12雞肉 Chicken1.45±0.050.39±0.01466.8±2.946.68±0.29豬肉 Pork1.17±0.030.21±0.01259.2±1.625.92±0.16

根據(jù)上述測(cè)定的DNA濃度、D260/D280、D260/D230、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)及PCR擴(kuò)增結(jié)果等數(shù)據(jù)，對(duì)各DNA提取方法進(jìn)行綜合分析。改良CTAB法價(jià)格較低，但起始量要求高，操作煩瑣，耗時(shí)長(zhǎng)(6 h)；F1試劑盒法去除雜質(zhì)、鹽漬效果好，但耗時(shí)長(zhǎng)(6 h)，DNA獲得率低；F2試劑盒法去除雜質(zhì)、鹽漬效果好，但價(jià)格昂貴，耗時(shí)長(zhǎng)(6 h)；F3試劑盒耗時(shí)4 h，但價(jià)格昂貴；D1試劑盒價(jià)格相對(duì)低廉，提取的DNA純度高、鹽殘留少，但操作步驟煩瑣；D2試劑盒提取的DNA純度高，獲得率高，但鹽殘留多，耗時(shí)長(zhǎng)(6 h)；D3試劑盒耗時(shí)較短(4 h)，提取的DNA純度高、鹽殘留少，DNA獲得率高；D4試劑盒操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短(3 h)，但去除雜質(zhì)效果差，純度低，鹽殘留多。

圖2 TaqMan法實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增鴨源性DNA中IL-2核基因的擴(kuò)增曲線Fig.2 The real-time TaqMan PCR for IL-2 detection with the duck-derived genome DNA extracted by the eight methods

表2 八種方法提取鴨源性DNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增IL-2核基因的Ct值

Table2The Ct values of the real-time fluorescent PCR amplification theIL-2 gene with the duck-derived genome DNA extracted by the eight methods

提取方法 Extraction methodsCt改良CTAB法 CTAB-based method27.30±0.02F127.00±0.05F227.26±0.16F326.88±0.04D126.97±0.06D227.10±0.03D326.83±0.07D433.40±0.15

3 討論

食品安全關(guān)系著人類身體健康，是全社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)肉制品摻假屢禁不止，引發(fā)人們對(duì)食品安全的恐慌，也對(duì)食品監(jiān)管部門快速、準(zhǔn)確進(jìn)行動(dòng)物源性成分檢驗(yàn)和鑒定提出了更高的要求。以DNA為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛用來(lái)鑒定食品中的動(dòng)物源性成分，而高質(zhì)量、高純度及結(jié)構(gòu)完整的DNA是影響PCR擴(kuò)增的重要因素。因此，快速、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)的DNA提取方法是PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵[20]。

本研究對(duì)常見的5種常見肉類的肌肉組織進(jìn)行DNA提取，并對(duì)完整性、DNA濃度、純度、鹽殘留和耗時(shí)等指標(biāo)進(jìn)行了對(duì)比。8種提取方法雖然均可用肌肉組織的DNA提取，但每種方法各有利弊。改良CTAB法雖然價(jià)格實(shí)惠且對(duì)PCR擴(kuò)增無(wú)抑制作用，但其操作較為繁瑣，提取時(shí)間長(zhǎng)，且涉及有機(jī)溶劑抽提，對(duì)人體有一定的潛在傷害；DNA快速萃取法耗時(shí)最短，但DNA純度和鹽殘留指標(biāo)最差，且提取的DNA溶液中含抑制PCR的成分，影響熒光定量PCR的擴(kuò)增效率；原理為蛋白酶K法的F1試劑盒雖然去除雜質(zhì)、鹽漬效果較好，但試劑盒耗時(shí)長(zhǎng)，且DNA得率最低，性價(jià)比較低；而基于蛋白酶K法和SDS法的F3和D3試劑盒的耗時(shí)相對(duì)較短，DNA的純度高，鹽殘留少，DNA總量理想，DNA提取液對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的抑制少。

綜上所述，對(duì)常見動(dòng)物肌肉組織而言，基于蛋白酶K法和SDS法的F3和D3試劑盒在試驗(yàn)耗時(shí)、DNA純度和濃度、鹽殘留、對(duì)熒光定量PCR的抑制等方面均優(yōu)于其他試劑盒方法，可優(yōu)先選擇這2種試劑盒進(jìn)行DNA提取。本研究可為食物摻假和物種鑒別工作中DNA提取方法及樣品處理方案提供參考。