姜瑤瑤，李 靜，蔡年俊，陳劍平，張恒木，*

(1.浙江農林大學 林業(yè)與生物技術學院，浙江 杭州 311300； 2.浙江省農業(yè)科學院 病毒學與生物技術研究所，浙江 杭州310021； 3.寧波大學 植物病毒學研究所，浙江 寧波 315211)

植物原纖維蛋白(FBN)又稱為脂類相關質體蛋白，廣泛存在于低等植物藍藻到高等植物的光合器官中[1]。20世紀中葉，科學家們在玫瑰和辣椒等植物細胞的有色體中觀察到不同厚度的線狀或管狀的原纖維[2]，該結構含有豐富的類胡蘿卜素、蛋白質、糖脂和磷脂組分，是有色體中細胞色素積累的主要場所[3]。直到20世紀90年代，科學家們首次從辣椒中分離并克隆出第1個植物FBN基因，研究發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白參與植物有色體原纖維結構的組裝[4]。近期的研究顯示，植物FBN基因除了參與有色體原纖維的形成，還與質體色素的積累、各類脅迫的應答反應有關[5-7]。Rey等[8]在煙草中過量表達辣椒FBN基因后，對其進行干旱和強光處理，發(fā)現(xiàn)其長勢強于對照，且花期提前，表明辣椒FBN基因在脅迫條件下能夠促進植物的生長發(fā)育。但數(shù)十年來，有關本氏煙(Nicotianabenthamiana)FBN基因的研究鮮有報道。為了分析其功能特性，本研究從本氏煙中克隆了一個NbFBN基因，并對其特性進行了初步的分析。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細胞、反轉錄試劑盒First Strand cDNA Synthesis Kit均購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶NdeⅠ和BamHⅠ購自美國Fermantas MBI公司；高純度質粒小提試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；熒光定量PCR所用的SYBR Green Real-time PCR Master Mix購自上海翊圣生物科技有限公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；引物合成與測序由上海鉑尚生物技術有限公司完成。

1.2 RNA提取和cDNA合成

本氏煙在25 ℃、14 h∶10 h(光/暗)條件下培養(yǎng)，取其根、莖、葉和花器官用于組織特異性分析。干旱處理：向營養(yǎng)液中加入適量的PEG 6000固體使其終濃度為5%，同時用ddH2O作為對照；脫落酸(ABA)處理：調節(jié)ABA濃度為100 μmol·L-1，采用噴施處理，然后分別在處理0、12和24 h后采取葉片用于定量分析。取適量植物材料用Trizol試劑(Invitrogen)參照商家說明提取植物材料總RNA。取1 μg總RNA作模板，應用Oligo(dT)18引物，參照First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書合成cDNA。

1.3 NbFBN基因擴增和克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中本氏煙FBN序列(登錄號：XP_016504394.1)，使用DNAMAN軟件設計了引物NbFBN-F(5’-GGAATTCCATATGGCTACCATCTCTTCTCTA-3’)和NbFBN-R(5’-GCGGATCCTTAAGGCTTCAAGAGGGGAC-3’)，以葉片cDNA為模板進行擴增，反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，參照商家說明利用PCR產物切膠純化試劑盒(Promega公司)切膠回收擴增產物。純化的產物連接至pGEM-T-Easy載體，然后轉化大腸埃希菌DH5α，并涂于氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，挑取單克隆進行PCR鑒定，將含預期大小插入片段的克隆送至杭州博尚公司進行測序。

1.4 NbFBN同源性與進化分析

為分析NbFBN蛋白和其他植物FBN的同源性，從NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和擬南芥數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org)中下載了植物FBN基因序列。利用DNAMAN軟件進行多重序列比對，并利用MEGA6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，采用Neighbor-Joining法，bootstrap值設置為1 000。

1.5 定量PCR

利用NbFBN基因的引物對(5’-CTGCTGACAACATACCTGGATGA-3’；5’-TCAACACAAATACACTGCCTCCAT-3’)和本氏煙內參基因UBCE2(登錄號：AB026056.1)引物對(5’-TGGAGGTACATTTAAGCTGACAC-3’；5’-TCACAGAGCAAAGACTGGATTG-3’)，使用上海翊圣生物科技有限公司的SYBR Green Real-time PCR Master Mix在ABI公司(Applied Biosystems)的儀器7900 Real-Time PCR System，按照如下條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，進行定量PCR(qPCR)反應。

2 結果與分析

2.1 本氏煙NbFBN基因的克隆

以提取的本氏煙葉片總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中本氏煙FBN基因序列(基因登錄號：XP_016504394.1)設計引物，RT-PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，得到一條約1 kb的條帶，與預計大小相符(圖1)。經切膠回收純化后，連接到T5-Bzero載體上，然后轉入大腸埃希菌DH5α，測序結果表明，該基因編碼區(qū)長966 bp，可編碼一個分子量大小約為35 ku的蛋白。

1，8 000 bp DNA ladder；2，NbFBN.圖1 NbFBN基因的RT-PCR擴增Fig.1 RT-PCR result of NbFBN gene

2.2 本氏煙NbFBN基因同源性分析

目前，擬南芥FBN基因研究的較多，分類比較明確[9]。為了確定NbFBN的進化地位及其與擬南芥FBN的親緣關系，我們從數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org)中下載了已知的擬南芥FBN基因序列[9]，并采用MEGA6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹(圖2)，結果表明，NbFBN與擬南芥FBN1a、FBN1b聚在一起(圖2)，表明本研究克隆的NbFBN與擬南芥FBN1a、FBN1b親緣關系最近，應同屬于FBN類型I的成員。同源性比對發(fā)現(xiàn)，NbFBN還與番茄(Solanumlycopersicum)、枸杞(Lyciumruthenicum)、甜椒(Capsicumannuum)等植物的FBN基因存在較高的同源性(62.54%～87.20%)，相比之下，該基因的C-端部分(112-321位氨基酸)尤為保守(圖3)。

2.3 NbFBN組織特異性表達分析

為了研究NbFBN基因在不同組織器官中的表達水平，利用定量PCR測定了NbFBN基因在本氏煙的根、莖、葉和花中的表達水平。結果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)NbFBN基因在本氏煙葉片、花中的表達量相對較高，而在根、莖中的表達量較低。

AtFBN4、AtFBN8、AtFBN9、AtFBN5、AtFBN10、AtFBN6、AtFBN3a、AtFBN3b、AtFBN7a、AtFBN7b、AtFBN11、AtFBN2、AtFBN1b、AtFBN1a均來自擬南芥。NbFBN來自本氏煙。AtFBN4， AtFBN8， AtFBN9， AtFBN5， AtFBN10， AtFBN6， AtFBN3a， AtFBN3b， AtFBN7a， AtFBN7b， AtFBN11， AtFBN2， AtFBN1b and AtFBN1a from Arabidopsis thaliana; NbFBN from Nicotiana benthamiana.圖2 NbFBN與擬南芥FBN基因的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic relationship of NbFBN and FBNs from Arabidopsis thaliana

SlFBN(NP_001234183.1，番茄)；LrFBN(AIX87535.1，枸杞)；CaFBN(AIX02791.1，甜椒)；AtFBN1a(AT4G04020，擬南芥)和AtFBN1b(AT4G22240，擬南芥)。SlFBN(NP_001234183.1， Solanum lycopersicum)， LrFBN(AIX87535.1， Lycium ruthenicum)， CaFBN(AIX02791.1， Capsicum annuum)， AtFBN1a(AT4G04020， Arabidopsis thaliana) and AtFBN1b(AT4G22240， Arabidopsis thaliana).圖3 NbFBN與其他植物FBN基因的多重序列比對Fig.3 Multiple alignment of NbFBN and other FBN genes from different plants

*表示與葉片相比在P<0.05水平差異顯著；ns表示與葉片相比差異不顯著。* meant significant difference at the level of P<0.05 compared with leaf. ns meant no significant difference compared with leaf.圖4 本氏煙不同部位NbFBN表達分析Fig.4 Relative expression level of NbFBN in different tissues of Nicotiana benthamiana

*表示與0 h相比在P<0.05水平差異顯著；ns表示與0 h相比差異不顯著。* meant significant difference at the level of P<0.05 compared with 0 h. ns meant no significant difference compared with 0 h.圖5 PEG與ABA處理下NbFBN的表達特性Fig.5 Expression of NbFBN in response to PEG and ABA stresses

2.4 逆境下NbFBN基因的表達模式

為分析逆境條件下NbFBN基因的表達特性，我們分別對本氏煙進行PEG、激素ABA噴施處理，然后采用定量PCR分析了NbFBN基因的表達水平。結果如圖5所示，PEG處理12 h時，NbFBN的表達量未見明顯上升；處理24 h后，表達量顯著上升，約是處理前的7倍；ABA處理12 h后，NbFBN表達量達到最高，處理24 h后NbFBN表達量繼續(xù)維持在較高水平，表明NbFBN受到PEG、ABA的誘導表達，可能參與植物的逆境響應過程，NbFBN的表達水平可能與抗(耐)旱性密切相關。

3 討論

植物原纖維蛋白(FBN)是由核基因組編碼的質體蛋白，與質體原纖維、葉綠體類囊體、光合天線復合物相關。因此，對植物FBN蛋白的研究有助于更好地理解質體結構和功能的機制[10-12]。本氏煙作為一種模式植物，是研究植物與生物、非生物逆境互作的優(yōu)良材料，但我們對其FBN的生物學功能和作用機制知之甚少。不同植物的原纖維蛋白呈現(xiàn)出不同的組織特異性，如在馬鈴薯根、莖、葉中檢測到C40.4(FBN1)轉錄物[13]，其在葉片中最豐富[14]；擬南芥FBN1a主要在葉的葉肉和保衛(wèi)細胞中表達[5]。本研究表明，NbFBN基因與番茄、枸杞、辣椒FBN高度同源，且在本氏煙根、莖、葉、花中均有表達(圖4)；相比之下，NbFBN基因在葉、花中的表達量較高，而在根、莖中的表達量最低，這與擬南芥FBN1a、馬鈴薯C40.4(FBN1)的表達特點相似，支持其同屬于FBN類型Ⅰ的推論，也暗示NbFBN可能與擬南芥FBN1a在質體原纖維形成過程中具有相似的功能。近期的研究還顯示，F(xiàn)BN參與了植物抗逆反應[15-22]，例如，生長素(IAA)延遲了辣椒果實中原纖維蛋白(FBN1)積累，而脫落酸(ABA)則促進其FBN1的積累[22]；在擬南芥中，ABA處理可誘導FBN1a蛋白的積累，從而保護光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)免受光抑制[23]。在本研究中，NbFBN在干旱和ABA處理時表達水平均升高，這與擬南芥FBN1a、FBN1b表達特點相似[23]，表明該基因可能參與逆境響應過程。然而，干旱、ABA等逆境條件誘導植物FBN基因表達的機制還有待于進一步研究，本文有關NbFBN基因表達特點的結果有助于深入研究其生物學功能及其表達調控機制。