張浩杰，劉 梅，李春燕，何 冉，蘭景超，羅 娌，古小彬，謝 躍，楊光友，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.成都大熊貓繁育研究基地，四川 成都 610081)

犬惡絲蟲病是由犬惡絲蟲(Dirofilariaimmitis)引起的人獸共患寄生蟲病，其成蟲主要寄生于犬科和貓科動物的右心室及肺動脈內(nèi)[1-2]。該病呈世界性分布，在熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛流行，主要通過蚊媒傳播，危害的宿主動物達30余種[1-2]。人可因被攜帶犬惡絲蟲病原的蚊蟲叮咬而感染，主要引起肺部出現(xiàn)病變，其次蟲體在皮下、眼部、陰囊等處也有發(fā)現(xiàn)[3]。近年來，人感染該病的確診例數(shù)呈逐年上升的趨勢，已引起國際社會的高度重視[4]。目前，該病的診斷主要通過常規(guī)方法檢測微絲蚴，但其靈敏度低，而免疫學(xué)診斷方法尚不完善；在預(yù)防中，由于尚無商業(yè)化的疫苗，目前主要采用藥物預(yù)防，但化學(xué)藥物存在耐藥性及環(huán)境污染等問題[2]。

核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase，NDPK，EC 2.7.4.6)是一種“管家酶”，其主要功能是催化腺苷三磷酸(nucleoside triphosphate，ATP)和核苷二磷酸(nucleoside diphosphate，NDP)之間的磷酸基團的轉(zhuǎn)移反應(yīng)以此來維持細(xì)胞NDP和NTP代謝平衡，對生物體的新陳代謝具有重要意義[5-6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NDPK還可參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和凋亡等[5, 7-8]。NDPK已于多種寄生蟲中被發(fā)現(xiàn)，如惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)、克氏錐蟲(Trypanosomacruzi)、碩大利什曼原蟲(Leishmaniamajor)、亞馬孫利什曼原蟲(Leishmaniaamazonensis)、馬來絲蟲(Brugiamalayi)、旋毛蟲(Trichinellaspiralis)和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchuscontortus)[5-22]，且認(rèn)為NDPK可能是潛在的診斷抗原[11, 14, 22]和成為研發(fā)新的抗寄生蟲藥物的靶點[8-9, 13, 19]。但目前尚未見有關(guān)犬惡絲蟲NDPK(Di-NDPK)的報道。

本研究從犬惡絲蟲成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選Di-NDPK基因[1]，完成克隆和原核表達，并分析其基本特征。對NDPK重組蛋白(rDi-NDPK)的反應(yīng)原性進行了免疫印跡分析；用免疫組化的方法分析了Di-NDPK在犬惡絲蟲雌蟲和雄蟲體內(nèi)的分布情況，為Di-NDPK的功能研究、免疫診斷方法、疫苗和治療藥物等的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品和試驗動物

犬惡絲蟲的雌雄蟲體均來源于自然感染犬惡絲蟲死亡后的犬，解剖后采集的活蟲用PBS清洗，進行形態(tài)學(xué)鑒定后儲存于液氮中。將犬惡絲蟲雌蟲和雄蟲包埋后，制作石蠟切片。2只健康新西蘭大白兔，雌性，1.5～2.0 kg，購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.1.2 主要試劑

DH5α、BL21(DE3)、pMD19-T Vector購于TaKaRa公司；總RNA抽提試劑盒、TaqPCR MasterMix、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；DNA Marker、Protein Marker、QuickCutTM限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ/HindⅢ)、T4 DNA連接酶購于大連寶生物工程有限公司；HRP-標(biāo)記羊抗兔IgG、HRP-標(biāo)記兔抗犬IgG購于武漢博士德生物工程有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、鎳螯合親和層析柱、IgG純化預(yù)裝柱購于德國Qiagen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Thermo公司；IPTG、弗氏完全佐劑和不完全佐劑購于美國Sigma公司；FITC-標(biāo)記羊抗兔IgG購于美國EarthOx公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析

從犬惡絲蟲成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選得到的Di-NDPKunigene 8 687(GenBank No.：JR904615.1)，ORF Finder工具分析Di-NDPK基因ORF框。利用BLAST對測序得到的目的片段序列進行檢索，確認(rèn)擴增得到的是NDPK基因。將該基因序列通過Clustal W軟件與其他已報道的NDPK基因比對，用MEGA 5.1軟件分別進行序列相似性分析和構(gòu)建NJ(neighbor-joining)樹。

1.2.2Di-NDPK基因的擴增、克隆

根據(jù)GenBank中篩選的序列(GenBank No.：JR904615.1)，用Primer premiere 5.0進行引物的設(shè)計，上游引物：F，5′-CCGGAATTCATGTCAGCTACAAAGGAACGAACATTTA-3′；下游引物：R，5′-CCCAAGCTTCTATTCATACACCCAAGTAATTGTTGCTG-3′(下劃線序列分別含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點)，采用RT-PCR方法從犬惡絲蟲總RNA中擴增Di-NDPK基因的ORF框。按照RNA抽提試劑盒指示提取犬惡絲蟲總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系(10 μL)：預(yù)染PCR Mixture 5 μL，滅菌水3.5 μL，上下游引物及cDNA各0.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，58.5 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖核酸凝膠電泳檢測是否有目的片段大小的條帶，接著用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的產(chǎn)物，構(gòu)建pMD19-T-NDPK及pET-32a-NDPK重組質(zhì)粒，將菌液PCR和雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3 rDi-NDPK的表達和純化

將測序正確的菌接種于LB液體培養(yǎng)基中(含AMP)，37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，至菌液在紫外分光光度計下D值達0.6左右，加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后，12 000 r·min-1離心收集菌體，經(jīng)12%SDS-PAGE電泳檢測，確定rDi-NDPK是否表達，并同時優(yōu)化rDi-NDPK基因的原核表達條件。rDi-NDPK在最佳表達條件下大量表達后，經(jīng)過鎳螯合親和層析純化蛋白，最后用NanoDropTM One超微量紫外分光光度計測定純化后蛋白的濃度。

1.2.4 rDi-NDPK的Western blotting分析

rDi-NDPK經(jīng)12%SDS-PAGE分離，通過半干式轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉(5%)室溫封閉2 h后，加入一抗(犬惡絲蟲陽性血清，1∶100)，在4 ℃條件下孵育過夜；經(jīng)TBST洗滌4次后，加入二抗(HRP-標(biāo)記兔抗犬IgG，1∶2 000)室溫孵育2 h，再用TBST洗滌4次，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后，超純水終止反應(yīng)。

1.2.5 間接免疫熒光染色

用4%多聚甲醛固定犬惡絲蟲雄蟲和雌蟲成蟲，接著用石蠟包埋后制成切片(每片4 μm)，37 ℃晾干后，4 ℃保存。試驗前，于60 ℃環(huán)境下烘1.0～1.5 h，再依次按二甲苯Ⅰ(7 min)、二甲苯Ⅱ(7 min)、100%乙醇Ⅰ(3 min)、100%乙醇Ⅱ(3 min)、95%乙醇(3 min)、85%乙醇(3 min)、75%乙醇(3 min)、雙蒸水(8 min)進行脫蠟和水化。于95～100 ℃檸檬酸緩沖液中進行抗原的熱修復(fù)后，用PBS洗滌3次；于組織上滴加3%H2O2進行抗原氧化(20 min)，用PBS洗滌3次；于組織上滴加5%BSA進行封閉(60 min)，用PBS洗滌3次；于組織上滴加兔NDPK-IgG(1∶100)，濕盒中4 ℃孵育過夜；用PBS洗滌3次，滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(0.1%伊文氏藍1∶100稀釋)，濕盒中37 ℃避光孵育1 h后使用PBS洗滌3次，再滴加適量甘油緩沖液封片，并在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.6 間接ELISA的建立和評估

通過標(biāo)準(zhǔn)棋盤滴定法測定rDi-NDPK與血清反應(yīng)的ELISA最佳稀釋濃度。96孔板中包被抗原濃度10 μg·孔-1，4 ℃過夜。用PBST反復(fù)洗滌3次，加入5%的脫脂奶粉，37 ℃封閉1.5 h后反復(fù)洗滌3次。分別加入犬陽性血清和犬陰性血清，37 ℃孵育1 h后反復(fù)洗滌3次。隨后加入HRP標(biāo)記的羊抗犬二抗孵育1 h。反復(fù)洗滌后，每孔加入100 μL可溶性TMB顯色底物進行顯色，并以2 mol·L-1的H2SO4終止顯色，于酶標(biāo)儀上測定吸光值(λ=450 nm)。測定24份犬惡絲蟲病陰性血清的D450，按照計算方法，臨界值=平均值+3SD。

用建立的ELISA方法分別對8份細(xì)粒棘球蚴病陽性血清，2份細(xì)頸囊尾蚴病陽性血清，8份犬鉤蟲病陽性血清，18份犬弓首蛔蟲病陽性血清進行檢測，檢測其交叉反應(yīng)性。

以rDi-NDPK建立的ELISA方法，對24份犬惡絲蟲病陽性血清進行檢測，結(jié)合臨界值，判定該方法的可靠性。特異性=真陰性血清數(shù)/(真陰性血清數(shù)+假陽性血清數(shù))×100%，敏感性=真陽性血清數(shù)/(真陽性血清數(shù)+假陰性血清數(shù))×100%，總體符合率=(真陽性血清數(shù)+真陰性血清數(shù))/(真陽性血清數(shù)+假陽性血清數(shù)+真陰性血清數(shù)+假陰性血清數(shù))×100%。檢測所有血清的批間變異和批內(nèi)變異的變異系數(shù)(CV)，即標(biāo)準(zhǔn)方差與平均值之比。每個被檢測樣品在不同的96孔板上分別檢測3次，計算批間CV，在每個板內(nèi)設(shè)3個重復(fù)，計算批內(nèi)CV。

2 結(jié)果與分析

2.1 Di-NDPK基因的生物信息學(xué)分析

2.1.1 Di-NDPK蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測

經(jīng)ORF Finder工具分析預(yù)測，Di-NDPK的ORF框長為462 bp，其中A、T、C、G含量分別為33.77%、27.27%、16.45%、22.51%，G+C含量為38.96%，A+T含量為61.04%。Protparam分析結(jié)果顯示，Di-NDPK基因序列編碼153個氨基酸，蛋白質(zhì)的分子式C782H1232N212O221S9，相對分子量約45.7 ku。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)及親水性平均數(shù)分別為35.94和-0.277，因此，預(yù)測Di-NDPK是穩(wěn)定的可溶性蛋白。對Di-NDPK的信號肽切割位點和跨膜區(qū)進行預(yù)測，結(jié)果顯示無信號肽和跨膜區(qū)。預(yù)測Di-NDPK的B抗原表位結(jié)果顯示，Di-NDPK的抗原表位主要集中在1-4、91-93、96-106、110-112、122-127位氨基酸。Predictprotein預(yù)測Di-NDPK蛋白的二級結(jié)構(gòu)顯示，該蛋白中α-螺旋(H)占39.87%，β-折疊(E)占18.30%，環(huán)狀結(jié)構(gòu)(L)占41.83%。

2.1.2 Di-NDPK蛋白的氨基酸序列相似性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對Di-NDPK基因的氨基酸序列在NCBI中通過BlastP在線搜索，并通過DNAMAN進行序列比對，比對結(jié)果如圖1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Di-NDPK氨基酸序列與羅阿絲蟲(Loaloa)(登錄號：XP_003139722)、馬來絲蟲(登錄號：P48817)、犬弓首蛔蟲(Toxocaracanis)(登錄號：KHN88613)、有齒食道口線蟲(Oesophagostomumdentatum)(登錄號：KHJ94439)、鼠類圓線蟲(Strongyloidesratti)(登錄號：CEF65937)、美洲板口線蟲(Necatoramericanus)(登錄號：ETN73053)、十二指腸鉤口線蟲(Ancylostomaduodenale)(登錄號：KIH60906)、錫蘭鉤口線蟲(Ancylostomaceylanicum)(登錄號：EPB68610)的NDPK或NDPKa氨基酸序列相似性分別為92%、88%、82%、72%、71%、70%、71%、71%，且從圖中可以看出這些物種有94個氨基酸較為保守。運用MEGA5.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，從樹中可以看出，Di-NDPK與羅阿絲蟲和馬來絲蟲的親緣關(guān)系較近，聚為一個分支。

2.2 Di-NDPK基因的RT-PCR擴增及表達載體的構(gòu)建

Di-NDPK基因的PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳，得到與預(yù)期結(jié)果一致的特異性條帶(圖3-A)。重組質(zhì)粒pMD19-T-NDPK和pET32a(+)-NDPK經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ Quick Cut酶進行雙酶切鑒定，插入片段的大小與預(yù)期結(jié)果一致(圖3-B、C)。酶切鑒定正確的質(zhì)粒pET32a(+)-NDPK送去測序，測序正確的序列用于轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌株中，進行誘導(dǎo)表達。

圖1 犬惡絲蟲和其他物種的NDPK多序列比對Fig.1 Multiple sequence alignment of NDPK in D. immitis and other species

圖2 NDPK蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ樹)Fig.2 Phylogenetic analysis of NDPK proteins (NJ tree)

M1和M2，DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A，Di-NDPK的PCR產(chǎn)物；B，pMD19-T-NDPK的雙酶切鑒定；C，pET32a(+)-NDPK的雙酶切鑒定。M1， DL2000; M2， DL7000; A， PCR products of Di-NDPK; B， Identification of recombinant plasmid pMD19-T-NDPK by restriction endonucleases digestion; C， Identification of recombinant plasmid pET32a(+)-NDPK by restriction endonucleases digestion.圖3 Di-NDPK基因的RT-PCR產(chǎn)物及重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 PCR products of Di-NDPK gene and plasmid by restriction endonucleases digestion

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A，rDi-NDPK蛋白的表達，1，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含有pET32a(+)-NDPK的細(xì)菌；2、3，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含有pET32a(+)-NDPK的細(xì)菌；4，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含有pET32a(+)的細(xì)菌。B，rDi-NDPK蛋白的純化及免疫印跡，1，純化后的rDi-NDPK；2，rDi-NDPK的免疫印跡。M， Protein marker; A， The expression of rDi-NDPK， 1， pET32a(+)-NDPK induced by IPTG; 2， 3， pET32a(+)-NDPK without IPTG induction; 4， pET32a(+) induced by IPTG; B， Purification of rDi-NDPK and Western blotting analysis， 1， Purified rDi-NDPK; 2， Western blotting analysis of rDi-NDPK.圖4 rDi-NDPK的表達、純化及免疫印跡分析Fig.4 The expression and purification of recombinant protein NDPK and Western blotting analysis

2.3 rDi-NDPK的表達、純化及免疫印跡

經(jīng)過條件優(yōu)化顯示，溫度37 ℃，時間6 h，IPTG濃度為1.0 mmol·L-1是rDi-NDPK原核表達的最佳條件。rDi-NDPK經(jīng)12%SDS-PAGE電泳，得到約35 ku的蛋白，與預(yù)期條帶大小相同(圖4-A)。原核表達的重組菌，超聲破碎后經(jīng)可溶性分析，該蛋白以上清的形式存在。經(jīng)鎳柱親和層析柱純化后的rDi-NDPK條帶單一，顯示純度較好(圖4-B)。免疫印跡分析，顯示rDi-NDPK能與自然感染犬惡絲蟲的犬陽性血清特異性結(jié)合，證明rDi-NDPK具有良好的反應(yīng)原性(圖4-B)。

2.4 Di-NDPK的免疫熒光定位

間接免疫熒光顯示，Di-NDPK主要分布于雌性犬惡絲蟲成蟲的腸上皮細(xì)胞和腸腔，尤其在腸上皮細(xì)胞中大量分布，且分泌至腸腔中，在側(cè)索有少量分布(圖5-A、B)。Di-NDPK在雄性犬惡絲蟲成蟲的側(cè)索、肌肉細(xì)胞和腸腔均廣泛分布(圖5-C、D)。

2.5 ELISA

間接ELISA結(jié)果顯示，最佳血清稀釋度為1∶20，最佳抗原包被濃度為0.58 μg·孔-1。在最佳血清稀釋度和抗原包被濃度條件下，臨界值為0.498。用建立的間接ELISA方法檢測24份犬惡絲蟲陽性血清，結(jié)果顯示，16份陽性血清D值>臨界值，8份陽性血清D值<臨界值，敏感性為66.7%(圖6-A)。但與犬細(xì)粒棘球蚴病陽性血清、犬鉤蟲病陽性血清以及犬弓首蛔蟲病陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性為38.9%(圖6-B)。批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，批內(nèi)平均變異系數(shù)為1.5%，批間重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，批間平均變異系數(shù)為6.9%。批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%，證明該方法具有良好的重復(fù)性。

A，雌蟲陽性；B，雌蟲陰性對照；C，雄蟲陽性；D，雄蟲陰性對照；HY，側(cè)索；I，腸；TE，睪丸；PS，假體腔；MU，肌肉；UT，子宮；DE，胚胎。A， Female positive; B， Female negative control; C， Female positive; D， Female negative control; I， Intestines; PS， Pseudocoelom; UT， Uterus; MU， Muscle; HY， Hypodermis.圖5 雌性犬惡絲蟲成蟲橫切面Di-NDPK蛋白的間接免疫熒光定位Fig.5 Tissue localization of adult female and male D. immitis NDPK protein detected by indirect immunofluorescence

A，ELISA臨床試驗分析；B，ELISA交叉反應(yīng)試驗分析。實線代表cut-off值0.498。A， Clinical trial of the iELISA; B， The cross-reaction of the iELISA. The bold horizontal line indicates the cut-off value， which was 0.498.圖6 重組Di-NDPK間接ELISA分析Fig.6 Indirect ELISA using rDi-NDPK as the antigen

3 討論

NDPK存在于多種生物物種，在進化過程中高度保守[7, 18]。Di-NDPK的氨基酸序列與羅阿絲蟲等不同線蟲物種的NDPK氨基酸序列相似性高達70%以上。同時，對Di-NDPK蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有一個細(xì)胞黏附序列，即RGD序列(aa106-108)，氨基酸相似性比較分析發(fā)現(xiàn)，該序列與其他寄生蟲的氨基酸序列完全一致。此外，Di-NDPK蛋白還存在一個核苷二磷酸激酶活性位點(aa116-124)，僅與馬來絲蟲的同源氨基酸序列位點有1個氨基酸差異，與普遍公認(rèn)的NDP磷酸化序列(HGSDSV)也非常一致。其次，RGD序列緊密靠近NDPK活性位點，有可能RGD序列的Arg(R)殘基在底物結(jié)合到活性位點裂口的位置中扮演著重要作用。Di-NDPK的C-端殘基是YE，幾種線蟲的氨基酸相似性分析發(fā)現(xiàn)，這幾種線蟲的C-端殘基也都是YE，非常保守，與大多數(shù)的NDPK以Y、YE、YET殘基結(jié)尾較一致，與報道的惡性瘧原蟲的C-端殘基ICS不同，這些殘基對于NDPK的二聚是非常重要的[5, 8]。此外，由于Di-NDPK氨基酸序列中存在Lys12，與人類的Lys12一致，所以Di-NDPK可能有與DNA結(jié)合的活性[5]。

免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，rDi-NDPK能夠被自然感染犬惡絲蟲的犬陽性血清所識別，提示陽性血清中具有同Di-NDPK特異性結(jié)合的抗體，同時說明rDi-NDPK具有良好的反應(yīng)原性。在對馬來絲蟲NDPK研究中也發(fā)現(xiàn)，人攜帶馬來絲蟲的慢性無癥狀的患者血清中NDPK特殊的IgG能被檢測出[8]。其次，NDPK在利什曼原蟲、旋毛蟲和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中已被確認(rèn)存在其分泌蛋白產(chǎn)物中[11, 14, 16, 22]。作為分泌蛋白，通常暴露在宿主的免疫系統(tǒng)下，具有潛在的免疫學(xué)診斷價值。

犬惡絲蟲病的常規(guī)診斷方法主要有病原檢測，血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測[23]。目前，血清學(xué)檢測是最常用的檢測方法，分為抗原檢測和抗體檢測?？乖瓩z測的假陰性結(jié)果常見于輕微感染、雌蟲尚未成熟、僅感染雄蟲等情況；抗體檢測較抗原檢測的優(yōu)勢在于，不論雌蟲還是雄蟲都能檢測出來。宿主感染犬惡絲蟲2個月后，幼蟲刺激機體所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)就能被檢測出來，抗體檢測比抗原檢測能更早地檢測出犬惡絲蟲，適用于犬惡絲蟲病的早期檢測[24]。目前，已報道的重組抗原DGK、MTFP具有較高的敏感性和特異性，適合用于犬惡絲蟲病的診斷，同時，一些敏感性和特異性低的重組抗原，不適合作為診斷抗原[25-26]。本實驗結(jié)果顯示，rDi-NDPK敏感性為66.7%，特異性為38.9%，同時與犬細(xì)粒棘球蚴病血清、犬細(xì)頸囊尾蚴病血清、犬鉤蟲病血清和犬弓首蛔蟲病血清的交叉反應(yīng)。因此，rDi-NDPK蛋白不適合用于犬惡絲蟲病的診斷。

研究發(fā)現(xiàn)，嗜血性寄生蟲(如犬惡絲蟲)腸上皮細(xì)胞的“隱藏抗原”能被宿主的免疫應(yīng)答機制所識別，但它們通常不會暴露在宿主的免疫系統(tǒng)之下，因此，與分泌排泄抗原或傳統(tǒng)的暴露在蟲體表面的抗原相比，腸上皮細(xì)胞的“隱藏抗原”更適合做寄生蟲的重組蛋白疫苗[27]。對Di-NDPK的免疫熒光定位研究發(fā)現(xiàn)，NDPK蛋白分布在側(cè)索及腸上皮細(xì)胞和腸腔中，尤其在腸上皮細(xì)胞和腸腔中有大量的NDPK存在，說明NDPK可能主要分泌到犬惡絲蟲的腸腔中，是其腸上皮細(xì)胞的“隱藏抗原”。其次，對兔抗rDi-NDPK抗體檢測顯示，rDi-NDPK具有良好的免疫原性，與馬來絲蟲和利什曼原蟲報道的結(jié)果一致[8, 16]。因此，我們推測Di-NDPK可能是一個犬惡絲蟲的候選疫苗基因，其免疫保護效果還有待進一步的驗證。