白俊艷，曹 恒，王 旭，楊又兵，樊紅燈，付學(xué)言，時坤鵬，董智豪，盧小寧，李新月，郝偉光，李子衡，鄭飛揚

(河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023)

生長激素基因(growth hormone，GH)是影響動物生長性狀的主效基因[1]，具有提高飼料轉(zhuǎn)化[2]和促進肌肉中的蛋白質(zhì)合成[3]等作用。Warwick等[4]首先克隆了綿羊的GH基因并將其定位于11號染色體，綿羊的GH基因由5個外顯子和4個內(nèi)含子構(gòu)成。劉士力等[5]研究表明，翹嘴鲌生長激素基因全長5 966 bp，其中轉(zhuǎn)錄單元長1 648 bp，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。牛志剛等[6]研究表明，GH基因的AhⅠ位點在新疆褐牛群體中表現(xiàn)為VV、LV和LL三種基因型，而且14月齡的LV和LL基因型個體的體質(zhì)量、體長均比VV基因型的高，且差異顯著(P<0.05)。陳清等[7]研究表明，GH基因內(nèi)含子3在3個地方鵝品種中檢測到AA、AB、BB三種基因型，而且不同基因型與4～10周齡體質(zhì)量、屠體質(zhì)量、半凈膛質(zhì)量等19個性狀呈顯著相關(guān)。

許鋒[8]在4個蛋用品系雞中發(fā)現(xiàn)GH基因內(nèi)含子3中存在2個AvaⅠ酶切位點，該酶切位點與蛋型指標關(guān)聯(lián)顯著(P<0.05)。董飚等[9]研究表明，在黑羽番鴨群體的公鴨中，GH基因第1內(nèi)含子的CC基因型的宰前活質(zhì)量、屠體質(zhì)量、半凈膛質(zhì)量、全凈膛質(zhì)量、腹脂質(zhì)量、腺肌胃質(zhì)量顯著高于CD基因型和DD基因型(P<0.05)。海汀等[10]研究表明，GH基因?qū)溚蓐笈５捏w尺性狀無顯著影響。以上眾多研究表明，GH基因與畜禽的生長性狀和屠宰性能有著緊密關(guān)系，為此，本研究檢測了GH基因內(nèi)含子Ⅱ在大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、杜泊羊、湖羊群體中的多態(tài)性，并與綿羊體質(zhì)量和體尺等性狀進行了關(guān)聯(lián)分析，以期為綿羊的標記輔助選擇和進一步選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因組DNA提取

選擇河南省洛陽市馬坡鎮(zhèn)鮮達牧業(yè)杜泊羊50只，河南省洛陽市偃師和伊川縣的農(nóng)戶豫西脂尾羊50只，河南省濮陽市臺前縣的農(nóng)戶小尾寒羊60只，河南省平頂山市寶豐縣農(nóng)戶大尾寒羊60只，河南省洛陽市肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系洛陽綜合試驗湖羊50只，總計試驗綿羊270只。每只羊采集頸靜脈血液10 mL，采用ACD抗凝(1∶6)，-20 ℃保存。用上海生工提供的全血DNA試劑盒(SK1262)提取基因組DNA。

1.2 引物設(shè)計與PCR擴增

GH基因內(nèi)含子Ⅱ的引物序列參考施安[11]，引物由鄭州鼎國生物技術(shù)有限公司合成。引物序列信息具體如下，F(xiàn): 5′-CTGTTTGCCAACGCTGTGC-3′，R: 5′-CCCAAGCCACGACTGGATAAG-3′，片段大小為693 bp。

PCR擴增反應(yīng)體系的總體積為15 μL，具體為去離子水3.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA為2 μL，2×TaqPCR Mix為7.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個循環(huán)，72 ℃后延伸7 min；4 ℃保存。

1.3 PCR-RFLP分析

GH基因內(nèi)含子Ⅱ經(jīng)限制性內(nèi)切酶PvuⅡ(5′…CAG↓CTG…3′)消化酶切，依照產(chǎn)品說明書上推薦的酶切消化反應(yīng)4 h，酶切后的產(chǎn)物在3%的凝膠電泳下檢測。酶切反應(yīng)體系具體為ddH2O 7.4 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，10×Buffer 2 μL，限制性內(nèi)切酶PvuⅡ(10 U·μL-1) 0.6 μL，總計酶切反應(yīng)體系20 μL。

1.4 關(guān)聯(lián)分析

GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點多態(tài)性與綿羊生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，分析模型如下：

yijkl=μ+Pi+Sj+Mk+eijkl。

(1)

式(1)中：yijkl為性狀表型值；μ為總體均值；Pi為品種效應(yīng)(i=1，2，3，4，5)；Sj為性別效應(yīng)(j=1，2)；Mk為第k種基因型效應(yīng)；eijkl為殘差效應(yīng)。結(jié)果用平均值±標準差來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點的PCR擴增產(chǎn)物檢測

五個綿羊群體的GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點的PCR擴增產(chǎn)物的檢測結(jié)果見圖1，從圖1可以看出，GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點的擴增片段約為693 bp，與目的條帶一致，且條帶清晰、無雜帶，可以進行后續(xù)PCR-RFLP分析。

2.2 綿羊GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點的PCR-RFLP分析

大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、杜泊羊、湖羊的GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點進行酶切結(jié)果見圖2-圖5，酶切后檢測到AB基因型(264 bp/429 bp/693 bp)和BB基因型(264 bp/429 bp)共兩種基因型。

M，Marker DL2000；1、2、3、4、5分別為大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、杜泊羊、湖羊。M， Marker DL2000; 1， 2， 3， 4 and 5 were Large-tailed Han sheep， Small-tailed Han sheep， Yuxi fat-tailed sheep， Dorper sheep and Hu sheep， respectively.圖1 五個綿羊群體的GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點的檢測結(jié)果Fig.1 Detection of PvuⅡ locus in intron Ⅱ of GH gene in sheep populations

1、6，AB基因型；2、3、4、5，BB基因型；M，Marker DL2000。1, 6: AB genotypes; 2, 3, 4, 5: BB genotypes; M, Marker DL2000. 圖2 小尾寒羊的GH基因PvuⅡ位點多態(tài)性Fig.2 Polymorphism of GH gene PvuⅡ locus in Small-tailed Han sheep

5、6，AB基因型；1、2、3、4，BB基因型；M，Marker DL2000。5, 6: AB genotypes;1, 2, 3, 4: BB genotypes; M, Marker DL2000. 圖3 豫西脂尾羊的的GH基因PvuⅡ位點多態(tài)性Fig.3 Polymorphism of GH gene PvuⅡ locus in Yuxi fat-tailed sheep

6、7、8，AB基因型；1、2、3、4、5，BB基因型；M，Marker DL2000。6, 7, 8: AB genotypes; 1, 2, 3, 4, 5: BB genotypes; M, Marker DL2000.圖4 湖羊的GH基因PvuⅡ位點多態(tài)性Fig.4 Polymorphism of GH gene PvuⅡ locus in Hu sheep

2、3、4，AB基因型；1、5、6、7、8，BB基因型；M，Marker DL2000。2, 3, 4: AB genotypes; 1, 5, 6, 7, 8: BB genotypes; M, Marker DL2000.圖5 杜泊羊的GH基因PvuⅡ位點多態(tài)性Fig.5 Polymorphism of GH gene PvuⅡ locus in Dorper sheep

2.3 綿羊GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點的群體遺傳學(xué)分析

綿羊GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點的群體遺傳學(xué)分析結(jié)果見表1，可以看出，GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點在大尾寒羊、小尾寒羊群體中AB基因型頻率最高(0.786和0.750)，而在豫西脂尾羊、湖羊、杜泊羊群體中以BB基因型頻率最高(0.576、0.529和0.541)。GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點在5個綿羊群體中均以B等位基因頻率為最高。GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點在5個綿羊群體中的有效等位基因數(shù)為1.497～1.908，多態(tài)信息含量(PIC)為0.277～0.363，呈現(xiàn)為中度多態(tài)性(0.250.05)。

2.4 綿羊GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點的多態(tài)性與綿羊生長性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表2，從表2可以看出，AB基因型的體質(zhì)量、體長、胸寬、臀端高、管圍、尻高、頸長上顯著高于BB基因型(P<0.05)，GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點對其他性狀無顯著影響(P>0.05)。

3 討論

由于生長激素基因在動物生長發(fā)育中有著重要的生理作用，對GH基因的研究就成為同類研究中的一個重要課題。Valinsky等[12]對綿羊GH基因第2內(nèi)含子進行擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了2個等位基因。Bastos等[13]檢測到葡萄牙綿羊品種中GH基因第4、5外顯子的多態(tài)情況。任春環(huán)[14]通過PCR-SSCP的方法對4個綿羊品種的GH基因進行了多態(tài)性檢測，結(jié)果表明，在所檢測的第1內(nèi)含子、第2外顯子、第2內(nèi)含子、第3外顯子、第3內(nèi)含子、第4外顯子、第4內(nèi)含子、第5外顯子位點中，僅在第3內(nèi)含子和第4外顯子檢測到SNP，其余位點均未檢測到SNP。于洪川等[15]利用限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)在不同灘羊群體中發(fā)現(xiàn)酶切位點并命名為AB、BB基因型。馬麗娜[16]對GH基因在灘羊群體中多態(tài)性研究表明，GH基因在灘羊群體中具有多態(tài)性，出現(xiàn)AB、BB兩種基因型，頻率為0.362 3、0.637 7。本研究采用PCR-RFLP的方法在大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、杜泊羊、湖羊5個綿羊群體中，對GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點只檢測到了AB基因型和BB基因型，這與施安[11]、于洪川等[15]、馬麗娜[16]等的研究結(jié)果相一致，與任春環(huán)[14]的研究結(jié)果不符。

表1 綿羊GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點的遺傳多態(tài)性

Table1Genetic polymorphism ofPvuⅡ locus in intron Ⅱ ofGHgene in sheep

遺傳多態(tài)性Genetic polymorphism頻率Frequency大尾寒羊Large-tailedHan sheep小尾寒羊Small-tailedHan sheep豫西脂尾羊Yuxi fat-tailedsheep湖羊Hu sheep杜泊羊Dorper sheep基因型頻率Genotype frequencyBB0.2140.2500.5760.5290.541AB0.7860.7500.4240.4710.459基因頻率Gene frequencyA0.3930.3750.2120.2350.229B0.6070.6250.7880.7650.771雜合度Heterozygosity0.4760.4660.3320.3640.354多態(tài)信息含量Polymorphic information content0.3630.3580.2770.2980.291有效等位基因數(shù)Number of effective alleles1.9081.8761.4971.5751.547χ2值3.5717.4588.7275.8827.149P0.0590.0080.0030.0150.008

表2GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點與綿羊生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

Table2Association ofPvuⅡ locus in intron Ⅱ ofGHgene with growth traits in sheep

性狀TraitsAB基因型AB genotypeBB基因型BB genotype性狀TraitsAB基因型AB genotypeBB基因型BB genotype體質(zhì)量Body weight/kg52.32±6.97 a47.08±7.04 b背高Back height/cm 72.27±1.01 a69.09±1.03 a體高Body height/cm 69.55±9.60 a64.84±10.64 a胴體質(zhì)量Carcass weight/kg 24.30±0.82 a21.25±1.49 a體長Body length/cm 70.94±7.32 a64.23±5.80 b尻高Rump height/cm 73.41±1.76 a64.92±3.58 b胸圍Chest circumference/cm90.65±9.00 a91.23±9.84 a尻長Rump length/cm 23.72±1.02 a22.07±0.53 a胸寬Chest width/cm 29.47±4.48 a25.54±4.78 b頭長Head length/cm 21.22±0.65 a19.15±0.88 a胸深Chest depth/cm 33.84±3.88 a33.00±4.49 a頭深Head depth/cm 17.75±0.72 a16.23±0.75 a腰角寬Waist width/cm 29.21±11.98 a26.38±10.29 a頸長Neck length/cm 33.36±3.04 a27.69±2.14 b臀端寬Buttock width/cm 20.32±3.73 a20.15±3.44 a額寬Frontal width/cm 13.36±0.50 a12.46±0.64 a臀端高Buttock height/cm 68.89±6.87 a62.62±8.75 b腹圍Abdominal circumference/cm 95.72±2.96 a99.53±3.05 a管圍Cannon circumference/cm10.16±1.50 a9.07±1.12 b腿臀圍Leg hip circumference/cm 92.05±2.31 a92.15±3.38 a

同行不同列數(shù)據(jù)后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

The values in the same row followed by different lower-case letters showed the significant difference (P<0.05).

胡沈榮等[17]分析了5個山羊品種GH基因，除了波爾山羊外，其他山羊品種均有多態(tài)性，且GH基因外顯子5位點的基因頻率分布與品種特性有關(guān)，外顯子2與產(chǎn)羔多態(tài)性有顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)。張春香等[18]在南江黃羊生長激素第3外顯子發(fā)現(xiàn)G/A突變與該品種6月齡和12月齡體質(zhì)量和體高有影響。閔令江等[19]通過PCR擴增了山羊5′調(diào)控區(qū)序列，共得到5處突變位點，不同突變位點均與山羊體質(zhì)量、體尺性狀關(guān)聯(lián)性較強。張建軍等[20]以隴東山羊為研究對象，在GH基因外顯子4區(qū)域發(fā)生堿基突變，與6月齡質(zhì)量，周歲質(zhì)量，胸圍等指標顯著相關(guān)。張浩等[21]在甘肅現(xiàn)代肉羊品種中GH外顯子1上發(fā)現(xiàn)301 bp處的T/A突變造成AA、AB基因型，數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)顯示與肉羊體質(zhì)量關(guān)聯(lián)顯著，且表現(xiàn)為雜合型明顯高于純合型。馬麗娜[16]對GH基因在灘羊群體中多態(tài)性研究表明，GH基因不同基因型(AB和BB)與初生質(zhì)量、二毛活質(zhì)量、三月體質(zhì)量和六月體質(zhì)量差異均極顯著(P<0.01)。多重比較結(jié)果顯示，AB基因型個體各年齡階段體重的最小二乘均值均極顯著高于BB基因型(P<0.01)。王鵬[22]發(fā)現(xiàn)湖羊GH基因的外顯子3位點的GH基因型和外顯子4位點的LM基因型的初生質(zhì)量、斷奶質(zhì)量和六月齡質(zhì)量平均值均相對于另一個基因型。李文文等[23]通過對7個綿羊品種GH基因檢測發(fā)現(xiàn)5′端調(diào)控區(qū)、第4外顯子3′端區(qū)域均存在多態(tài)性，其中山谷型藏羊不同基因型個體間的體質(zhì)量、體長、體高、胸圍具有顯著差異(P<0.05)。施安[11]研究表明，灘羊的GH基因內(nèi)含子2的AB基因型初生質(zhì)量、斷奶質(zhì)量、6月齡體質(zhì)量顯著高于BB基因型(P<0.05)。本研究表明，綿羊GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點AB基因型的體重顯著高于BB基因型(P<0.05)，這與施安[11]和馬麗娜[16]研究結(jié)果相符，此外本研究還表明，GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點對體長、胸寬、臀端高、管圍、尻高、頸長等有顯著影響(P<0.05)，這與閔令江等[19]和李文文等[23]的研究結(jié)果相似。可見，GH基因內(nèi)含子Ⅱ的PvuⅡ位點可以作為綿羊生長性狀的候選標記進行標記輔助選擇。