張春潔，趙圓圓，陸婷婷，趙 文，蘇樂(lè)樂(lè)，徐 兵，陳義勇，關(guān)彥明

（1. 常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2. 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015）

海鮮菇（Hypsizygus marmoreus）隸屬擔(dān)子菌門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬，又名蟹味菇、真姬菇，富含蛋白質(zhì)、維生素、多糖、微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)素［1］. 多糖是海鮮菇的主要成分之一，目前對(duì)海鮮菇多糖（Polysaccharides fromhypsizygus marmoreus，HMP）的研究主要集中在生物活性如抗腫瘤、提高免疫力［2］、抗病毒［3］、抗氧化［4］、分子結(jié)構(gòu)特性［4］及提?。?-8］等方面，而對(duì)HMP化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾的研究還未見(jiàn)報(bào)道. 隨著對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的深入研究，發(fā)現(xiàn)用適當(dāng)?shù)氖侄螌?duì)多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)上的化學(xué)修飾，對(duì)多糖生物活性有較大的影響［9］.

本研究采用乙?；椒▽?duì)HMP結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，利用響應(yīng)面法對(duì)HMP乙?；揎椆に囘M(jìn)行優(yōu)化，并探討乙?；ｕr菇多糖（Acetylated polysaccharides fromhypsizygus marmoreus，Ac-HMP）的抗氧化活性，旨在為HMP乙?；揎棽㈤_(kāi)發(fā)一種新型天然功能食品添加劑提供參考.

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

海鮮菇（昆山正興食用菌有限公司提供）；DPPH（深圳欣博盛生物科技有限公司） ；Tris（蘇州亞科科技股份有限公司）； 乙酸酐、過(guò)氧化氫、水楊酸等試劑均為分析純.

1.2 主要儀器與設(shè)備

HH-2智能數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；小型高速粉碎機(jī)（山東維諾醫(yī)藥設(shè)備制造有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京成萌偉業(yè)科技有限公司）；SHB-B95循環(huán)水式多用真空泵（鄭州世紀(jì)雙科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器（金壇市友聯(lián)儀器研究所）；722型數(shù)顯可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器五廠有限公司）；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀（日本島津公司）；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī)（日本HITACHI公司）； Alpha 1-2 LD plus真空冷凍干燥機(jī)（德國(guó)CHRIST公司）.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HMP的制備

海鮮菇經(jīng)過(guò)干燥（30 ℃，24 h）粉碎，將海鮮菇粉末（100 g）與蒸餾水（4 000 mL）混合，80 ℃條件下浸提8 h，然后將提取液離心（4 500 r/min，20 min）. 棄去沉淀，將上清液旋蒸濃縮至原來(lái)體積的1/4，用Sevage法［10］除去蛋白，然后加入4倍體積95%乙醇，4 °C條件下醇沉24 h后再離心，將沉淀冷凍干燥得到HMP.

1.3.2 Ac-HMP的制備［11］

稱取HMP 100 mg，用10 mL蒸餾水充分溶解，用NaOH溶液（5 mol/L）將其pH調(diào)至9.0. 向HMP溶液中加入一定體積的乙酸酐，攪拌均勻并充分反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用HCl調(diào)節(jié)pH至7.0，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入截留分子量為15 000 Da的透析袋中，用蒸餾水透析48 h，透析完成后將反應(yīng)液旋蒸濃縮至原來(lái)體積的1/4，然后加入4倍體積的95%乙醇沉淀24 h，沉淀經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥后得到Ac-HMP.

1.3.3 乙?；〈龋―egree of substitution，DS）的測(cè)定［12］

取100 mg Ac-HMP，用10 mL 0.01 mol/L NaOH溶液充分溶解，加入兩滴酚酞指示劑，并用0. 01 mol/L HCl溶液滴定至紅色褪去，記錄所消耗鹽酸的體積，根據(jù)以下公式計(jì)算取代度.

乙?；?［（NaOH溶液體積×NaOH溶液濃度-消耗HCl溶液體積×HCl溶液濃度）×0.043］/樣品質(zhì)量×100%

取代度（DS）=（132×乙?；浚?（4 300-42×乙?；浚?/p>

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)Ac-HMP取代度的影響

取100 mg HMP，用10 mL蒸餾水充分溶解，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，加入2.5 mL乙酸酐，反應(yīng)溫度50 ℃，研究反應(yīng)時(shí)間（1，2，3，4，5 h）對(duì)Ac-HMP取代度的影響來(lái)確定適宜的反應(yīng)時(shí)間.

1.3.4.2 反應(yīng)溫度對(duì)Ac-HMP取代度的影響

取100 mg HMP，用10 mL蒸餾水充分溶解，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，加入2.5 mL乙酸酐，反應(yīng)時(shí)間3 h，研究反應(yīng)溫度（40，50，60，70，80 ℃）對(duì)Ac-HMP取代度的影響來(lái)確定適宜的反應(yīng)溫度.

1.3.4.3 乙酸酐用量對(duì)Ac-HMP取代度的影響

取100 mg HMP，用10 mL蒸餾水充分溶解，用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，反應(yīng)溫度50 ℃，反應(yīng)時(shí)間3 h，研究乙酸酐用量（1.5，2，2.5，3，3.5 mL）對(duì)Ac-HMP取代度的影響來(lái)確定適宜的乙酸酐用量.

1.3.5 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙?；〈葹橹笜?biāo)，選擇反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、乙酸酐用量3個(gè)因素，通過(guò)三因素三水平的響應(yīng)面分析法確定HMP乙酰化修飾的最佳工藝.

1.3.6 HMP與Ac-HMP的紅外光譜表征

分別取1 mg經(jīng)過(guò)干燥的HMP和Ac-HMP，加入2 mg溴化鉀混勻，壓片，進(jìn)行紅外光譜掃描，波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1.

1.3.7 抗氧化活性

1.3.7.1 HMP與Ac-HMP對(duì)羥自由基清除作用［13］

依次加入1.0 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，1.0 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，然后分別加入不同濃度（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）的HMP和Ac-HMP溶液1.0 mL，最后加入9 mmol/L H2O2溶液1.0 mL，混合均勻后37 ℃下反應(yīng)30 min，測(cè)定OD510值，記為Ai. 用蒸餾水替代過(guò)氧化氫重復(fù)上述操作，測(cè)定的OD510值計(jì)為Aj. 用蒸餾水替代HMP和Ac-HMP溶液重復(fù)上述操作，測(cè)定的OD510值計(jì)為A0，測(cè)定3次，根據(jù)以下公式計(jì)算羥自由基的清除率.

1.3.7.2 HMP與Ac-HMP對(duì)超氧陰離子自由基清除作用［14］

分別加入HMP和Ac-HMP溶液（濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）1.0 mL，Tris-HCl緩沖液（50 mmol /L）4.5 mL和3.2 mL蒸餾水，混合均勻后，25 ℃條件下恒溫水浴20 min，然后分別加入3 mmol/L的鄰苯三酚0.3 mL，恒溫（25 ℃）水浴3 min. 待反應(yīng)結(jié)束后，立即滴加HCl溶液（10 mol/L）終止反應(yīng). 測(cè)定OD325值，記為A；空白實(shí)驗(yàn)組用蒸餾水替代多糖溶液重復(fù)上述操作，測(cè)定OD325值，記為A0. 測(cè)定3次，根據(jù)以下公式計(jì)算超氧陰離子自由基的清除率.

1.3.7.3 HMP與Ac-HMP對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定［15］

分別加入HMP和Ac-HMP溶液（濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）2.0 mL，然后分別加入DPPH溶液（無(wú)水乙醇配制，濃度為0.1 mmol/L）2.0 mL，室溫條件下避光反應(yīng)30 min，測(cè)定OD517值，記為A2. 分別以蒸餾水代替DPPH溶液、多糖溶液測(cè)定OD517值，分別記為A1和A0，測(cè)定3次，根據(jù)以下公式計(jì)算DPPH自由基的清除率.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)Ac-HMP取代度的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)Ac-HMP取代度的影響如圖1所示. 從圖1可以看出，在1～3 h時(shí)間范圍內(nèi)，取代度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，在3 h之后取代度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，因此確定合適的反應(yīng)時(shí)間為3 h.

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)Ac-HMP取代度的影響

反應(yīng)溫度對(duì)Ac-HMP取代度的影響如圖2所示. 從圖2可以看出，隨著溫度的提高，取代度逐步增加然后呈下降趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，取代度達(dá)到最大值，因此適宜的反應(yīng)溫度為40 ℃.

2.1.3 乙酸酐用量對(duì)Ac-HMP取代度的影響

乙酸酐用量對(duì)Ac-HMP取代度的影響如圖3所示. 從圖3可以看出，取代度隨著乙酸酐用量增加而提高，當(dāng)乙酸酐用量在3 mL時(shí)，取代度達(dá)到最大，因此適宜的乙酸酐用量為3 mL.

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)Ac-HMP取代度的影響

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)Ac-HMP取代度的影響

2.2 HMP乙?；揎椆に噧?yōu)化

2.2.1 響應(yīng)模型的建立與分析

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以取代度為指標(biāo)，反應(yīng)時(shí)間（A）、反應(yīng)溫度（B）、乙酸酐用量（C）3個(gè)實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3.

借助Design-Expert軟件進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到如下多元二次響應(yīng)面回歸模型：

由表3回歸分析結(jié)果可得，模型的F值為14.12，P＜0.01，表明該模型差異極顯著，可以用于實(shí)際實(shí)驗(yàn). 失擬項(xiàng)P=0.087 1（＞0.05），說(shuō)明失擬不顯著，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未知因素對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小，模型選擇正確.R2為0.947 8，表明取代度的實(shí)際值與模型的預(yù)測(cè)值有較好的擬合度.

2.2.2 響應(yīng)面圖分析

兩因素交互作用對(duì)Ac-HMP取代度的影響如圖4所示. 從圖4可以看出，溫度對(duì)Ac-HMP取代度影響明顯，乙酸酐用量的影響次之，反應(yīng)溫度的影響最不顯著. 時(shí)間和乙酸酐用量對(duì)Ac-HMP取代度交互作用顯著，溫度與乙酸酐用量對(duì)Ac-HMP取代度交互作用相對(duì)弱一些，而反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)Ac-HMP取代度交互作用不明顯.

2.2.3 HMP乙?；揎椬罴压に嚧_定及驗(yàn)證

通過(guò)借助Design-Expert 軟件對(duì)響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到HMP乙?；揎椀淖顑?yōu)工藝條件為：時(shí)間3.85 h，溫度59.86 ℃，乙酸酐用量為2.88 mL. 在該優(yōu)化條件下，海鮮菇多糖乙?；〈瓤蛇_(dá)到0.602.

為了判斷優(yōu)化工藝參數(shù)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，在具體實(shí)驗(yàn)中將最優(yōu)工藝條件進(jìn)行適調(diào)整為反應(yīng)時(shí)間4 h，反應(yīng)溫度60 ℃，乙酸酐用量為3 mL. 在調(diào)整條件下，測(cè)定Ac-HMP的取代度為0.59，與預(yù)測(cè)取代度接近，從而驗(yàn)證了該模型具有可行性.

2.3 HMP與Ac-HMP的紅外光譜分析

HMP與Ac-HMP的紅外光譜圖如圖5所示. 從圖5可以看出，HMP和Ac-HMP均有多糖類物質(zhì)紅外特征峰：在波數(shù)3 427 cm-1左右處出現(xiàn)的寬吸收峰主要是多糖中的-OH基團(tuán)引起的；3 132.27 cm-1處出現(xiàn)的弱吸收峰是C-H伸縮振動(dòng)引起的；Ac-HMP在波數(shù)1 724.13 cm-1處出現(xiàn)的弱吸收峰主要是由酯基C=O基團(tuán)的伸縮振動(dòng)引起的；1 247.78 cm-1處出現(xiàn)弱的酯基C-O基團(tuán)伸縮振動(dòng)峰，該振動(dòng)峰和乙?；嚓P(guān)，表明存在乙酰基［16］. 由此可知在HMP中成功加上了乙?；鶊F(tuán)，即乙酰化修飾成功.

圖3 乙酸酐用量對(duì)Ac-HMP取代度的影響

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

圖4 兩因素交互作用對(duì)Ac-HMP取代度的影響

2.4 抗氧化活性

2.4.1 HMP與Ac-HMP對(duì)羥自由基清除作用

HMP與Ac-HMP對(duì)羥自由基清除作用見(jiàn)圖6. 從圖6可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，HMP和Ac-HMP對(duì)羥自由基具有較強(qiáng)的清除作用，隨著濃度的增加不斷上升，呈濃度依賴關(guān)系. 與HMP相比，Ac-HMP對(duì)羥自由基清除作用顯著增強(qiáng). 可能是因?yàn)槎嗵羌尤胍阴；?，?dǎo)致多糖支鏈充分展開(kāi)，水溶性增加進(jìn)而有助于抗氧化活性的發(fā)揮［17］. 梁少茹等人［11］研究發(fā)現(xiàn)與未修飾的茶多糖相比，乙?；揎椇蟮牟瓒嗵菍?duì)羥自由基的清除作用明顯增強(qiáng). 宋逍等人［18］研究發(fā)現(xiàn)乙?；揎椇蟮慕疸y花多糖清除羥基自由基的能力增強(qiáng). 但是不是所有的多糖經(jīng)過(guò)改性后生物活性都會(huì)提高. 研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲(chóng)草多糖［19］、松樹(shù)蕈多糖［20］經(jīng)過(guò)乙酰化修飾后抗氧化活性反而降低，這可能是多糖種類及結(jié)構(gòu)不同造成抗氧化活性的差異［20］.

2.4.2 HMP與Ac-HMP對(duì)DPPH自由基清除作用

HMP與Ac-HMP對(duì)DPPH自由基清除作用見(jiàn)圖7. 從圖7可以看出，在選擇的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，HMP與Ac-HMP對(duì)DPPH自由基均有一定的清除能力，且清除能力與濃度呈正相關(guān). 與HMP相比，Ac-HMP對(duì)DPPH自由基清除能力增強(qiáng)，這可能與乙?；髮?dǎo)致更多多糖內(nèi)部的羥基或羧基暴露，使多糖水溶性增加有助于活性發(fā)揮有關(guān)［21］.

2.4.3 HMP與Ac-HMP對(duì)超氧陰離子自由基清除作用

圖5 HMP和Ac-HMP紅外光譜圖

HMP與Ac-HMP對(duì)超氧陰離子自由基清除作用見(jiàn)圖8. 從圖8可以看出，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，HMP和Ac-HMP對(duì)超氧陰離子自由基清除能力逐步提高. 與HMP相比，Ac-HMP對(duì)超氧陰離子自由基清除能力有一定程度的增強(qiáng)，這可能是因?yàn)镠MP經(jīng)過(guò)修飾后導(dǎo)致Ac-HMP空間結(jié)構(gòu)變化，具體機(jī)理有待深入研究. 已有研究也表明黑木耳多糖［22］、二色補(bǔ)血草多糖［23］經(jīng)過(guò)乙?；揎椇髮?duì)超氧陰離子自由基的清除能力有所增強(qiáng).

圖6 HMP和Ac-HMP對(duì)羥自由基清除作用

圖7 HMP和Ac-HMP對(duì)DPPH自由基清除作用

圖8 HMP與Ac-HMP對(duì)超氧陰離子自由基清除作用

3 結(jié)論

以海鮮菇為原料，采用熱水浸提法提取HMP，采用乙酸酐法制備Ac-HMP，采用響應(yīng)面法對(duì)HMP乙?；揎椆に囘M(jìn)行優(yōu)化，并探討了HMP與Ac-HMP的抗氧化活性. HMP乙酰化最佳工藝條件為：時(shí)間3.85 h，溫度59.86 ℃，乙酸酐用量2.88 mL. 在該優(yōu)化條件下，HMP乙?；〈冗_(dá)到0.602. 與HMP相比，Ac-HMP抗氧化活性明顯增強(qiáng).

該研究通過(guò)對(duì)HMP乙?；揎棧M(jìn)而改變HMP分子結(jié)構(gòu)，提高了HMP的抗氧化活性，說(shuō)明乙酰化修飾是一種較為理想的HMP結(jié)構(gòu)改性方法. 這對(duì)進(jìn)一步揭示多糖構(gòu)效關(guān)系及HMP在未來(lái)開(kāi)發(fā)一種新型天然功能食品添加劑具有重要意義，但是對(duì)影響Ac--HMP抗氧化活性的結(jié)構(gòu)因素如乙?；〈恢谩⒖臻g構(gòu)象及取代度大小等尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究.