張晶晶*，鄧歆玥*，徐 燁，陶翊雯，王靜文，韓曜平

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

1 引言

蛋白酶抑制劑是一類多肽或蛋白質(zhì)，因其能與蛋白酶活性部位結(jié)合而抑制酶的催化活性，可作為蛋白酶的調(diào)控物. 蛋白酶抑制劑廣泛分布于生物組織中，參與調(diào)節(jié)生物生命活動的酶反應(yīng)活動［1-2］. 蛋白酶抑制劑是首先在動物血清中被發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)［3］. 禽卵中的蛋白酶抑制劑成分最初在雞卵清蛋白中被發(fā)現(xiàn)，具有抑制胰蛋白酶的活性［4］.

前期研究表明，動物卵中蛋白酶抑制劑具有抗微生物感染的作用，并在卵胚胎發(fā)育過程及早期胚胎生長過程中起著調(diào)控酶反應(yīng)的作用. 目前在鳥卵、兩棲動物卵和爬行動物卵的卵黃和卵清中皆發(fā)現(xiàn)了不同類型的蛋白酶抑制劑［5-6］. 總體而言，目前對鳥卵中胰蛋白酶抑制劑的純化研究還較少 ，而對環(huán)頸雉卵中蛋白酶抑制劑的純化及性質(zhì)研究在國內(nèi)尚未見報道.

因此，本課題研究以環(huán)頸雉卵清為研究材料，擬利用層析分離手段和發(fā)色底物檢測方法，對環(huán)頸雉卵清蛋白酶抑制劑活性及其理化性質(zhì)進(jìn)行研究，為其進(jìn)一步研究和高效利用提供理論依據(jù).

2 材料與方法

2.1 材料與儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)材料：環(huán)頸雉卵購于本地農(nóng)貿(mào)市場，質(zhì)量為40～50 g；胰蛋白酶，發(fā)色底物（B-3133），購于美國西格瑪（Sigma）公司；Sephadex G-50，Sephadex G-75交聯(lián)葡聚糖凝膠，購于美國通用（Pharmacia）公司.

試驗(yàn)用主要儀器設(shè)備：pH儀，高速冷凍離心機(jī)，層析柱（2.6 cm×100 cm），循環(huán)水式真空泵，冷凍干燥機(jī)，紫外分光光度計.

2.2 方法

2.2.1 樣品制備

環(huán)頸雉卵清洗后去殼收集卵清液，混合適量的PBS緩沖液，用研缽研磨勻漿，12 000 r/min，4 ℃ 離心30 min. 收集上清液，按照常規(guī)凍干方法制成凍干粉. 將凍干粉溶解于適量的0.1 mol/L磷酸氫鹽緩沖溶液（PBS，pH 6.0）中，12 000 r/min，4 ℃離心30 min. 取上清液，置于EP管中作為活性檢測及Sephadex G-50交聯(lián)葡聚糖凝膠層析樣品備用.

2.2.2 Sephadex G-50交聯(lián)葡聚糖凝膠過濾

參照歐雪等［7］的方法，用0.1 mol/L磷酸氫鹽緩沖溶液（PBS，pH6.0）洗脫平衡Sephadex G-50凝膠過濾柱（2.6 cm×100 cm）. 將上清液放入已預(yù)處理好的柱中，用上述PBS液洗脫，流速0.35 mL/min. 洗脫液被分離出來后，在波長為280 nm處測量各洗脫液中蛋白的濃度，收集活性峰，凍干，置冰箱保存.

2.2.3 Sephadex G-75交聯(lián)葡聚糖凝膠過濾

參照歐雪等［7］的方法：經(jīng)G-50交聯(lián)葡聚糖凝膠層析過濾后收集有活性的凍干粉，用0.1 mol/L（pH6.0）PBS緩沖液溶解，10 000 r/min離心20 min. 將上清液放入已預(yù)處理過的柱中，用上述PBS液洗脫，流速0.35 mL/min. 洗脫液被分離出來后，在波長為280 nm處測量各洗脫液中蛋白的濃度，合并各洗脫峰并檢測各峰活性，將活性峰凍干備用.

2.2.4 SDS-PAGE及分子量測定

SDS-PAGE對照LaemmLi方法［8］，制備兩種pH不同的電泳膠，分離膠含量為10%， pH 8.8；濃縮膠含量為5%，pH 6.9. 在SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)時，純化樣品用上樣緩沖液（還原狀態(tài)）染色，脫色時先用200 mL蒸餾水用微波爐高火煮沸3 min，后用考馬斯亮藍(lán)染液高火煮沸2 min，最后用500 mL蒸餾水煮沸25 min，脫色完成. 用標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白確定純化的環(huán)頸雉卵清蛋白酶抑制劑的分子質(zhì)量.

2.2.5 環(huán)頸雉卵清胰蛋白酶抑制活性檢測及其抑制常數(shù)（Ki）的確定

測量蛋白酶抑制活性可參考文獻(xiàn)［7］，具體方法為：在50 mmol/L pH 7.6的Tris-HCl緩沖液中，將不同量分離純化到的卵清蛋白酶抑制劑樣品與胰蛋白酶保育15 min，然后放入30 μmol/L發(fā)色底物B-3133.于410 nm，每間隔50 s（共2 min）測量吸光度. 每次分離純化結(jié)束后，都用胰蛋白酶與B-3133底物來測量酶抑制劑活性. 1單位酶活：每分鐘放出的量；1單位抑制作用：每分鐘量為1 nmol的對Trypsin的抑制.

環(huán)頸雉卵清蛋白酶抑制劑對Trypsin的抑制測量方法同上文. Trypsin與Tris-HCl緩沖液、不同濃度的卵蛋白酶抑制劑在室溫下水浴，時間為1～24 h（每間隔4 h）. 以空白蒸餾水的酶活為100%，算出剩余酶活.

純化的環(huán)頸雉卵蛋白酶抑制劑有酶抑制劑的作用，使用Dixon的方法［6］測定其抑制常數(shù). 方法為：在1 mL離心管中加入50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液與濃度為1 mmol/L的胰蛋白酶20 μL，分別加入不同量環(huán)頸雉卵蛋白酶抑制劑（已經(jīng)純化），于25 ℃下水浴15 min. 最后加入發(fā)色底物（B-3133）20 μL，用紫外分光光度計連續(xù)測2 min的吸光值，與對照組比較. 對照組加同體積不含環(huán)頸雉卵蛋白酶抑制劑的50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液. 用抑制常數(shù)（Ki）公式處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，公式為Ki=[I]/（V0/V1+1），式中[I]是環(huán)頸雉卵清胰蛋白酶抑制劑物質(zhì)的量濃度，V0是對照組反應(yīng)速度，V1是含抑制劑組的反應(yīng)速度.

2.2.6 環(huán)頸雉卵清蛋白酶抑制劑的熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性

參考Tzeng［9］等的方法檢測分離純化到的環(huán)頸雉卵清蛋白酶抑制劑的熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性. 簡述如下：檢測熱穩(wěn)定性時分別在30，40，50，60，70，80，90，100 ℃的梯度中，將最終質(zhì)量濃度40 nmol/L的純化樣品水浴10 min，再冷卻（置于冰中），最后用胰蛋白酶測其抑制劑活性. 檢測酸堿穩(wěn)定性是將純化后的樣品與pH 2.0～5.0的50 mmol/L甘氨酸-HCl緩沖液、pH 6.0～8.0的50 mmol/L磷酸緩沖液、pH 9.0～10.0的50 mmol/L 甘氨酸-NaOH緩沖液、pH 10.0的 50 mmol/L磷酸-NaOH緩沖液等體積混合，形成20 nmol/L的待檢測樣品. 在25 ℃條件下靜置10 min后檢測其殘留抑制劑活性，比較不同pH時抑制劑的活性，可得知環(huán)頸雉卵中蛋白酶抑制劑的酸堿穩(wěn)定性.

3 結(jié)果與分析

3.1 環(huán)頸雉卵中蛋白酶抑制劑的分離純化

環(huán)頸雉卵清樣品經(jīng)Sephadex G-50凝膠過濾層析圖譜見圖1，圖1結(jié)果顯示為1個峰. 用胰蛋白酶測定其抑制活性（底物為B-3133），結(jié)果顯示為活性峰. 收集并冷凍干燥，獲得的凍干粉用Sephadex G-75凝膠過濾，最終圖2顯示為2個峰. 分別用胰蛋白酶測定其抑制活性，第二個峰箭頭所指為活性峰，收集并冷凍干燥備用.

3.2 SDS-PAGE電泳

由電泳結(jié)果可知（圖3），使用SDS-PAGE電泳經(jīng)二步凝膠過濾純化的卵清蛋白酶抑制劑（lane 4）結(jié)果僅顯示一條深色條帶，其表觀分子量約為40 kDa.

分離純化環(huán)頸雉卵清蛋白酶抑制劑各步的SDSPAGE電泳分析中，Lane 1為卵清初樣，Lane 2 和Lane 3為Sephadex G-50活性峰，Lane 4為Sephadex G-75活性峰，Lane 5為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn).

3.3 環(huán)頸雉卵清中蛋白酶抑制劑活性檢測及抑制常數(shù)的確定

經(jīng)二步凝膠過濾純化的環(huán)頸雉卵清蛋白酶抑制劑檢測結(jié)果見圖4. 結(jié)果顯示，該抑制劑能抑制胰蛋白酶水解底物的活性，其抑制胰蛋白酶的最低濃度為60.0 nmol/L（箭頭所指）. 當(dāng)該抑制劑與胰蛋白酶保溫0～24 h后，仍保持胰蛋白酶抑制劑活性（見圖5），說明其對胰蛋白酶的抑制效果具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性.

用抑制常數(shù)（Ki）公式處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，經(jīng)純化后產(chǎn)品的常數(shù)為0.16 nmol/L.

在25 ℃的熱水中，將各濃度純化的環(huán)頸雉卵清蛋白酶抑制劑分別與等量胰蛋白酶水浴15 min，然后測定胰蛋白酶的剩余水解活性.

胰蛋白酶與反應(yīng)體系緩沖溶液和純化的環(huán)頸雉卵清蛋白酶抑制劑在25 ℃溫育0～24 h，然后檢測胰蛋白酶的剩余水解活性.

3.4 環(huán)頸雉卵清蛋白酶抑制劑的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性

圖1 環(huán)頸雉卵清經(jīng)SephadexG50分離洗脫峰圖

圖2 經(jīng)SephadexG-50凝膠過濾層析所得活性峰經(jīng)SephadexG-75凝膠過濾分離洗脫圖

圖3 分離純化環(huán)頸雉卵清蛋白酶抑制劑各步的SDS-PAGE電泳分析

圖4 純化的環(huán)頸雉卵清蛋白酶抑制劑對胰蛋白酶的抑制劑活性

對純化后的蛋白酶抑制劑進(jìn)行基本特性的相關(guān)研究，結(jié)果表明（見圖6、圖7），當(dāng)溫度在30～80 ℃時，環(huán)頸雉卵清蛋白酶抑制劑的穩(wěn)定性維持在高于85%的程度；但當(dāng)溫度高于80 ℃時，該蛋白酶抑制劑對特異性底物無水解活性. 環(huán)頸雉卵清蛋白酶抑制劑具有廣泛的酸堿穩(wěn)定性，當(dāng)pH范圍為2～10時，抑制劑活性可一直維持在高于90%的程度，體現(xiàn)了其良好的酸堿穩(wěn)定性.

4 結(jié)論

本研究通過凝膠層析技術(shù)和發(fā)色底物檢測方法，從環(huán)頸雉卵清中分離出一種蛋白酶抑制劑.對其進(jìn)行熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在30～80 ℃范圍內(nèi)有較好的熱穩(wěn)定性；在pH 2～10的范圍內(nèi)具有良好的酸堿穩(wěn)定性. 使用SDS-PAGE電泳經(jīng)純化的卵清蛋白酶抑制劑，結(jié)果顯示為1條單一深色條帶，表觀分子量約為40 kDa.

目前，有關(guān)鳥卵中的抑制劑研究相對較少，僅見有少數(shù)家禽卵的抑制劑研究［10-11］，且基本都屬于半光氨酸蛋白酶抑制劑. 因此，本研究不僅首次報道了一種來源于環(huán)頸雉卵清中抑制劑分離純化及性質(zhì)的研究結(jié)果，而且為禽卵中的抑制劑增加了新的成員.

圖5 純化的環(huán)頸雉卵清蛋白酶抑制劑對胰蛋白酶抑制劑活性的時間穩(wěn)定性

圖6 溫度對胰蛋白酶抑制活性的影響

圖7 pH對胰蛋白酶抑制活性的影響