童 琳，丁 寧，李佳旻，徐曉波，張 勇，葉茂松，李 春，張 新，洪群英，周 建，白春學(xué)，胡 潔

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科，上海市呼吸病研究所，上海 200032

腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutational burden, TMB)是免疫檢查點(diǎn)(如PD-1/PD-L1)抑制劑治療晚期肺癌療效的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物之一[1-4]。多項(xiàng)臨床研究[5-8]采用二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)檢測(cè)腫瘤組織的TMB，發(fā)現(xiàn)實(shí)體瘤患者免疫治療的生存獲益與高TMB相關(guān)。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，在表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)突變患者中，EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)治療的療效和預(yù)后與TMB密切相關(guān)，但與免疫治療的情況相反，即高TMB患者經(jīng)EGFR-TKI治療后的總生存期和至治療停止時(shí)間(TTD)均較中低TMB患者縮短。

約20%的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者具有EGFR敏感突變，包括常見的19外顯子缺失、L858R，以及罕見的L861Q、G719S等。EGFR-TKIs靶向治療能改善晚期肺癌患者的預(yù)后，提高中位無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)至12個(gè)月，客觀緩解率達(dá)70%[10]。在具有間變性淋巴瘤激酶(ALK)融合基因(約5%NSCLC患者)、活性氧簇-1(ROS-1)融合基因(約1%NSCLC患者)、Met 14外顯子跳躍式突變(約4%NSCLC患者)等驅(qū)動(dòng)突變的晚期肺癌患者中，克唑替尼治療的客觀緩解率可達(dá)60%，中位無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)為7～19個(gè)月[11-15]。然而，不同患者間TKIs治療的緩解持續(xù)時(shí)間存在較大差異，目前尚缺乏提示其療效的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。因此，本研究采用靶向富集目標(biāo)基因NGS技術(shù)，對(duì)晚期肺癌患者的腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行包含416個(gè)腫瘤相關(guān)基因的檢測(cè)，分析腫瘤組織TMB水平與TKIs靶向治療療效的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2016年1月～2018年1月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院接受一線TKIs靶向治療，存在敏感驅(qū)動(dòng)突變的51例亞裔晚期NSCLC患者。主要入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>18歲；(2)經(jīng)支氣管鏡或經(jīng)皮肺穿刺原發(fā)灶活檢，確診為原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌；(3)經(jīng)全身影像學(xué)檢查，根據(jù)國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)(IASLC)第8版肺癌TNM分期評(píng)估為ⅢB～Ⅳ期肺癌；(4)予一線 TKIs靶向治療，包括一代或二代EGFR-TKIs和克唑替尼；(5)能夠提供足夠的腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行NGS。主要排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有除原發(fā)性肺癌外的其他惡性腫瘤；(2)懷孕。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(B2016-154R)，所有患者均簽署知情同意書。

最終本研究共納入51例晚期肺癌患者，中位年齡為61歲(28～71歲)，其中27例(53%)為女性，41例(80%)無(wú)吸煙史。病理診斷：腺癌44例(86%)，腺鱗癌3例(6%)，鱗癌3例(6%)，病理類型不確定的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC-NOS)1例(2%)。中位隨訪時(shí)間為18個(gè)月?；颊咭话闱闆r見表1。

表1 患者一般情況

NSCLC-NOS：病理類型不確定的非小細(xì)胞肺癌；EGFR-TKIs：表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑；ECOG-PS：美國(guó)東岸癌癥臨床研究合作組織-體力狀況評(píng)分

1.2 基因檢測(cè) 收集51例患者的支氣管鏡或經(jīng)皮肺穿刺活檢腫瘤組織標(biāo)本，送南京世和基因生物技術(shù)有限公司進(jìn)行NGS檢測(cè)。同時(shí)采集靜脈血用于陰性對(duì)照，以判斷種系突變。

1.2.1 樣本處理 腫瘤標(biāo)本：取經(jīng)甲醛固定和石蠟包埋(FFPE)的腫瘤組織6～10 μm(n≥5)，用蘇木精-伊紅(H-E)染色后，由病理專家判斷其中腫瘤細(xì)胞含量；采用腫瘤細(xì)胞含量大于10%的組織。血漿樣本：用EDTA抗凝管收集8～10 mL外周血，于2 h內(nèi)分離血漿(1 800 ×g，離心10 min)，白細(xì)胞沉淀用于陰性對(duì)照。

1.2.2 DNA提取和文庫(kù)準(zhǔn)備 采用Qiagen公司試劑盒提取組織和白細(xì)胞DNA。測(cè)序文庫(kù)使用KAPA Hyper Prep試劑盒(KAPA Biosystems)進(jìn)行制備。PCR擴(kuò)增和文庫(kù)純化后進(jìn)行目標(biāo)基因富集。

1.2.3 目標(biāo)基因富集和測(cè)序 DNA文庫(kù)加標(biāo)簽后，將多個(gè)樣本混合，得到總量為2 μg的DNA混合文庫(kù)。用定制的生物素型DNA探針(GeneseeqOneTM)，對(duì)文庫(kù)中416個(gè)癌癥相關(guān)基因的編碼區(qū)域和16個(gè)基因的內(nèi)含子進(jìn)行雜交、捕獲。用Illumina p5、p7引物和KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA Biosystems)對(duì)文庫(kù)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，富集得到的文庫(kù)在HiSeq4000(Illumina)平臺(tái)上用2×150 bp測(cè)序試劑盒(Illumina)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理 用Trimmomatic 25軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，去除低質(zhì)量堿基或N堿基，并通過(guò)BWA(Burrows-Wheeler Aligner)將過(guò)濾后的數(shù)據(jù)與參考序列hg19基因組(Human Genome version 19)對(duì)比。采用GATK(Genome Analysis Toolkit)分析單核苷酸變異(SNV)和插入缺失突變(indel)；經(jīng)單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)(dbSNP)和國(guó)際千人基因組計(jì)劃分析后去除常見變異。

1.4 TMB計(jì)算及分組 TMB定義為編碼區(qū)1 Mb堿基中所含有的腫瘤特有突變的個(gè)數(shù)。將腫瘤樣本與白細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，分析體細(xì)胞突變，去除種系突變。TMB包括編碼區(qū)域SNV(含錯(cuò)義突變和同義突變)和插入缺失突變，而去除原發(fā)性肺癌中驅(qū)動(dòng)基因突變和常見抑癌基因的截短突變和移碼突變。根據(jù)Offin等[9]研究，采用三分法將51例患者分為高TMB組(TMB≥8)和中低TMB組(TMB<8)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者的基本資料及基因突變情況比較 51例患者的中位TMB水平為6.2個(gè)突變/Mb。高TMB組患者的中位TMB為10.6個(gè)突變/Mb，中低TMB組患者的中位TMB為3.7個(gè)突變/Mb。兩組患者的一般情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。兩組患者的基因突變情況見表2。

表2 患者的基因突變信息

EGFR：表皮生長(zhǎng)因子受體；ALK：間變性淋巴瘤激酶；HER2：人表皮生長(zhǎng)因子受體-2；TMB：腫瘤突變負(fù)荷

2.2 TP53基因突變對(duì)TMB的影響 高TMB組患者合并TP53突變的頻率(50%)較中低TMB組(40%)高(表2)。TP53突變患者的TMB與野生型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 TP53突變對(duì)腫瘤組織TMB的影響

2.3 吸煙對(duì)TMB的影響 高TMB組患者中有吸煙史的患者占比高于(37%)中低TMB組(11%，表1)。有吸煙史患者的TMB高于無(wú)吸煙史患者(P=0.046，圖2)。

圖2 吸煙對(duì)組織TMB的影響

2.4 TMB與TKIs靶向治療療效的關(guān)系 Log-rank分析(圖3A)顯示：中低TMB組患者的中位PFS顯著長(zhǎng)于高TMB組患者(410 dvs217 d，HR=0.331，95% CI 0.165～0.665，P=0.001 2)。亞組分析(圖3B)顯示：在男女性、有無(wú)吸煙史、合并TP53基因突變與否患者中，中低TMB組患者的中位PFS均長(zhǎng)于高TMB組患者(P<0.05)；在腺癌、EGFR突變、EGFR 19外顯子缺失、EGFR L858R患者中，中低TMB組患者的中位PFS均長(zhǎng)于高TMB組患者(P<0.05)；在非腺癌患者中，中低TMB組患者的中位PFS有長(zhǎng)于高TMB組患者的趨勢(shì)(HR=0.286，95%CI 0.05～1.77，P=0.15)。Log-rank分析(圖3C)顯示：在EGFR突變患者中，經(jīng)EGFR-TKIs治療后，中低TMB組患者的中位PFS長(zhǎng)于高TMB組患者(410 dvs189 d，HR=0.256，95% CI 0.108～0.608，P=0.002)。

圖3 TMB與患者PFS的相關(guān)性

3 討 論

目前認(rèn)為在免疫治療中，高TMB與治療反應(yīng)的關(guān)系是基于增加的腫瘤特異性新生抗原負(fù)荷。而在靶向治療中，高TMB水平可能與耐藥通路增加或腫瘤亞克隆導(dǎo)致臨床耐藥相關(guān)。Offin等研究[9]發(fā)現(xiàn)，EGFR突變患者中，EGFR-TKIs的療效、患者預(yù)后與TMB密切相關(guān)，與免疫治療情況相反。然而，這項(xiàng)研究中僅納入了EGFR 19外顯子缺失和L858R突變的Ⅳ期肺癌患者，且其中92%的患者接受了厄洛替尼治療，因此該結(jié)論可外推的范圍有限。此外，該研究的療效衡量指標(biāo)采用TTD，而由于多數(shù)采用靶向治療的患者在疾病緩慢進(jìn)展時(shí)仍繼續(xù)使用TKIs，因此TTD與PFS在靶向治療的療效評(píng)估中存在一定差異。本研究采用PFS作為靶向治療療效的評(píng)估指標(biāo)，且包括ⅢB～Ⅳ期患者，同時(shí)納入了EGFR突變(包括非常見EGFR突變)及 ALK融合、ROS-1融合等相對(duì)少見突變類型的患者，治療藥物包括一代及二代EGFR-TKIs(吉非替尼、厄洛替尼、?？颂婺帷⒎ㄌ婺?和克唑替尼。因此本研究更貼近真實(shí)世界情況，結(jié)論的可外推范圍更廣。

Offin等[9]發(fā)現(xiàn)，TP53突變與疾病至進(jìn)展時(shí)間短有關(guān)，高TMB組患者中TP53突變者的比例高于中低TMB組，但多因素分析中校正TP53突變狀態(tài)后仍顯示高TMB水平與患者預(yù)后差相關(guān)。本研究結(jié)果與該研究相一致，提示合并TP53突變對(duì)TMB預(yù)測(cè)TKIs在晚期肺癌患者中的療效無(wú)明顯影響。

本研究結(jié)果提示，在具有敏感驅(qū)動(dòng)突變的晚期肺癌患者中，中低TMB組患者靶向治療PFS較高TMB組患者明顯延長(zhǎng)，且在亞組分析中得出了相似結(jié)論，提示TKIs靶向治療對(duì)中低TMB組患者的療效優(yōu)于高TMB組患者。然而，本研究尚存在一定缺陷，包括：缺乏總生存期數(shù)據(jù)，無(wú)法分析TMB與預(yù)后的關(guān)系；非前瞻性研究；樣本量較少等。今后需進(jìn)一步設(shè)計(jì)前瞻性臨床研究，并擴(kuò)大研究隊(duì)列的樣本量，以進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)論。