楊雄，曾保堯，左江偉

(廣西醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院，南寧530031)

血液透析是終末期腎病(ESRD)患者主要的治療與生存手段，而具有高通暢率、少并發(fā)癥等優(yōu)勢的自體動靜脈內(nèi)瘺(AVF)已經(jīng)成為首選血液透析通路[1,2]。但研究[3]表明，AVF在建立1年后的狹窄率仍可達40%，這也是血透患者需要進行多次手術(shù)的主要原因所在，同時也給患者與社會帶來非常沉重的經(jīng)濟負擔[4]。如何更好的解決AVF術(shù)后狹窄以建立更長久穩(wěn)定的血透通路，已經(jīng)成為?？漆t(yī)生十分棘手的難題。自噬是細胞內(nèi)自我降解過程，普遍存在于大部分真核生物細胞中，可平衡細胞能量來源并調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)。在生理條件下，自噬作用會將細胞質(zhì)成分匯集到自噬溶酶體中進行降解，是細胞死亡行為的替代方式，在應激條件下，還可出現(xiàn)自身適應性反應，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。自噬在動脈粥樣硬化等血管性疾病進展中有著重要作用，但自噬在AVF術(shù)后內(nèi)膜增生中的表達情況目前尚不清楚。自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62的表達量可以體現(xiàn)自噬活性的高低。Beclin-1是參與調(diào)節(jié)自噬起始階段的重要蛋白，LC3-Ⅱ參與調(diào)節(jié)自噬體的形成，而P62作為自噬底物，在自噬過程中不斷被消耗。2018年8月1日～2019年1月1日，本研究對自體動靜脈內(nèi)瘺術(shù)后新西蘭兔吻合口靜脈端頸外靜脈內(nèi)膜厚度及自噬相關(guān)蛋白的表達進行觀察，并探討其相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 新西蘭兔、AVF手術(shù)方法及分組 30只雄性新西蘭兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供。將30只新西蘭兔用10%水合氯醛麻醉，呈仰臥位固定在操作臺上，剔除頸部兔毛、消毒、鋪無菌孔巾后切開皮膚，解剖分離出左側(cè)頸總動脈和頸外靜脈，分別用兩個小動脈和小靜脈血管夾將動靜脈的兩端進行夾閉，以水平約呈30 °角剪斷頸外靜脈，然后用尖刀沿左側(cè)頸總動脈長軸方向劃開約5 mm開口，用肝素鈉鹽水沖洗干凈，之后用7-0血管縫線進行端-側(cè)吻合，用絲線結(jié)扎頸外靜脈遠心端，記為實驗組；同時解剖分離右側(cè)頸總動脈和頸外靜脈，不予其它處理，記為對照組；最后縫合頸正中切口。分別于術(shù)后第1周(T1)、第2周(T2)、第4周(T3)時用上述同樣方法麻醉及固定動物，并沿同切口切開，實驗組在吻合口靜脈端取一段頸外靜脈，對照組在相對應位置取一段頸外靜脈。將取得的靜脈分成兩段，一段放置于4%多聚甲醛溶液中保存?zhèn)錂z，另一段-80 ℃保存?zhèn)錂z。

1.2 兔頸外靜脈內(nèi)膜厚度測算 采用HE染色法。取4%多聚甲醛溶液中保存的頸外靜脈組織，常規(guī)無水乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、烤片、脫蠟，Harris氏蘇木素、1%水溶性伊紅染液染色，脫水、透明、風干后用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并測算頸外靜脈內(nèi)膜厚度。

1.3 兔頸外靜脈Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62蛋白檢測 采用Western blotting法。取-80 ℃保存的頸外靜脈組織剪碎后按比例加入裂解液充分裂解，離心后收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度并將所有樣品調(diào)至等濃度。每100 μL蛋白樣品中加入25 μL 5倍SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液充分變性后，SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳，Beclin-1、P62用0.45 μm的PVDF轉(zhuǎn)膜1.5 h，LC3-Ⅱ用0.22 μm的PVDF轉(zhuǎn)膜30 min，將PVDF膜取出，用TBST漂洗后，常溫孵育1 h，用TBST漂洗后將膜正面朝下貼在一抗上，4 ℃孵育過夜，之后孵育二抗，在Oddsey掃描儀上掃描洗好的膜，用Oddsey v3.0軟件對掃描結(jié)果進行分析，以熒光強度表示目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 兔頸外靜脈內(nèi)膜厚度比較 實驗組T1、T2、T3時兔頸外靜脈內(nèi)膜厚度(見圖1)分別為(28.94±2.36)、(36.71±3.64)、(67.51±6.40)μm，對照組T1、T2、T3時分別為(16.96±3.76)、(17.20±3.68)、(17.12±3.59)μm，兩組同一時間點相比，P均<0.05；實驗組T2、T3時的頸外靜脈內(nèi)膜厚度與T1時相比，P均<0.05；對照組內(nèi)各時間點相比，P均>0.05。

圖1 兔頸外靜脈內(nèi)膜厚度(HE染色，400×)

2.2 兔頸外靜脈Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62蛋白相對表達量比較 結(jié)果見表1。

表1 兔頸外靜脈Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62蛋白相對表達量比較

注：與對照組同一時間點相比，﹡P<0.05；與本組內(nèi)T1時相比，﹟P<0.05；與本組內(nèi)T2時相比，△P<0.05。

2.3 實驗組兔頸外靜脈內(nèi)膜厚度與自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62的相關(guān)性 實驗組兔頸外靜脈內(nèi)膜厚度與Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達均呈正相關(guān)(r分別為0.887、0.919，P均<0.01)，與P62蛋白呈負相關(guān)(r=-0.788，P<0.01)。

3 討論

研究[5]發(fā)現(xiàn)，AVF狹窄最主要機制是靜脈內(nèi)膜增生，學者們通過對人體AVF狹窄的內(nèi)膜進行分析得出，在增生內(nèi)膜細胞的構(gòu)成當中，肌成纖維細胞為主要組成因素。Li等[6]通過對動物AVF模型分析得知，靜脈內(nèi)膜里的肌成纖維細胞是從外膜中的成纖維細胞轉(zhuǎn)化并遷移而來。但外膜細胞如何遷移到內(nèi)膜，以及成纖維細胞怎樣轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞的具體機制尚不明確，目前認為，這一轉(zhuǎn)移過程與血管內(nèi)皮細胞損傷、血流動力學改變、炎癥及氧化應激等有著密切的關(guān)系，并且這些因素之間相輔相成，產(chǎn)生的眾多細胞因子間構(gòu)成了復雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，聯(lián)合推動內(nèi)膜組織細胞數(shù)目的增加[7]。

自噬是溶酶體對于細胞當中已經(jīng)衰老破損的蛋白質(zhì)及其相關(guān)物質(zhì)進行自然分解，從而保持細胞穩(wěn)定的一種狀態(tài)，主要有兩方面的體現(xiàn)。其一，自噬在基礎(chǔ)水平下對細胞內(nèi)物質(zhì)進行更新，維持細胞功能；其二，在外界環(huán)境改變，如氧化應激、損傷等條件下，自噬被激活上調(diào)，通過清除這些受損的細胞器以及回收可利用的產(chǎn)物等途徑來維持細胞功能，減少損傷。如果在外界持續(xù)強烈的刺激下，可能會導致細胞出現(xiàn)過度自噬而發(fā)生程序性的死亡，造成細胞功能障礙，參與疾病的發(fā)展[8,9]。Beclin-1-Ⅲ型胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(PI3K)是一條對自噬有著非常重要作用的調(diào)節(jié)通路，此通路表現(xiàn)的上增性調(diào)節(jié)能夠?qū)ψ允善鸬酵苿幼饔肹10]；LC3-Ⅰ在自噬體形成過程中能夠轉(zhuǎn)化為在自噬體膜的LC3-Ⅱ，提示自噬活性的程度高低與LC3-Ⅱ表達程度密不可分[11]；自噬底物P62在自噬活動中會被分解，提示自噬活性與P62表達程度呈負相關(guān)[12]。因此，自噬水平高低可通過自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ以及自噬底物P62表達程度來加以判斷。

Xie等[13]在研究心肌缺血再灌注損傷中發(fā)現(xiàn)，心肌細胞的自噬現(xiàn)象在缺血缺氧的環(huán)境中被激活上調(diào)，通過增強的自噬作用可使心肌細胞免于外界損傷，最終讓心梗面積減少。Karim等[14]在研究抗動脈粥樣硬化中，通過腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路使自噬水平上調(diào)來抑制平滑肌細胞增殖。Liu等[15]在研究動物腎病模型中，通過外界干預措施使得自噬作用增加，能顯著抑制系膜細胞的增殖。總而言之，當機體遭受外來刺激，細胞自噬現(xiàn)象增強或者通過其他途徑上調(diào)自噬水平能對機體起到保護作用，延緩疾病的發(fā)展。在AVF建立后，靜脈壁會長期處于高壓高氧的動脈血中，造成細胞的損傷，導致細胞內(nèi)環(huán)境的紊亂，為使細胞免于損傷以維護細胞功能的穩(wěn)定，自噬現(xiàn)象能否被激活上調(diào)來發(fā)揮保護作用目前尚不確定。當前對于AVF狹窄與自噬現(xiàn)象的研究甚少，最近有學者[15]提出自噬參與了AVF狹窄的過程，但未能進一步闡述內(nèi)膜增生與自噬之間的關(guān)系。本研究中，對照組各時間點之間對比，頸外靜脈內(nèi)膜厚度以及Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表達均無差異，說明在未進行動靜脈吻合時，無論暴露時間長短，靜脈內(nèi)膜細胞均無增生及自噬現(xiàn)象的增強。通過實驗組與對照組各時間點之間進行對比，實驗組各時間點的頸外靜脈內(nèi)膜厚度均有明顯增加，提示AVF術(shù)后頸外靜脈內(nèi)膜出現(xiàn)了增生；Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白在T1、T2、T3時表達均增高，表明了AVF術(shù)后自噬現(xiàn)象被激活上調(diào)，而P62蛋白表達均顯著下降，從而更進一步證實了AVF術(shù)后自噬水平的上升。本研究結(jié)果顯示，在AVF術(shù)后同時出現(xiàn)了靜脈內(nèi)膜增生與自噬表達上調(diào)，說明了自噬參與了AVF術(shù)后內(nèi)膜增生過程。進一步通過實驗組各時間點之間的對比，我們發(fā)現(xiàn)，從第1周到第4周，靜脈內(nèi)膜逐步增厚，Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表達均呈遞增趨勢，P62蛋白的表達呈遞減趨勢，提示自噬水平逐漸增強。由此可知，在AVF術(shù)后靜脈內(nèi)膜增生與自噬強度呈現(xiàn)出正相關(guān)，即自噬活性越強，內(nèi)膜增生越顯著，推測自噬與靜脈內(nèi)膜增生存在由因及果的關(guān)系。

在內(nèi)瘺建立后，如果可以通過外界干預來抑制自噬的活性的前提下，能否預防內(nèi)膜增生，最終使得內(nèi)瘺壽命更長久，尚無法下這樣的結(jié)論。首先，本研究只是推測兩者存在因果關(guān)系；其次，自噬有助于內(nèi)瘺的成熟，如果對自噬干預過早，可能會更快的造成內(nèi)瘺失活。在AVF形成之后，靜脈壁所面對的刺激是持續(xù)的，因此可能存在過度自噬的現(xiàn)象，自噬反而參與介導內(nèi)膜細胞進一步增生，加速內(nèi)瘺狹窄的步伐。因此，想通過對自噬的調(diào)節(jié)來防治內(nèi)瘺狹窄，不僅需要更進一步證實兩者間的因果關(guān)系，還需要對內(nèi)瘺成熟的過程和狹窄形成中的過度自噬現(xiàn)象等有更深的研究。

綜上所述，自噬不僅參與了AVF術(shù)后靜脈內(nèi)膜增生的過程，并且兩者表現(xiàn)出正相關(guān)，即自噬活性增強過程中內(nèi)膜增生顯著。本研究對更深入的研究自噬在AVF術(shù)后內(nèi)膜增生中的作用提供一種方向和依據(jù)，也為內(nèi)瘺狹窄的防治闡述了一種新思路。