張宇，馬莉，沈雪，方宗宇，林晶

(1 貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴陽550004；2 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種主要侵犯脊柱、骶髂關(guān)節(jié)并可不同程度累及周圍關(guān)節(jié)的慢性炎性自身免疫性疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國AS患病率在0.24%左右，多見于青年男性[2]。AS病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未明確，其發(fā)病可能與環(huán)境、感染、遺傳以及自身免疫調(diào)節(jié)功能紊亂等因素有關(guān)[3]。淋巴細(xì)胞亞群是反映機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)，其比例失衡及功能異常是自身免疫性疾病的發(fā)病因素之一。因此，對AS進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測，全面了解患者的免疫狀態(tài)，對正確判斷患者的病情尤為重要。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測算AS患者外周血淋巴細(xì)胞亞群T淋巴細(xì)胞(CD3+)、抑制性T細(xì)胞(CD3+CD8+)、輔助性T細(xì)胞(CD3+CD4+)、B淋巴細(xì)胞(CD3-CD19+)和NK細(xì)胞(CD16+CD56+)的細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)及百分比，分析其與AS疾病活動度及炎性活動指標(biāo)間的相關(guān)性，探討淋巴細(xì)胞亞群在AS發(fā)生發(fā)展及病情活動監(jiān)測中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年9月～2018年10月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的AS患者39例，記為AS組，男32例、女7例，年齡16～48歲(28.87±8.31)歲，病程1個月～22年，平均病程(5.17±5.52)年，人類白細(xì)胞抗原HLA-B27均為陽性，采用疾病活動指數(shù)評分表(BASDAI)對AS患者進(jìn)行評分，平均(3.88±2.04)分。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(ACR)1984年修訂的AS診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；②未接受過抗風(fēng)濕藥物及生物制劑等治療的初診患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他免疫相關(guān)性疾病和風(fēng)濕性疾??；②合并血液系統(tǒng)及心、肝、腎等疾病患者；③妊娠期或哺乳期女性；④近期有感染史者。同期選取在貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院體檢健康者41例，記為正常對照組，男33例、女8例，年齡18～45歲(27.05±6.63)歲。兩組間年齡、性別資料具有可比性。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，研究對象均告知研究內(nèi)容并簽署知情同意書。

1.2 儀器及試劑 FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，WXH微型旋渦混合器購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，低速離心機(jī)購自上海手術(shù)器械廠，CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP-Cy5.5/CD4-PE-Cy7/CD19-APC/CD8-APC-Cy7六色組合熒光抗體購自北京同聲時代生物技術(shù)有限公司，HLA-B27檢測試劑盒、磷酸緩沖液(PBS)、FACSTMLysing solution紅細(xì)胞裂解液以及TrucountTMTubes流式專用計(jì)數(shù)管均購自美國BD公司。

1.3 兩組外周血淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)及百分比測算 研究對象于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集肘靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，收集血清50 μL，加入含6 μL淋巴細(xì)胞亞群組合抗體的流式專用計(jì)數(shù)管中，輕輕渦旋混勻，室溫避光孵育30 min，加入10%紅細(xì)胞裂解液2 mL，混勻后室溫避光孵育10 min，待紅細(xì)胞完全溶解后，渦旋混勻，上流式細(xì)胞儀檢測，采用Canto自動軟件計(jì)算各淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)，并測算各淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分比。

1.4 兩組外周血炎性活動指標(biāo)紅細(xì)胞沉降率(ESR)、超敏C反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)檢測 研究對象于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集肘靜脈血5 mL，置于不添加抗凝劑的采血管中，3 000 r/min離心15 min，收集血清，采用魏氏法檢測ESR，采用散射比濁法檢測Hs-CRP。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)及細(xì)胞百分比比較 兩組外周血淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)及細(xì)胞百分比比較見表1。由表1可知，與正常對照組相比，AS組患者外周血淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)均降低(P均<0.05)，CD3+CD4+、CD3-CD19+細(xì)胞百分比均升高(P均<0.05)，CD3+CD8+、CD16+CD56+細(xì)胞百分比均降低(P均<0.05)。

表1 兩組外周血淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)及細(xì)胞百分比比較

注：與正常對照組相比，*P<0.05。

2.2 兩組外周血炎性活動指標(biāo)ESR、Hs-CRP水平比較 AS組外周血ESR、Hs-CRP水平分別為(29.79±12.14)mm/h、(15.93±12.39)mg/L，正常對照組外周血ESR、Hs-CRP水平分別為(7.32±3.27)mm/h、(2.05±1.42)mg/L，兩組相比，P均<0.01。

2.3 AS患者外周血淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)及百分比與BASBAI評分、ESR水平、Hs-CRP水平的相關(guān)性分析結(jié)果 CD3+細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)與Hs-CRP水平呈負(fù)相關(guān)(r為-0.471，P<0.05)；CD3+CD4+細(xì)胞百分比與BASDAI評分、ESR水平、Hs-CRP水平呈正相關(guān)(r分別為0.607、0.484、0.359，P均<0.05)；CD3+CD8+細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)與BASDAI評分、ESR水平、Hs-CRP水平呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.546、-0.406、-0.526，P均<0.05)，CD3+CD8+細(xì)胞百分比與BASDAI評分、ESR水平呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.406、-0.331，P均<0.05)；CD3-CD19+細(xì)胞百分比與Hs-CRP水平呈正相關(guān)(r為0.374，P<0.05)；CD16+CD56+細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)與BASDAI評分、ESR水平呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.574、-0.375，P均<0.05)，CD16+CD56+細(xì)胞百分比與BASDAI評分、ESR水平呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.445、-0.336，P均<0.05)。

CD3+細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)與BASDAI評分、ESR水平無關(guān)(r分別為-0.285、-0.180，P均>0.05)，CD3+細(xì)胞百分比與BASDAI評分、ESR水平、Hs-CRP水平無關(guān)(r分別為0.214、0.111、-0.122，P均>0.05)；CD3+CD4+細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)與BASDAI評分、ESR水平、Hs-CRP水平無關(guān)(r分別為0.012、0.099、-0.183，P均>0.05)；CD3+CD8+細(xì)胞百分比與Hs-CRP水平無關(guān)(r為-0.297，P>0.05)；CD3-CD19+細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)與BASDAI評分、ESR水平、Hs-CRP水平無關(guān)(r分別為-0.042、0.067、0.050，P均>0.05)，CD3-CD19+細(xì)胞百分比與BASDAI評分、ESR水平無關(guān)(r分別為0.279、0.277，P均>0.05)；CD16+CD56+細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)及百分比與Hs-CRP水平無關(guān)(r分別為-0.242、-0.111，P均>0.05)。

3 討論

AS是一種好發(fā)于青年男性的慢性炎性自身免疫性疾病，以中軸脊柱、骶髂關(guān)節(jié)受累為主，可伴發(fā)外周關(guān)節(jié)表現(xiàn)，嚴(yán)重者可發(fā)生脊柱畸形和關(guān)節(jié)強(qiáng)直。AS臨床多表現(xiàn)為中軸及外周關(guān)節(jié)病變，還可累及眼、心、肺、腎和胃腸道等外周組織和器官[5]。AS發(fā)病起初緩慢且不易察覺，然而隨著病情的發(fā)展，癥狀逐漸加重，極大地提高患者的致殘風(fēng)險，嚴(yán)重影響患者的身心健康。關(guān)于AS的病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。大量實(shí)驗(yàn)[6]證明，AS發(fā)病機(jī)制與T淋巴細(xì)胞異常激活、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能紊亂、淋巴細(xì)胞亞群比例失衡或功能異常等因素有關(guān)。本課題組前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，AS患者中存在CD4+T淋巴細(xì)胞亞群Th1、Th2、Th17細(xì)胞比例失衡，證實(shí)淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能紊亂與AS有關(guān)。

淋巴細(xì)胞是構(gòu)成免疫系統(tǒng)和執(zhí)行免疫功能的主要細(xì)胞群體，根據(jù)淋巴細(xì)胞在免疫應(yīng)答過程中的功能以及膜表面標(biāo)志科將淋巴細(xì)胞亞群分為T淋巴細(xì)胞(CD3+)、B淋巴細(xì)胞(CD3-CD19+)和NK細(xì)胞(CD16+CD56+)，并根據(jù)表型是否表達(dá)CD4和CD8，將T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步分為輔助性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4+)和抑制性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD8+)[7]。T淋巴細(xì)胞對調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的穩(wěn)定具有重要作用，其中CD3+CD4+T細(xì)胞具有輔助巨噬細(xì)胞活化和B細(xì)胞產(chǎn)生抗體等功能，起誘導(dǎo)細(xì)胞及體液免疫的作用，而CD3+CD8+T細(xì)胞則通過抑制T細(xì)胞活化和B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，抑制細(xì)胞及體液反應(yīng)。CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞之間的相互協(xié)調(diào)和制約能夠產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答，即可清除抗原又不損傷自身組織，其比例失衡是免疫性疾病介導(dǎo)組織損傷的一個重要因素。B淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)機(jī)體中的體液免疫反應(yīng)，其在抗原的刺激下可分化為漿細(xì)胞，通過分泌抗體抵御抗原的侵襲，機(jī)體外周血中成熟B淋巴細(xì)胞水平失衡可以導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。NK細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞之外的第3類免疫細(xì)胞，是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的主要成員。NK細(xì)胞在調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng)中起重要作用，通過釋放細(xì)胞因子對機(jī)體免疫功能加以調(diào)節(jié)，可抑制B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)機(jī)體體液免疫反應(yīng)，同時對T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫也起調(diào)節(jié)作用。目前，淋巴細(xì)胞亞群異常與AS的關(guān)系研究結(jié)果報道不一。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，AS組患者及健康對照組外周血CD3+、CD3+CD8-、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞百分比和CD3+CD8-/CD3+CD8+細(xì)胞比值均沒有明顯的差異。而鄧菊慧等[9]研究發(fā)現(xiàn)，AS組患者中CD3+CD8+細(xì)胞比例較正常對照組明顯升高，CD4+/CD8+細(xì)胞比值倒置，而CD3+、CD3+CD4+細(xì)胞比例變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，AS組患者外周血CD3+CD4+細(xì)胞百分比明顯升高，而CD3+CD8+細(xì)胞百分比明顯下降，細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)顯示CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞數(shù)量減少，表明AS患者機(jī)體內(nèi)存在T淋巴細(xì)胞亞群失衡，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)失衡，造成細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷，這與國內(nèi)學(xué)者徐文莉等[10]研究結(jié)果一致。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，AS患者外周血CD3-CD19+細(xì)胞百分比明顯升高，CD16+CD56+細(xì)胞百分比明顯降低，細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)顯示CD16+CD56+細(xì)胞數(shù)量減少，CD3-CD19+細(xì)胞數(shù)量無明顯變化，提示CD16+CD56+細(xì)胞減少，抑制功能相對不足，可能對CD3-CD19+細(xì)胞增殖分化的抑制作用減弱，從而導(dǎo)致AS患者中CD3-CD19+細(xì)胞異常活化發(fā)生過強(qiáng)的免疫反應(yīng)，與大量分泌自身抗體的CD3-CD19+細(xì)胞出現(xiàn)可能有關(guān)。由此可見，AS患者體內(nèi)不僅存在體液免疫的功能紊亂，而且細(xì)胞免疫中各種T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)和比例失衡在AS的發(fā)病也可能起著重要的作用。AS患者淋巴細(xì)胞亞群與BASDAI評分相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CD3+CD4+細(xì)胞百分比與BASDAI呈正相關(guān)，CD3+CD8+、CD16+CD56+細(xì)胞百分比及絕對計(jì)數(shù)與BASDAI呈負(fù)相關(guān)，提示淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平變化與AS疾病活動度顯著相關(guān)，檢測淋巴細(xì)胞亞群可能對AS疾病活動性、治療效果具有一定的監(jiān)測和評估作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，AS患者外周血中炎性活動指標(biāo)ESR、Hs-CRP明顯高于正常對照組，這與Yavuz等[11]報道結(jié)果一致。在相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，AS患者外周血CD3+CD4+細(xì)胞百分比與ESR呈正相關(guān)，CD3+CD8+細(xì)胞百分比及絕對計(jì)數(shù)與ESR呈負(fù)相關(guān)，CD3+CD4+、CD3-CD19+細(xì)胞百分比與Hs-CRP呈正相關(guān)，而CD3+、CD3+CD8+細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)與Hs-CRP呈負(fù)相關(guān)，說明淋巴細(xì)胞亞群構(gòu)成比改變與炎性活動指標(biāo)ESR、Hs-CRP改變密切相關(guān)，但考慮到本次研究樣本數(shù)量較少，需增加病例數(shù)來進(jìn)一步論證和明確。

綜上所述，AS患者存在明顯的免疫功能異常，以淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量及比例失調(diào)為特征，并且淋巴細(xì)胞亞群的變化與AS患者病情活動度及炎癥程度存在明顯的相關(guān)性。淋巴細(xì)胞亞群的檢測，對于了解患者機(jī)體的免疫狀態(tài)、評估病情以及指導(dǎo)治療具有重要的臨床意義。