徐京京，王曉非

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽110004)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是以表達(dá)自身抗體為特征、多器官多系統(tǒng)受累為表現(xiàn)的自身免疫疾病，免疫功能紊亂是疾病發(fā)生發(fā)展的核心[1]。近年來SLE骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)缺陷學(xué)說在其機(jī)制研究中是一個(gè)熱門觀點(diǎn)。免疫細(xì)胞及相關(guān)因子在輸出骨髓前出現(xiàn)異常，或者說造血干細(xì)胞分化、發(fā)育成免疫細(xì)胞過程中出現(xiàn)缺陷，引起后續(xù)SLE疾病發(fā)生的連鎖反應(yīng)是MSC缺陷學(xué)說的依據(jù)。MSC具有自我更新的屬性和多向分化的潛能，在維持骨髓微環(huán)境穩(wěn)定、免疫抑制及免疫耐受等方面發(fā)揮重要作用，但SLE患者M(jìn)SC可能存在基本屬性缺陷，造成骨髓微環(huán)境的紊亂及造血干細(xì)胞來源的免疫前體細(xì)胞異常，減弱機(jī)體免疫抑制及調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致SLE疾病發(fā)生發(fā)展，這其中MSC增殖缺陷無疑對(duì)MSC的上述作用發(fā)揮起到限制作用[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，MSC數(shù)量增殖減慢與微環(huán)境中活性氧(ROS)蓄積所觸發(fā)的早期衰老有密切聯(lián)系。維生素D及其類似物具有抗衰老、抗氧化、抑制炎癥、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞修復(fù)等多種藥理學(xué)作用。EB1089是一種新型活性維生素D類似物，比生理活性維生素D在細(xì)胞增殖、分化等方面發(fā)揮更廣泛而重要的作用。本研究觀察了年輕的初診SLE患者M(jìn)SC本身是否存在增殖缺陷，然后給予EB1089進(jìn)行干預(yù)，觀察EB1089對(duì)MSC增殖的影響并探討其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年9月～2016年9月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院初次診斷為SLE的年輕患者10例，記為SLE組。SLE組10例患者均為女性，年齡(26.1±2.1)歲，病程3.6(1～9)個(gè)月，疾病活動(dòng)性評(píng)分10～14分，病情評(píng)估均為中度活動(dòng)。10例患者從未使用過激素、免疫抑制劑或其他控制病情藥物，排除感染、腫瘤、長(zhǎng)期慢性疾病及其他自身免疫系統(tǒng)疾病。同期選取年輕的體檢健康者5例，記為健康組。健康組5例均為女性，年齡(26.2±1.9)歲。兩組患者性別、年齡資料具有可比性。本研究獲中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 MSC細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及分組 嚴(yán)格遵守醫(yī)療常規(guī)及操作規(guī)范，無菌條件下抽取兩組患者髂后上棘骨髓液標(biāo)本5 mL，肝素抗凝管收集，4 ℃保存。將骨髓液標(biāo)本移至離心管中，利用加樣管反復(fù)吹打形成單細(xì)胞懸液，離心后吸取上方脂肪層棄去，向管中加入淋巴細(xì)胞分離液Ficoll，分離出單個(gè)核細(xì)胞，并以5×105/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM完全培養(yǎng)液后，置于含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～85%時(shí)進(jìn)行傳代。SLE組患者分離獲得的MSC記為A組，健康組患者分離獲得的MSC記為B組。

1.3 兩組MSC形態(tài)觀察及傳代周期計(jì)算 每24～48 h利用倒置相差顯微鏡及其照相系統(tǒng)對(duì)兩組MSC的生長(zhǎng)速度及細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，同時(shí)記錄原代(P0代)細(xì)胞、第二代(P1代)細(xì)胞培養(yǎng)至融合傳代所需時(shí)間。

1.4 加入不同濃度EB1089后各組MSC增殖能力觀察 采用MTT噻唑藍(lán)比色細(xì)胞增殖試驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的同代A、B組MSC，以1×104個(gè)接種于96孔板，分別記為A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4組，在含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，隔天換液，分別加入0、1、10、100 pmol/L的EB1089或培養(yǎng)基100 μL干預(yù)48 h，吸上清，加入新鮮培養(yǎng)液90 μL及MTT溶液10 μL(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸上清，每孔加入DMSO 100 μL，低速震蕩搖晃10～15分鐘，使用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)量各組MSC的光密度值，以光密度值表示MSC增殖能力。

1.5 加入不同濃度EB1089后各組MSC內(nèi)ROS檢測(cè) 分組方法同“1.4”。各組MSC分別加入0、1、10、100 pmol/L的EB1089或培養(yǎng)基100 μL干預(yù)48小時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入2 mL PBS、5 μL 2′,7′-二氯熒光素二脂(DCFH-DA，10 μmol/L)后，37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，PBS清洗1次，用胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞回縮后加入1 mL培養(yǎng)基終止消化，離心收集細(xì)胞，PBS清洗2次，吸入流式管，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)500 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，以熒光強(qiáng)度表示MSC內(nèi)ROS水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組MSC形態(tài)觀察及傳代周期比較 兩組MSC接種后均能在36 h內(nèi)逐漸貼壁，早期貼壁細(xì)胞呈圓形、折光度好，部分細(xì)胞周圍有光暈存在；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)分裂增生，細(xì)胞兩端形成翼狀突起，逐漸變?yōu)樗笮位虿灰?guī)則多角形，形成大小不等的集落，細(xì)胞呈平行排列或渦狀生長(zhǎng)，兩組MSC在形態(tài)上相似，見圖1。A組P0代細(xì)胞培養(yǎng)至融合傳代需(24.9±0.73)d，B組需(14.2±0.66)d，兩組相比，P<0.05；A組P1代細(xì)胞培養(yǎng)至融合傳代需(14.2±1.48)d，B組需(7.0±0.70)d，兩組相比，P<0.05。

圖1 兩組MSC形態(tài)(×100)

2.2 加入不同濃度EB1089后各組MSC增殖能力比較 A1、A2、A3、A4組細(xì)胞光密度值分別為0.258±0.004、0.322±0.009、0.372±0.004、0.438±0.007，B1、B2、B3、B4組細(xì)胞光密度值分別為0.448±0.007、0.462±0.022、0.473±0.024、0.484±0.012；A1、A2、A3組與B1、B2、B3組相比，P均<0.05；A4組與B4組相比，P>0.05；A1、A2、A3、A4各濃度組內(nèi)兩兩相比，P均<0.05；B1、B2、B3、B4各濃度組內(nèi)兩兩相比，P均>0.05。

2.3 加入不同濃度EB1089后各組MSC內(nèi)ROS比較 A1、A2、A3、A4組ROS熒光強(qiáng)度分別為192.15±10.78、149.69±9.18、139.46±10.05、103.98±11.77，B1、B2、B3、B4組ROS熒光強(qiáng)度分別為75.76±8.34、75.30±7.95、74.61±9.81、74.26±8.46；A1、A2、A3、A4組與B1、B2、B3、B4組相比，P均<0.05；A1、A2、A3、A4各濃度組內(nèi)兩兩相比，P均<0.05；B1、B2、B3、B4各濃度組內(nèi)兩兩相比，P均>0.05。

3 討論

MSC是一類起源于中胚層、具有多向分化潛能和分泌細(xì)胞因子作用的多能基質(zhì)干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能。近年來，在SLE相關(guān)機(jī)制研究[4]過程中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)SLE患者可能存在骨髓MSC缺陷，是一種“間充質(zhì)干細(xì)胞病”。研究[5]顯示，體外培養(yǎng)SLE骨髓MSC表現(xiàn)出增殖異常、遷移能力下降、傳代活力與正常MSC相比明顯降低，且傳代過程中易衰老。研究[6]發(fā)現(xiàn)，SLE骨髓MSC微絲重構(gòu)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架形態(tài)異常，影響細(xì)胞的生命活動(dòng)，還能夠誘導(dǎo)ROS聚集、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及衰老。同時(shí)，還有研究[7]發(fā)現(xiàn)，SLE骨髓MSC多向分化受到抑制，自主分泌細(xì)胞因子能力異常，致病MSC移植到正常小鼠能夠誘導(dǎo)狼瘡樣癥狀或抗核抗體產(chǎn)生。細(xì)胞共培養(yǎng)研究[8]發(fā)現(xiàn)，SLE骨髓MSC對(duì)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)和免疫平衡作用減弱，誘導(dǎo)免疫耐受能力下降。MSC數(shù)量缺陷對(duì)SLE骨髓MSC作用發(fā)揮無疑有重要的影響，但關(guān)于SLE骨髓MSC數(shù)量變化的研究結(jié)果不完全一致。鑒于以往研究中納入標(biāo)本多為治療過程中的重癥或難治性病例骨髓標(biāo)本，不同用藥方案、疾病病程長(zhǎng)短、年齡衰老因素對(duì)研究結(jié)果均可能有一定影響，因此在本研究中收集的病例全部為年輕的初診SLE患者，未應(yīng)用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑及其他改善病情藥物；患者年輕，避免了年齡增加帶來細(xì)胞衰老的因素；患者病程相對(duì)較短，無長(zhǎng)期病程帶來慢性、遠(yuǎn)期繼發(fā)性損害的風(fēng)險(xiǎn)；病情活動(dòng)度相對(duì)一致，避免了不同疾病活動(dòng)度對(duì)結(jié)果的稀釋和中和作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與B組相比，A組MSC的生長(zhǎng)周期、倍增所需要的時(shí)間更長(zhǎng)，增殖能力顯著降低，但兩組細(xì)胞在鏡下基本形態(tài)無顯著差異,說明SLE患者的MSC增殖能力缺陷是一種疾病自帶屬性，雖然無法判定其是原發(fā)遺傳缺陷還是疾病發(fā)生發(fā)展中的繼發(fā)產(chǎn)物，但這種缺陷在治療前和疾病發(fā)生不久就已經(jīng)存在了，與藥物因素、疾病長(zhǎng)病程、年齡導(dǎo)致的細(xì)胞退行性改變無關(guān)，但不除外上述因素可能會(huì)加重這一缺陷。

EB1089是一種新型活性維生素D類似物，除保留生理活性維生素D基本功能外，通過A環(huán)的修飾和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)改造，在細(xì)胞增殖、分化方面發(fā)揮重要的藥理學(xué)作用。研究[9]顯示，低濃度的EB1089能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，且在濃度極低的作用下也表現(xiàn)出強(qiáng)大的促分化能力，對(duì)細(xì)胞和組織修復(fù)有一定的應(yīng)用前景，而高濃度的EB1089能夠干預(yù)細(xì)胞周期，對(duì)不同細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用。本研究以不同水平低濃度的EB1089干預(yù)A組的骨髓MSC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC數(shù)量均有明顯增加，與不添加EB1089組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量增加更為顯著，提示低濃度EB1089促增殖作用具有一定濃度依賴性。

研究[10]顯示，SLE骨髓MSC的數(shù)量增殖缺陷是細(xì)胞早期衰老的一種表現(xiàn)，體內(nèi)ROS蓄積在SLE的MSC早熟衰老過程中發(fā)揮重要作用。ROS是需氧細(xì)胞新陳代謝的產(chǎn)物，同時(shí)也是一種信號(hào)分子，通過核膜快速轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳遞、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)表達(dá)過程。在外界作用或疾病本身介導(dǎo)下，細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)重構(gòu)過程、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度激活反應(yīng)、線粒體氧化應(yīng)激及內(nèi)膜呼吸鏈傳遞受阻均能夠產(chǎn)生大量ROS或造成ROS蓄積。ROS能夠改變細(xì)胞通透性，使各種細(xì)胞器、核膜等受損，也能直接觸發(fā)持續(xù)的DNA損傷，或通過多條途徑抑制細(xì)胞增殖，所以過量的ROS是觸發(fā)DNA損傷反應(yīng)的關(guān)鍵因素，也可能是抑制MSC增殖、誘發(fā)MSC衰老的重要原因[6]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，SLE患者體內(nèi)ROS的水平較健康人升高，可能與IL-1、IL-6等炎癥因子的分泌激活氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，也可能與SLE患者體內(nèi)抗氧化酶活性減弱導(dǎo)致清除ROS能力下降或細(xì)胞骨架形態(tài)異常誘導(dǎo)ROS積聚增加所致。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，A1組MSC內(nèi)ROS水平顯著高于B1組，進(jìn)一步用不同水平低濃度的EB1089干預(yù)A組的骨髓MSC，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS水平均有所下降，與EB1089未干預(yù)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著藥物作用濃度增加，細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降也更明顯，提示EB1089抑制活性氧產(chǎn)生作用越強(qiáng)。EB1089具有抗氧化、抗衰老等藥理活性，能雙向調(diào)節(jié)衰老相關(guān)基因和蛋白表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，修復(fù)DNA損傷，在老年疾病的細(xì)胞研究中有諸多證據(jù)支持。另外EB1089能夠促進(jìn)抗氧化酶表達(dá)，上調(diào)抗氧化系統(tǒng)功能，有促進(jìn)ROS清除、減少蓄積的作用。我們的研究證明，EB1089能夠抑制MSC內(nèi)ROS水平，與EB1089干預(yù)SLE的骨髓MSC促增殖作用趨勢(shì)相一致，提示EB1089促M(fèi)SC增殖作用可能是通過抑制ROS水平、干擾細(xì)胞衰老過程實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，初診的年輕SLE患者骨髓MSC存在數(shù)量缺陷，與藥物、疾病病程、年齡導(dǎo)致的細(xì)胞衰老無關(guān)。EB1089可能通過降低MSC內(nèi)ROS水平、減少DNA持續(xù)損傷途徑促進(jìn)SLE患者骨髓MSC增殖，為維生素D類藥物在SLE患者中的治療應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。