朱世鵬,袁亞,劉通,張朝暉,葉新華,周靜珠,陳歡*,張前德
骨骼肌鈍挫傷損傷是日常生活及體育活動(dòng)中最常見的軟組織損傷形式之一,疼痛、腫脹、功能障礙等并發(fā)癥可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量?,F(xiàn)代研究認(rèn)為骨骼肌損傷的早期(炎癥期)應(yīng)以制動(dòng)為主,一些針對(duì)局部組織的治療方法如果過早干預(yù)可能會(huì)帶來新的損傷,例如拉伸訓(xùn)練、高壓氧等治療[1-2]。然而,制動(dòng)時(shí)間過長(zhǎng)或者有效治療措施不及時(shí)介入,也會(huì)妨礙肌纖維再生,出現(xiàn)組織纖維化,影響組織修復(fù)。因此,探討各種有效治療方法的介入時(shí)機(jī)有重要意義。
阿是穴是針灸治療骨骼肌損傷的常用穴位。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),骨骼肌損傷后24 h開始進(jìn)行連續(xù)的電針阿是穴治療可通過上調(diào)一些細(xì)胞生長(zhǎng)因子〔如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)〕的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖、分化[3-6]。鈍挫傷后24 h正處于機(jī)體炎性反應(yīng)的高峰期,電針阿是穴作為一種局部刺激,在其發(fā)揮治療作用的同時(shí),可能還伴有局部的輕微損傷,甚至加重炎性反應(yīng)。而鈍挫傷后72 h(3 d)炎性反應(yīng)逐漸消退,病灶組織進(jìn)入再生修復(fù)期,若在這個(gè)時(shí)期再行治療,是否更有利于或不利于針刺作用的發(fā)揮,目前尚未有研究證據(jù)。本課題組推測(cè)在損傷后的不同時(shí)期進(jìn)行電針阿是穴治療,可能對(duì)組織修復(fù)產(chǎn)生差異效應(yīng)。
骨骼肌鈍挫傷后,組織的修復(fù)程度難以通過病灶皮表形態(tài)做出準(zhǔn)確評(píng)估。高頻超聲作為一種無創(chuàng)、價(jià)廉的技術(shù),可以動(dòng)態(tài)觀察肌肉細(xì)小結(jié)構(gòu)的組織形態(tài),目前被逐漸應(yīng)用于肌肉骨骼疾病的診斷中[7]。本課題組前期研究結(jié)果顯示,高頻超聲技術(shù)可呈現(xiàn)大鼠腓腸肌鈍挫傷后的動(dòng)態(tài)影像變化,可以評(píng)估組織修復(fù)程度[8]。因此,為了解電針阿是穴對(duì)骨骼肌鈍挫傷的最佳干預(yù)時(shí)機(jī),本研究比較損傷后24 h與72 h電針阿是穴對(duì)大鼠腓腸肌鈍挫傷后高頻超聲成像、組織形態(tài)以及血清肌酸激酶(CK)的時(shí)序性影響,以初步探討腓腸肌鈍挫傷后電針阿是穴的最佳介入時(shí)機(jī),為制定科學(xué)的針灸治療方案提供依據(jù)。
本研究創(chuàng)新性:
本研究首次采用高頻超聲成像技術(shù)對(duì)電針阿是穴對(duì)大鼠腓腸肌鈍挫傷的療效進(jìn)行量化評(píng)估,同時(shí)還比較了損傷后不同時(shí)機(jī)電針阿是穴的效應(yīng)差異。臨床上,運(yùn)動(dòng)員在訓(xùn)練過程中極易發(fā)生骨骼肌的暴力性鈍挫傷,本課題組的研究結(jié)果可為此類骨骼肌損傷形式診療方案的制定提供一定科學(xué)依據(jù)。
本研究不足:
(1)研究中電針阿是穴僅進(jìn)行一次治療,未能對(duì)阿是穴的連續(xù)性累積效應(yīng)進(jìn)行觀察。(2)本研究并未對(duì)損傷后24 h這一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行各指標(biāo)的觀察,因此,無法明確電針阿是穴在損傷較早期的干預(yù)效應(yīng)。今后還需進(jìn)一步研究。
1.1 研究時(shí)間 2017年9月。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠60只,平均體質(zhì)量(250±20)g,購自南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將大鼠隨機(jī)分為空白組(n=6)、模型組(n=18)、24 h電針組(n=18)、72 h電針組(n=18)。大鼠置于清潔柜中,自由攝食與飲水,溫度(20±1)℃,濕度保持在50%左右,每日保持12 h的固定明暗周期,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物的使用符合南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)要求(倫理編號(hào):IACUC-1709007)。
1.3 主要儀器與試劑 VINNO8便攜超聲儀、X9-22L線陣探頭(蘇州飛依諾公司);NT6021電針治療儀(北京瑞德埃克森醫(yī)療投資有限公司);HM340E石蠟切片機(jī)(美國thermo fisher scientific公司);組織芯片掃描儀(Pannoramic MIDI,3D HISTECH,Ltd,Hungary);10%水合氯醛溶液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);CK試劑盒(南京建成生物工程研究所)。
1.4 方法
1.4.1 造模方法 模型組、24 h電針組、72 h電針組均參照本課題組前期研究的方法建立腓腸肌急性鈍挫傷模型[3]。用10%水合氯醛溶液進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉,剪除大鼠雙下肢腓腸肌處被毛。大鼠俯臥位并保持踝關(guān)節(jié)跖曲90°,使腓腸肌位于脛腓骨內(nèi)側(cè)。腓腸肌肌腹中點(diǎn)做標(biāo)記,采用骨骼肌鈍挫傷打擊器擊打大鼠腓腸肌1次,打擊器總質(zhì)量為500 g,由33 cm處自由落體,打擊器與腓腸肌接觸面積約為1 cm2,觀察擊打部位,表皮無破損,有散在紅色斑點(diǎn),皮下暗紅。
1.4.2 超聲檢查 分別在造模前及造模后3 h、3 d、5 d、7 d進(jìn)行超聲檢查,檢查時(shí)用10%水合氯醛溶液按0.35 ml/100 g的注射量進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉。檢查時(shí)采用與造模時(shí)相同的體位,大鼠俯臥在平坦的桌面上,后肢伸展,厚涂耦合劑,采用VINNO8便攜超聲儀、X9-22L線陣探頭,觀察腓腸肌的超聲圖像,采用鈍挫傷損傷程度的超聲分級(jí)評(píng)分表(見表1)對(duì)損傷肌肉進(jìn)行評(píng)分[8-9]。上述操作由同1名診斷經(jīng)驗(yàn)豐富的超聲醫(yī)師完成,超聲醫(yī)師對(duì)分組情況不了解。
1.4.3 電針方法 由于動(dòng)物無言語表達(dá)能力,研究中阿是穴的選取以局部病灶(即腓腸肌肌腹的中點(diǎn),輔以超聲進(jìn)行病灶定位)作為針刺部位。電針頻率為2/10 Hz的疏密波,電流強(qiáng)度1~2 mA,持續(xù)30 min[3]。除空白組外,各組造模后3、5、7 d分別抓取不同的6只大鼠進(jìn)行以下操作:其中24 h電針組在鈍挫傷后24 h進(jìn)行1次針刺治療,72 h電針組在鈍挫傷后72 h進(jìn)行1次針刺治療。模型組與2個(gè)電針組同步抓取與固定,但不做電針干預(yù)??瞻捉M不做任何處理,同步取材。
1.4.4 取材 各組大鼠分別在造模后3、5、7 d取材。10%水合氯醛溶液進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉,開腹鈍性分離出腹主動(dòng)脈,取5 ml動(dòng)脈血,在室溫靜置2 h,4 ℃下3 500 r/min 離心10 min(離心半徑13.5 cm),將上層血清轉(zhuǎn)移至-20 ℃冰箱保存。再采取脊椎脫臼法處死大鼠,暴露分離出左腿腓腸肌,取腓腸肌肌腹中段病灶組織約1 cm3,0.9%氯化鈉溶液沖洗,后置于10%甲醛溶液固定滿意后行石蠟包埋。
表1 鈍挫傷損傷程度超聲分級(jí)評(píng)分表Table 1 Ultrasound-based gastrocnemius contusion injury severity rating scale
1.4.5 HE染色 10%甲醛溶液固定滿意后,清水沖洗,常規(guī)梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)脫水,石蠟包埋,連續(xù)切片,制成6 μm左右的切片,二甲苯脫蠟,經(jīng)各級(jí)乙醇梯度(70%、80%、90%、95%、100%)至水洗。蘇木素染色5 min,自來水沖洗;鹽酸乙醇分化30 s,自來水浸泡15 min,置伊紅液2 min,脫水、透明,樹膠加蓋玻片封固。光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)變化。
1.4.6 血清CK水平檢測(cè) 取凍存的血清,參照CK試劑盒說明書檢測(cè)血清CK水平。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組大鼠腓腸肌超聲影像時(shí)序性表現(xiàn) 各時(shí)間點(diǎn)大鼠腓腸肌超聲圖像見圖1。造模前大鼠腓腸?。t色線圈所示)形態(tài)飽滿,肌纖維結(jié)構(gòu)清晰可見,未見明顯液性暗區(qū)(見圖1A)。造模后3 h大鼠腓腸肌肌肉明顯腫脹,局部可見血腫形成,呈低回聲(紅色箭頭),肌纖維斷裂(白色箭頭),肌肉結(jié)構(gòu)破壞,模糊不清(黃色箭頭)(見圖1B)。
造模后3 d,模型組大鼠腓腸肌仍有輕度腫脹,肌纖維不連續(xù),局部肌肉結(jié)構(gòu)顯示欠清晰,血腫較前吸收(見圖1C)。造模后5 d,模型組大鼠腓腸肌肌肉腫脹不明顯,肌纖維不連續(xù),肌肉結(jié)構(gòu)完整,血腫多已吸收,可見點(diǎn)狀強(qiáng)回聲(見圖1D)。造模后7 d,模型組大鼠腓腸肌肌纖維欠連續(xù),局部尚不清晰(圖1E)。
造模后3 d,24 h電針組腓腸肌液性暗區(qū)較模型組明顯減少,肌纖維仍然不連續(xù),可見點(diǎn)狀強(qiáng)回聲(見圖1F)。造模后5 d,24 h電針組肌纖維比較連續(xù),肌肉結(jié)構(gòu)較完整(見圖1G)。造模后7 d,24 h電針組肌纖維比較連續(xù),局部較清晰,但肌纖維結(jié)構(gòu)仍未恢復(fù)至正常(見圖1H)。
造模后3 d,72 h電針組與模型組比較無明顯差異,可見少數(shù)細(xì)小的液性暗區(qū)(見圖1I)。造模后5 d,72 h電針組肌纖維仍不連續(xù),但較模型組好轉(zhuǎn)(見圖1J)。造模后7 d,72 h電針組肌纖維較連續(xù),少數(shù)肌肉結(jié)構(gòu)欠清晰(見圖1K)。
注:A為造模前,B為造模后,C、D、E為模型組,F(xiàn)、G、H為24 h電針組,I、J、K為72 h電針組
2.2 各組大鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)鈍挫傷損傷程度的超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分比較 各組大鼠造模后即刻超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)后超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后3 d,24 h電針組造模后即刻超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分與干預(yù)后超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分差值大于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 造模后3 d,72 h電針組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)造模后即刻超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分與干預(yù)后超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分差值小于24 h電針組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);各組大鼠造模后5d、7d造模后即刻超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分與干預(yù)后超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分差值比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表2)。
2.3 各組大鼠腓腸肌病理形態(tài)改變 空白組肌細(xì)胞規(guī)則,排列整齊,肌纖維間隙大小一致(見圖2A~B)。
模型組造模后3 d肌纖維排列不整齊,可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(黑色箭頭所示),組織細(xì)胞間隙增大、水腫(見圖2C);造模后5 d炎性細(xì)胞明顯減少,肌細(xì)胞形態(tài)不整齊,肌纖維斷裂,可見少量細(xì)胞核位于中間的新生肌細(xì)胞(紅色箭頭所示),并逐漸向病灶處匯聚(見圖2D);造模后7 d基本無炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,新生的肌纖維逐漸融合增粗(藍(lán)色箭頭所示),伴有明顯的結(jié)締組織增生(綠色箭頭所示)(見圖2E)。
表2 各組大鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)鈍挫傷損傷程度的超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分比較(x±s,分)Table 2 Ultrasound-based gastrocnemius contusion injury score at different time points in each group
24 h電針組造模后3 d肌纖維不連續(xù),明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(以單核細(xì)胞為主)(黑色箭頭所示),組織細(xì)胞間隙增大、水腫(見圖2F);造模后5 d炎性細(xì)胞明顯減少,肌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,可見較多的新生肌細(xì)胞(紅色箭頭所示)(見圖2G);造模后7 d新生肌細(xì)胞逐漸向病灶處匯聚(藍(lán)色箭頭所示),結(jié)締組織增生較模型組減輕(綠色箭頭所示)(見圖2H)。
72 h電針組造模后3 d肌纖維不連續(xù),明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(黑色箭頭所示),組織細(xì)胞間隙增大、水腫(見圖2I);造模后5 d仍可見少量炎性細(xì)胞(黑色箭頭所示),同時(shí)伴有新生肌細(xì)胞(紅色箭頭所示)(見圖2J);造模后7 d可見較明顯的新生肌細(xì)胞逐漸向病灶處匯聚(藍(lán)色箭頭所示),輕度的結(jié)締組織增生(綠色箭頭所示)(見圖2H)。
2.4 各組大鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)血清CK水平比較 4組大鼠造模后3、5、7 d血清CK水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組大鼠造模后3、5、7 d血清CK水平均高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24 h電針組大鼠造模后5、7 d血清CK水平均高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);72 h電針組大鼠造模后3 d血清CK水平低于模型組,造模后5、7 d血清CK水平均高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表3)。
表3 各組大鼠損傷后不同時(shí)間點(diǎn)血清CK水平比較(x±s,U/ml)Table 3 Average CK level in serum at different time points in each group
《靈樞·經(jīng)筋》記載:“治在燔針劫刺,以知為數(shù),以痛為腧”,這是最早提出的“以痛為腧”治療經(jīng)筋病的觀點(diǎn)。唐代·孫思邈在《千金要方》中根據(jù)前人“以痛為腧”的理論,提出了阿是穴之名。隨著現(xiàn)代針灸學(xué)理論的發(fā)展,阿是穴的概念還包括一些組織形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的點(diǎn)或區(qū)域等[10]。由于動(dòng)物對(duì)疼痛的感覺無主觀表達(dá)能力,不能描述出具體痛點(diǎn)位置,故在針刺研究中常取打擊的中心部位作為阿是穴進(jìn)行治療。
本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[3],大鼠腓腸肌鈍挫傷后3 d左右,病灶往往無法通過肉眼來精準(zhǔn)判斷,因此在治療與取材過程中可能存在偏差。本研究采用了高頻超聲技術(shù),能無創(chuàng)、簡(jiǎn)便地對(duì)造模的損傷程度、病灶定位等進(jìn)行評(píng)估,使研究結(jié)果更加準(zhǔn)確。參考LEINEWEBER等[9]以及本課題組前期研究結(jié)果,在本研究中采用高頻超聲技術(shù)與超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分觀察了損傷后24 h與72 h電針阿是穴對(duì)大鼠腓腸肌鈍挫傷組織的修復(fù)作用,結(jié)果顯示,損傷后3 h,各組大鼠腓腸肌超聲圖像上均顯示出肌肉結(jié)構(gòu)破壞,肌纖維斷裂,局部呈低回聲的血腫形成表現(xiàn),且各組大鼠造模后即刻超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示本研究采用的一次性鈍挫傷造模方法較好,可重復(fù)性較高。
損傷后3 d,從超聲影像上觀察到組織仍有水腫情況,肌肉邊緣分界不清,局部可見無回聲,提示為血腫。這與HE染色的病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)基本一致,病灶局部可見部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn),組織處于炎性水腫階段,肌纖維不連續(xù)。24 h電針組超聲成像上腓腸肌液性暗區(qū)較模型組明顯減少,可見點(diǎn)狀強(qiáng)回聲,為陳舊性出血灶,提示出血灶在逐漸機(jī)化、吸收。此時(shí),72 h電針組與模型組比較無明顯差異,但可見少數(shù)細(xì)小的液性暗區(qū)。研究中,72 h電針組在電針治療后4 h左右進(jìn)行超聲檢測(cè)與取材,因此筆者推測(cè)細(xì)小的液性暗區(qū)可能與針灸治療有關(guān),針刺過程可能造成少數(shù)較小的新鮮出血灶。本研究結(jié)果顯示,24 h電針組超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分差值顯著高于模型組與72 h電針組,提示損傷后24 h電針阿是穴治療能較有效促進(jìn)鈍挫傷早期出血灶、壞死組織以及水腫的吸收。從病理形態(tài)上看,24 h電針阿是穴組可見較多的單核細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)出現(xiàn)。研究認(rèn)為,炎性細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)在骨骼肌損傷修復(fù)的作用就如同一把雙刃劍;在損傷早期,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)到損傷局部,尤其是巨噬細(xì)胞,可吞噬壞死肌細(xì)胞,有利于肌細(xì)胞的再生與分化[11]。此外,炎性細(xì)胞還可釋放一些促炎細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等[12],進(jìn)步一調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞的再生,比如本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的bFGF、VEGF等[3-6]。隨著炎性反應(yīng)的消退,當(dāng)病灶組織逐漸進(jìn)入再生修復(fù)期與組織重塑期,一些慢性炎性反應(yīng)則不利于組織再生修復(fù),甚至引起纖維化,影響骨骼肌功能的恢復(fù)[13]。因此,推測(cè)損傷后24 h電針治療可能通過促進(jìn)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn),加快壞死組織的吸收進(jìn)而促進(jìn)組織修復(fù)。
圖2 各組大鼠腓腸肌病理圖(HE染色)Figure 2 Pathological morphology of gastrocnemius muscle in each group
血清CK是骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的一種重要的代謝酶。當(dāng)骨骼肌細(xì)胞受到破壞時(shí),在血液中可檢測(cè)到CK水平升高,是骨骼肌損傷情況的重要指標(biāo)之一[14]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠造模后3、5、7 d血清CK水平均高于空白組,提示在損傷后7 d,大鼠骨骼肌細(xì)胞細(xì)胞膜仍未恢復(fù)正常狀態(tài)[15]。造模后3 d,72 h電針組血清CK水平均低于模型組,且與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示損傷后72 h進(jìn)行1次電針治療,能有效促進(jìn)血清CK水平恢復(fù)正常。因?yàn)?2 h電針組血清CK水平是在電針后即刻檢測(cè)的,因此,筆者推測(cè)電針對(duì)血清CK水平的即刻調(diào)節(jié)較為明顯。這也說明,雖然超聲成像在72 h電針組觀察到小的出血灶,但其血清CK水平并未升高,提示雖然電針造成細(xì)小的出血,但并不會(huì)明顯影響電針促進(jìn)機(jī)體對(duì)血清CK水平的代謝作用。
造模后5、7 d超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分結(jié)果顯示,24 h電針組及72 h電針組干預(yù)后的超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分低于模型組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這提示早期的電針治療可能能較早地激發(fā)炎性反應(yīng)與肌衛(wèi)星細(xì)胞的再生,使修復(fù)進(jìn)程縮短。其中,單看數(shù)據(jù)可見24 h電針組超聲分級(jí)評(píng)分表評(píng)分與血清CK水平均低于72 h電針組,雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但筆者推測(cè)與72 h電針治療比較,24 h電針治療能更快地促進(jìn)組織修復(fù)。
此外,造模后5 、7 d,24 h電針組與72 h電針組血清CK水平均高于正常組,雖然其低于模型組但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但提示損傷后24 h或者72 h僅進(jìn)行1次電針阿是穴治療,并不能持續(xù)下調(diào)損傷后血清CK水平的上升,可能需要通過連續(xù)性的治療來維持針灸的治療效應(yīng),今后還有待進(jìn)一步研究。
綜上所述,電針阿是穴能有效促進(jìn)大鼠腓腸肌鈍挫傷后的組織修復(fù),損傷后24 h電針阿是穴治療能較早促進(jìn)組織修復(fù)。