郁林娜， 程盛勇， 付洋， 魯文琴， 黃靜， 羅喜榮*， 楊軍

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 藥劑科,貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.中國(guó)科學(xué)院 地球化學(xué)研究所,貴州 貴陽(yáng) 550081)

諾米林(nomilin)是從桔核中提取分離得到的四環(huán)三萜類(lèi)化合物，系桔核中含量?jī)H次于檸檬苦素(limonin)的主要檸檬苦素類(lèi)似物甙元[1]。諾米林具有抗腫瘤、抗病毒、抗血管生成、抗增殖活性、抗肥胖、調(diào)節(jié)糖代謝、抑制破骨細(xì)胞分化及免疫調(diào)節(jié)等作用，諾米林對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒副作用，但其口服吸收差、生物利用度低[2-10]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)諾米林水溶性差，其臨床應(yīng)用受限。藥物的油水分配系數(shù)和溶解度與藥物的吸收密切相關(guān)，對(duì)制劑設(shè)計(jì)具有重要的指導(dǎo)意義。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)諾米林平衡溶解度和油水分配系數(shù)的研究報(bào)道，本文采用搖瓶法[11]和UPLC法[12]測(cè)定諾米林在不同介質(zhì)中的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)，為改善其生物利用度的新劑型的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Agilent 1290 DAD超高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)、UC-10H加熱超聲波清洗器(上海泰坦科技股份有限公司)、pHS-3C酸度計(jì)(上海理達(dá)儀器廠)、SHZ-C水浴恒溫振蕩器(上海浦東物理光學(xué)儀器廠)、TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、BSA224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、諾米林(自制，純度大于98%)、乙腈和甲醇(德國(guó)默克公司，色譜純)、聚乙二醇400及吐溫-80為化學(xué)純，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1溶液的配制 (1)對(duì)照品溶液的配制：精密稱(chēng)取諾米林11 mg置10 mL量瓶，加甲醇超聲溶解、定容至刻度制得1.1 g/L儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液適量，采用逐級(jí)稀釋法配制4.30、8.59、17.19、34.38、68.75、137.5及275 mg/L系列對(duì)照品溶液。(2)緩沖液的配制：取磷酸二氫鉀0.68 g加水適量，以1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉調(diào)制pH為1.2、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.8、7.4及8.0的系列磷酸鹽緩沖液。(3)表面活性劑溶液的配制：分別取吐溫80、聚乙二醇400(PEG400)、十二烷基硫酸鈉(SDS)適量，配制成濃度為5、10、20、40、60及80 g/L的系列水溶液。

1.2.2色譜條件 色譜柱為Ultimate?AQ-C18 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(45 ∶55)，流速為0.3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為0.8 μL。在上述色譜條件下，諾米林的保留時(shí)間為5.2 min，色譜峰峰形及分離度良好，無(wú)雜質(zhì)峰干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 諾米林的UPLCFig.1 UPLC chromatogram of nomilin

1.2.3平衡溶解度的測(cè)定 取過(guò)量諾米林置西林瓶，分別用移液管移取加入2 mL有機(jī)溶劑、水、緩沖液、表面活性劑溶液，37 ℃超聲(260 W，40 kHz)至藥物過(guò)飽和，置于同溫度水浴恒溫振蕩器中120 r/min振蕩24 h，以15 000 r/min離心5 min，取上清液，稀釋或濃縮至標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，按上述色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算諾米林在各介質(zhì)中的平衡溶解度。

1.2.4表觀油水分配系數(shù)的測(cè)定 取諾米林適量溶于水飽和的正辛醇中，使成飽和態(tài)，以15 000 r/min離心5 min。精密吸取上清液0.5 mL于10 mL離心管中，分別用移液管移取加入正辛醇飽和的水、緩沖液各5 mL，置于37 ℃恒溫振蕩器中120 r/min振蕩24 h，以15 000 r/min離心5 min，取上層正辛醇相、下層水相，稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)，于0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，按上述色譜條件進(jìn)樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算諾米林的正辛醇相即油相濃度C0和水相濃度CW，按lgP=C0/CW計(jì)算油水分配系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1線性關(guān)系考察 分別取對(duì)照品溶液適量，于0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，按色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積；以諾米林質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo)對(duì)峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=1.966 7X-2.264 9，R2=0.999 5，結(jié)果表明諾米林在4.30～275 mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2精密度試驗(yàn) 分別取高、中及低濃度(275、34.38及4.30 mg/L)標(biāo)準(zhǔn)液，于0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，按色譜條件1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣檢測(cè)5次，記錄峰面積，計(jì)算RSD；連續(xù)進(jìn)樣檢測(cè)5 d， 1次/d，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果其日內(nèi)RSD分別為0.27%、0.69%及2.34%，日間RSD分別為0.61%、0.61%及2.23%，表明方法的精密度良好。

2.1.3重復(fù)性試驗(yàn) 分別配制高、中及低濃度(275、34.38及4.30 mg/L)標(biāo)準(zhǔn)液各5份，于0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，按色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果其重復(fù)性RSD分別為0.78%、1.38 %及1.82 %，表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.4準(zhǔn)確度試驗(yàn) 分別取高、中及低濃度(275、34.38及4.30 mg/L)標(biāo)準(zhǔn)液，于0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，按色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)的濃度，按準(zhǔn)確度為測(cè)定濃度值除以真實(shí)濃度值計(jì)算高、中及低濃度的準(zhǔn)確度。結(jié)果其準(zhǔn)確度分別為104%、96.24%及103.24%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2 平衡溶解度

按“1.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定諾米林的平衡溶解度，結(jié)果表明諾米林不溶于石油醚、正己烷、水及緩沖液，在二氯甲烷中的溶解度最大，SDS對(duì)其增溶作用最明顯，見(jiàn)表1、圖2。

表1 37 ℃條件下諾米林在不同介質(zhì)中的平衡溶解度Tab.1 Equilibrium solubility of nomilin in different media at 37 ℃

圖2 37 ℃條件下諾米林在不同介質(zhì)中的平衡溶解度Fig.2 Equilibrium solubility of nomilin in different media at 37 ℃

2.3 表觀油水分配系數(shù)

按“1.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定諾米林的表觀油水分配系數(shù)，結(jié)果諾米林在正辛醇/水中的表觀油水分配系數(shù)為131.05(lgP=2.12)，在正辛醇/磷酸鹽緩沖液中表觀油水分配系數(shù)呈M形，在pH 3.0緩沖液中表觀油水分配系數(shù)最大為783.07(lgP=2.89)，見(jiàn)圖3。

圖3 諾米林在37 ℃條件下于正辛醇/磷酸緩沖液中的表觀油水分配系數(shù)Fig.3 Apparent oil-water partition coefficient of nomilin in octanol/buffer at 37 ℃

3 討論

目前,有關(guān)諾米林的報(bào)道主要集中在提取分離、藥理作用的研究，鮮見(jiàn)其理化性質(zhì)的研究報(bào)道。本文建立了諾米林含量的UPLC測(cè)定方法，測(cè)定了諾米林在不同介質(zhì)中的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)。結(jié)果表明諾米林不溶于石油醚、正己烷、水及緩沖液，在二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯中溶解度較大，為中等極性化合物，屬難溶性藥物；諾米林在正辛醇-水/緩沖液中的lgP值為1.77～2.89，ACD/ChemSketch 12.0軟件預(yù)測(cè)值為2.22±0.78，實(shí)測(cè)值與理論預(yù)測(cè)結(jié)果相近，提示其在整個(gè)胃腸道中均有較好的吸收，適于制成口服制劑。

諾米林水溶性差，其lgP提示膜滲透性好，屬于生物藥劑學(xué)分類(lèi)系統(tǒng)的Ⅱ類(lèi)藥物。疏水性強(qiáng)不是限制諾米林口服吸收的主要原因(lgP>5的藥物不易吸收)，導(dǎo)致其生物利用度低的原因可能是藥物溶解度小導(dǎo)致藥物溶出速度太慢。因此在諾米林制劑設(shè)計(jì)時(shí)，可考慮采用增溶輔料或固體分散體、納米粒、自微乳等制劑手段提高其溶解度和溶出速率，以提高其生物利用度。口服制劑溶出度的測(cè)定一般采用水、pH1.2鹽酸溶液和pH6.8的磷酸鹽緩沖液，諾米林在這3種介質(zhì)中均達(dá)不到漏槽條件。

綜上，本研究了3種表面活性劑對(duì)諾米林的增溶效果，其中SDS的增溶作用最大，提示諾米林水溶性差，但滲透性較好，適合制成口服制劑，可以將SDS作為諾米林制劑的溶出介質(zhì)。