沈啟慧，單驛軒，連朋亮，劉巖，于東冬，周建光

(1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林，132022；2.浙江大學(xué)醫(yī)院，浙江杭州，310027；3.浙江大學(xué)控制科學(xué)與工程學(xué)院工業(yè)控制技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州，310058)

在日常生活與工作中，人們時刻都在接觸很多致病微生物如大腸桿菌、雙歧桿菌、金黃色葡萄球菌[1-4]。研發(fā)具有抑菌和抗菌活性的材料，可以降低疾病危害，營造健康的生活環(huán)境[5]。隨著抗生素、消毒劑和殺菌劑的濫用，耐藥性變異的微生物種群隨之增多，細(xì)菌的耐藥性逐漸發(fā)展為一個全球性問題[6]，新型抗菌材料的研發(fā)和應(yīng)用成為防止微生物危機(jī)發(fā)生的重要內(nèi)容[7]。無機(jī)抗菌材料具有抑菌持久性好和不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，尤其是納米銀及其復(fù)合材料具有低毒性、抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)療和保健領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[10-12]，從而使得其相關(guān)納米材料的開發(fā)和應(yīng)用成為目前納米發(fā)展戰(zhàn)略的主要內(nèi)容之一。有機(jī)硅材料具備無機(jī)與有機(jī)材料性能，具有耐高溫、電氣絕緣、無毒無味、化學(xué)惰性等特點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于航空航天、化工、電子電氣、紡織、食品、醫(yī)療等領(lǐng)域，尤其在醫(yī)療器械上如醫(yī)用導(dǎo)管、人工器官及組織替代品、可移植的高密度微電極陣列[13-14]等得到應(yīng)用。對有機(jī)硅表面進(jìn)行功能性修飾成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文作者介紹一種對有機(jī)硅表面修飾具有抗菌活性的納米銀疏水涂層(水接觸角WCA=90.33°)的制備方法。采用光化學(xué)反應(yīng)在柔性硅膠基質(zhì)上組裝微球陣列，并利用其微球表面巰基的還原性原位生長納米銀顆粒，使硅膠表面具有良好的抑菌活性，改變通過短期提高硅膠表面的親水性進(jìn)而增強(qiáng)抑菌活性的方法[15]。該硅膠表面自組裝微球及微球表面原位生長納米銀顆粒的過程，均在水體系、室溫環(huán)境下完成，尤其在原位生長納米銀的反應(yīng)未使用額外的穩(wěn)定劑及還原劑，不產(chǎn)生廢棄物，屬于綠色制備技術(shù)。通過抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)，該疏水涂層對革蘭氏陽性/陰性細(xì)菌的具有良好的抗菌活性，但不會傷害人類細(xì)胞，具有較低的細(xì)胞毒性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

試劑：γ-巰基丙基正硅酸甲酯(MPTMS，97%)；氨水(分析純)；乙醇(分析純)；濃硫酸(98%)；過氧化氫(30%)；甲苯(≥99.5%)；烯丙基三乙氧基硅烷(>96.0%)；硝酸銀(99.8%)；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基；磷酸二氫鉀(分析純)；磷酸氫二鈉(分析純)；Hoechst33342/PI雙色染色劑；枯草芽孢桿菌菌種均為普通市售試劑；聚二甲基硅氧烷(PDMS，自制)；大腸桿菌菌種(吉林大學(xué)饋贈)。

儀器：隔水式恒溫培養(yǎng)箱(常州諾基儀器有限公司制造)；立式壓力蒸汽滅菌箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司制造)；超凈工作臺(濟(jì)南杰康凈化設(shè)備廠制造)；CFT-1材料表面性能綜合測試儀(蘭州中科凱華科技開發(fā)有限公司制造)； 熒光正置顯微鏡(Leica DM4000B)。

1.2 負(fù)載納米銀PDMS（Ag-PDMS）的制備

首先，將PDMS 置于體積比為3:1 的濃H2SO4和H2O2混合溶液中浸泡5 min，取出后用大量H2O 沖洗；然后，迅速浸泡到1 mmol/L 烯丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液中，10 min后取出用乙醇沖洗，表面略微吹干備用。

將表面活化后的PDMS放入表面富含巰基的SiO2微球(按文獻(xiàn)方法[16]制備)懸浮液中，紫光燈照射30 min后取出用水沖洗，隨后放置在AgNO3(1 mol/L)溶液中浸泡24 h。水洗后保存在水中。

1.3 摩擦實(shí)驗(yàn)

在室溫下對二氧化硅微球和PDMS鍵合的材料進(jìn)行摩擦學(xué)性能考察，載荷為20 N，轉(zhuǎn)速為500 r/min，實(shí)驗(yàn)時間為3 min，所用鋼球直徑為4 mm，洛氏硬度為61～66，摩擦因數(shù)為0.29～0.36。

1.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

在無菌操作臺內(nèi)，將滅菌(121 ℃，15 min)后的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基分別接種大腸桿菌或枯草芽孢桿菌，在37 ℃時恒溫培育12 h。用滅菌(121 ℃，15 min)后生理鹽水調(diào)整菌液濃度為1.3×108個/mL，作為原菌液待用。

在無菌操作臺內(nèi)，將滅菌(121 ℃，15 min)后的胰酪大豆胨固體培養(yǎng)基加入原菌液，凝固后表面放置Ag-PDMS 和未經(jīng)處理的PDMS 薄膜作為對照，于37 ℃恒溫培育12 h。

按照染色劑說明書要求，在錐形瓶內(nèi)配制磷酸緩沖溶液(PBS)，于121 ℃滅菌15 min。將已處理好的Ag-PDMS 薄膜從培養(yǎng)基中取出，放入染色液中避光冰水浴30 min，將PBS 沖洗干凈用于熒光顯微鏡檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 硅表面微球的自組裝

PDMS 作為一種有機(jī)硅，具有柔軟、光學(xué)透明、無毒、不易燃、良好的化學(xué)惰性和生物相容性等特點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用于隱形眼鏡、人造肌肉、醫(yī)用導(dǎo)管、生物傳感器、微流控系統(tǒng)[17-19]等。由于其表面具有憎水性，因而很容易黏附生物膜，滋生細(xì)菌，影響PDMS在醫(yī)療材料領(lǐng)域的應(yīng)用。雖然等離子體、臭氧輻射處理能夠有效提高PDMS表面親水性，在一定程度上抑制生物膜的黏附，但隨著時間延長，表面潤濕性逐漸變差，這是由于處理后的極性基團(tuán)(—OH，—COOH)隨擴(kuò)散作用而引發(fā)的分子鏈遷移，即極性基團(tuán)向PDMS內(nèi)部遷移[20]。

將粒徑較大的微球(直徑約為1 μm)通過自組裝的方法鍵合在PDMS表面，能夠有效地避免分子鏈遷移導(dǎo)致的表面變性，永久性地提高抗黏附生物膜的性能。圖1所示為微球自組裝在PDMS表面的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)示意圖，圖2所示為PDMS表面自組裝微球的紅外光譜和顯微成像圖片。圖1中PDMS 表面修飾端烯，圖2中的紅外光譜在1 655 cm-1和1 676 cm-1處的峰為端烯的特征吸收峰，這說明PDMS表面已經(jīng)存在大量的端烯基團(tuán)[21]；在光照條件下，微球表面的巰基將與端烯發(fā)生親電加成反應(yīng)，紅外譜圖中原端烯吸收峰消失，在619 cm-1和1 132 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰(硫醚鍵)，證實(shí)通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)能夠?qū)⑽⑶蜴I合在PDMS表面[22]。圖2中的顯微及AFM圖像表明，通過自組裝的方法能夠?qū)崿F(xiàn)微球在PDMS表面上規(guī)則有序地排列。

圖1 在PDMS表面微球自組裝的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)Fig.1 Silica microspheres anchored to surface of PDMS by“Click reaction”between thiol group and vinyl-silica

圖2 PDMS表面自組裝微球的紅外光譜和顯微成像圖片F(xiàn)ig.2 FTIR spectrum and microscope image of silica microspheres assembled on surface of PDMS

通過對照摩擦實(shí)驗(yàn)，將組裝微球與空白的PDMS進(jìn)行對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：空白PDMS基片在第3次測試時，基片發(fā)生破損；而組裝后微球的基片在第6次測試時，只有摩擦因數(shù)小幅度降低，持續(xù)到第10次時，依然未發(fā)生基片斷裂現(xiàn)象，證實(shí)微球在PDMS表面自組裝的穩(wěn)定性，并且能夠有效地緩沖摩擦對基片的影響。

2.2 納米銀在微球表面的原位生長

自組裝到PDMS表面的微球表面依舊存在大量巰基，利用雙巰基鍵合生成二硫鍵的同時為銀離子還原提供電子，并且PDMS具備遠(yuǎn)距離(約5 nm)傳輸電子的特性，吸附在微球表面的銀離子自動被還原為納米銀顆粒，隨著微球提供的電子衰竭，納米銀的生長逐漸停止(～15 nm)，通過調(diào)節(jié)溶液中銀離子的濃度也可以控制納米銀的粒徑[23]。圖3所示為原位生長在微球表面的納米銀顆粒的TEM 成像圖片，球形的納米銀顆粒單層生長在微球表面并具有清晰的晶格線，晶格線間距為0.236 nm，證實(shí)納米銀顆粒在微球表面的生成，同時XPS 圖譜中Ag 3d3/2和Ag 3d5/2在374.1 和368.1 eV位置出現(xiàn)明顯譜峰，這也證實(shí)銀離子轉(zhuǎn)變?yōu)殂y原子[24]。

2.3 菌落計數(shù)法

圖3 微球表面AgNPs的TEM圖片和XPS譜圖Fig.3 TEM image and XPS spectrum of silver nanoparticles generated on surface of silica microspheres

納米銀是一種常用的廣譜抗菌劑，且不會導(dǎo)致抗藥性菌種出現(xiàn)，因此，含納米銀的抗菌用品應(yīng)用非常廣泛。本次實(shí)驗(yàn)通過平板菌落計數(shù)的方法對材料的抑菌性能進(jìn)行評價。如圖4所示為負(fù)載納米銀抑制大腸桿菌和枯草桿菌生長的平板菌落計數(shù)結(jié)果。從圖4可見：與革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)共同培養(yǎng)的Ag-PDMS上及周圍沒有菌落出現(xiàn)(圖4(a)中A處)，而未經(jīng)處理過PDMS 的表面長滿菌落(圖4(a)中B處)，說明修飾納米銀后的PDMS基片對大腸桿菌有良好的抑菌效果。同樣，與革蘭氏陽性菌(枯草芽孢桿菌)共同培養(yǎng)的Ag-PDMS 上及周圍也沒有菌落生長(圖4(b)中C處)，而未處理過的PDMS 上長滿菌落(圖4(a)中D處)，所以，生長納米銀顆粒的PDMS 對革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌也有良好的抑菌效果。通過菌落計數(shù)法對照實(shí)驗(yàn)，證明經(jīng)修飾納米銀后的PDMS呈現(xiàn)良好的抑菌活性。

2.4 細(xì)菌染色法

圖4 負(fù)載納米銀抑制菌種生長的平板菌落計數(shù)結(jié)果Fig.4 Colony counting results of inhibiting the growth of bacterial by AgNPs

圖5 用不同樣品孵育后細(xì)菌的熒光顯微鏡圖像Fig.5 Fluorescent microscopy images of bacteria after incubation with different samples

將未經(jīng)過處理的PDMS 和Ag-PDMS 分別與大腸桿菌或枯草芽孢桿菌共同培養(yǎng)，將培養(yǎng)后的薄膜使用熒光染色劑染色，根據(jù)染色部位和熒光顏色的差異，可以區(qū)分細(xì)菌的生存狀況，其中藍(lán)色熒光主要是活細(xì)菌，紅色熒光則對應(yīng)死亡細(xì)菌，熒光強(qiáng)度越高說明相應(yīng)的細(xì)菌數(shù)量越多。圖5所示為用不同樣品孵育后的活/死大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的熒光顯微鏡圖像。其中，圖5(a)和(b)所示為大腸桿菌的熒光顯微鏡圖像，可見未經(jīng)染色的薄膜表面生長著大量的細(xì)菌，而復(fù)合納米銀顆粒的PDMS 表面只能觀察到微球存在。經(jīng)過染色對比后，活/死細(xì)菌的數(shù)量PDMS 遠(yuǎn)遠(yuǎn)比Ag-PDMS 復(fù)合薄膜的多。圖5(c)和(d)所示為枯草桿菌的熒光顯微鏡圖像，與大腸桿菌的檢測結(jié)果類似，Ag-PDMS表面生長的細(xì)菌量很少，說明Ag-PDMS具有良好的抑菌活性。

2.5 納米銀修飾PDMS表面的細(xì)胞毒性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：納米銀修飾PDMS表面具有很好的抑制革蘭氏陽性/陰性細(xì)菌的活性，即對原核微生物具有很好的抑制作用，但同時需要保證該材料對哺乳性動物細(xì)胞特別是人類細(xì)胞不要造成傷害。為驗(yàn)證經(jīng)納米銀修飾PDMS 的安全性，采用MTT 方法以細(xì)胞存活率作為定量的標(biāo)準(zhǔn)，選用蜂毒肽作為陽性參照物，空白磷酸緩沖溶液作為陰性對照物，與納米銀修飾的PDMS進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)選用人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(hCMEC/D3)，該細(xì)胞與普通人體細(xì)胞非常接近，具有良好的形態(tài)學(xué)特征，適合開展細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)[25]。

細(xì)胞毒性曲線如圖6所示。從圖6可見：蜂毒肽對hCMEC/D3 細(xì)胞具有強(qiáng)烈的殺傷作用；當(dāng)蜂毒肽的質(zhì)量濃度為16 mg/L 時，hCMEC/D3 細(xì)胞全部死亡；而當(dāng)PDMS 表面納米銀的質(zhì)量濃度低于64 mg/L時，細(xì)胞存活率并未受到影響(約100%)，因此，可認(rèn)為當(dāng)納米銀的質(zhì)量濃度低于64 mg/L時，不具備殺傷性；而隨著樣品中納米銀質(zhì)量濃度逐漸增加，達(dá)到128～256 mg/L 時，依然有50%～90%的細(xì)胞存活，此時，其質(zhì)量濃度相比蜂毒肽的致死質(zhì)量濃度高8～16 倍，這表明當(dāng)PDMS 表面納米銀質(zhì)量濃度低于128 mg/L時，幾乎不抑制人類細(xì)胞的增值。

圖6 細(xì)胞毒性曲線Fig.6 Curves of cytotoxicity

3 結(jié)論

1)利用光點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)通過二氧化硅微球?qū)⒓{米銀顆粒鍵合在柔性硅基質(zhì)材料(PDMS)表面，利用納米銀顆粒獨(dú)特的抑菌性能，降低PDMS吸附和滋生細(xì)菌的可能性。

2)Ag-PDMS 薄膜對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長均有明顯的抑制作用，同時具有較低的生物毒性，在一定程度上可以替代抗生素、消毒劑或殺菌劑，為食品安全及醫(yī)用衛(wèi)生等無菌操作的領(lǐng)域提供材料。