朱中強，何雪，薛夢婷，余冉

(1.東南大學能源與環(huán)境學院，江蘇南京，210096；2.東南大學能源熱轉換及其過程測控教育部重點實驗室，江蘇南京，210096)

微藻是一種極其細小、肉眼不可見的自養(yǎng)植物，因其具有比一般植物更高的光合作用效率及更高的生物質(zhì)產(chǎn)量，并且生長周期短、可適應復雜的生態(tài)條件(如鹽堿地、沙漠等)[1-3]，故在營養(yǎng)保健食品行業(yè)、醫(yī)學領域、環(huán)境治理等方面應用廣泛。微藻具有多種代謝途徑，既可光合自養(yǎng)，也可化能異養(yǎng)，可混合代謝生長，并能在不同的培養(yǎng)條件下，通過改變其合成蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)的途徑實現(xiàn)其自身增殖[4]。而微藻的混合代謝模式可幫助其利用廢水中的有機物并減少其自養(yǎng)生長對光的依賴[5-6]，從而同步實現(xiàn)廢水凈化與資源的有效利用。目前，微藻養(yǎng)殖種類主要包括小球藻、螺旋藻、柵藻，其中，小球藻生長速率快，固碳效率高，pH 適應性廣，因而，成為應用與研究的熱點。人們對小球藻的廢水養(yǎng)殖技術已有一定研究，在光照條件下，二氧化碳和廢水中的有機物可協(xié)同促進小球藻的生長[7]。LU等[8]利用小球藻處理肉類加工廢水，發(fā)現(xiàn)生長在混合廢水中的小球藻的生物量比分別生長在單一廢水和培養(yǎng)基中的高，達到0.68～1.54 g/L，此外，氨氮去除率(68.75%～80.3%)和總氮去除率(30.06%～50.94%)也有不同程度地提高。GE等[9]利用厭氧消化液分別自養(yǎng)、異養(yǎng)、混合培養(yǎng)小球藻，發(fā)現(xiàn)相比于其他2種培養(yǎng)模式，在混合模式下的小球藻具有更高的生長量((0.72±0.01)g/L)和更高質(zhì)量濃度的葉綠素((14.2±0.1)g/L)及類胡羅素((12.9±0.4)g/L)，并且氮磷污染物幾乎全部去除。我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，隨之產(chǎn)生的畜禽養(yǎng)殖廢水的有效處理問題受到廣泛關注。目前，該類廢水的典型處理工藝有水解-序批式活性污泥工藝(SBR)、氧化溝工藝等，但這些工藝都存在操作復雜、成本較高的缺點。然而，畜禽養(yǎng)殖廢水具有氨氮濃度高、有機物濃度高的特點，其中部分有機物可用于回收再利用。雖然已有研究表明，利用畜禽養(yǎng)殖廢水進行微藻養(yǎng)殖具有可行性，但該模式下微藻固碳機理的研究仍然較少，為此，本文作者研究小球藻對畜禽養(yǎng)殖廢水的凈化能力以及廢水與小球藻代謝生長的協(xié)同作用關系與機理，重點探討小球藻對有機與無機碳源的競爭利用策略，小球藻細胞增殖速率與合成代謝產(chǎn)物(色素、油脂)含量的關系，并解析有機碳利用的影響因素與小球藻固碳機理，以期為畜禽養(yǎng)殖廢水的小球藻凈化工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)基

實驗所用的小球藻(Chlorella vulgaris)(FACHB-8)購于中國科學院水生生物研究所(中國，武漢)。采用高溫滅菌(121 ℃，30 min)后的BG11培養(yǎng)基進行擴增培養(yǎng)。

1.2 反應器設計及運行

本次廢水處理裝置示意圖如圖1所示，具體包括藻培養(yǎng)系統(tǒng)及pH控制系統(tǒng)(控制pH為7.5±0.5)。反應器容積為1 L，有效容積為400 mL。反應器試驗全程置于光照培養(yǎng)箱(溫度為28 ℃，光暗時間比為12 h:12 h，光照強度為56.67 W/m2)。

圖1 廢水處理裝置示意圖Fig.1 Diagram of wastewater treatment device

1.3 畜禽養(yǎng)殖廢水組成

試驗用廢水參考南京市某養(yǎng)殖中心的廢水成分進行人工配制，模擬廢水以C6H12O6為碳源，以NH4Cl為氮源、以K2HPO4為磷源，添加必需金屬元素。模擬廢水組分如下：1.000 g/L C6H12O6；0.200 g/L NH4Cl；0.040 g/L K2HPO4；0.075 g/L MgSO4·7H2O；0.036 g/L CaCl2·2H2O； 0.003 g/L FeCl3·6H2O；1 mL/L A5(痕量金屬溶液)。其中，A5 組分如下：2.86 g/L H3BO3； 1.86 g/L MnCl2·4H2O； 0.22 g/L ZnSO4·7H2O； 0.39 g/L Na2MoO4·2H2O； 0.08 g/L CuSO4·5H2O；0.05 g/L Co(NO3)2·6H2O。模擬廢水(接種后)成分如表1所示。

表1 模擬廢水成分(質(zhì)量濃度)Table1 Composition of simulated wastewater mg/L

考慮到pH 對藻類生長及固碳機理的影響，為研究小球藻對無機碳(HCO-3)和有機碳的競爭利用規(guī)律，在模擬水質(zhì)基礎上分別采用NaHCO3和Na2CO3組合以及4-羥乙基哌嗪丙磺酸(HEPPS)作為模擬廢水的pH緩沖劑，分別設置4 個實驗組(見表2)，以對比不同實驗組中初始的無機碳濃度，同時避免小球藻培養(yǎng)過程中為調(diào)節(jié)pH而投加無機碳源對小球藻生長的影響。其中HEPPS 作為一種生物緩沖劑，對細胞無毒性作用，且不能夠被細胞利用，故可以作為緩沖劑而不會增加培養(yǎng)液中的有機碳濃度。

表2 實驗設計方案Table2 Experimental design schemes

1.4 實驗方法

將小球藻先于BG11培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，待生長至穩(wěn)定期(10 d)后，按照1:50 體積比分別接種進4 個(分別編號為A，B，C 和D 組)裝有400 mL 高溫滅菌(121 ℃,30 min)廢水的反應器中進行序批式培養(yǎng)，監(jiān)測小球藻的生長及水質(zhì)變化情況。同時，監(jiān)測藻細胞內(nèi)色素、油脂的含量變化，每批實驗重復2次。

1.5 測定指標及分析方法

1.5.1 藻生長情況及比生長速率計算

在波長為680 nm條件下，利用紫外-可見分光光度計測定的吸光度表征藻的生長情況。比生長速率計算公式如下：

式中：μ為比生長速率，d-1；t為小球藻的培養(yǎng)時間，d；Nt和N0分別為第t天和初始時測定的藻密度。實驗發(fā)現(xiàn)，在藻培養(yǎng)過程中，前3 d為對數(shù)增長期，因此，在計算比生長速率時，統(tǒng)一取第3天藻密度和初始藻密度進行計算，即t=3，Nt為N3。

1.5.2 廢水中成分測定

取適量的小球藻液，以8 000 r/min 離心5 min 后取上清過濾(濾膜孔徑為0.45 μm)。采用納氏試劑光度法測定NH+4-N濃度，采用堿性-過硫酸鉀分光光度法測定總氮(TN)質(zhì)量。采用鉬酸銨分光光度法測定總磷(TP)質(zhì)量[10]；采用快速消解法測定COD 質(zhì)量濃度[11]。由于實驗組中添加的生物緩沖劑會體現(xiàn)為COD 質(zhì)量濃度，但不可被小球藻利用，因此，添加有生物緩沖劑的實驗組中COD 質(zhì)量濃度的計算公式如下：

式中：ρCOD,A為小球藻可以利用的COD 質(zhì)量濃度，mg/L；ρCOD,M為測定的COD 質(zhì)量濃度，mg/L；ρCOD,H為添加生物緩沖劑后體現(xiàn)的COD質(zhì)量濃度，mg/L。

1.5.3 色素及油脂測定

采取分光光度法測定色素的含量(葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素)[12]；采用氯仿-甲醇法測定油脂質(zhì)量[13]。

1.6 統(tǒng)計學分析

本文實驗測得的藻生物量以及COD，TN，TP，NH4-N 和葉綠素的質(zhì)量濃度、脂質(zhì)質(zhì)量等采用Excel進行分析，并表示為T±ΔT，其中T為各指標的平均值，ΔT為各指標的平均偏差，并對數(shù)據(jù)進行t 檢驗。當概率p＜0.05時說明結果具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 無機碳對藻類生長及水質(zhì)凈化的影響

2.1.1 小球藻的生長

小球藻在模擬畜禽養(yǎng)殖廢水中的生長情況對比如圖2所示。其中，“*”表示該組實驗結果與C組實驗結果相比具有顯著性差異(p＜0.05)；“＆”表示該組實驗結果與D 實驗結果相比具有顯著性差異(p＜0.05)。由圖2可知：無機碳的添加不影響小球藻的生長周期，4 個實驗組的小球藻在經(jīng)過1 d 的適應期后，均快速進入對數(shù)增長期，在第3天時小球藻的生物量達到最大，并逐漸進入生長穩(wěn)定期(見圖2(a))。其中，B 實驗組(以HEPPS 為初始緩沖液，用NaHCO3調(diào)節(jié)pH)中的小球藻經(jīng)過7 d 培養(yǎng)后，生物量達到最大。由于初始無機碳的存在，小球藻的生長速率以及達到穩(wěn)定期時的生物量明顯降低(見圖2(b))。當pH為7.0～8.0 時，CO2在液相的主要存在形式為可被藻類吸收利用的。A 和B 組中的小球藻經(jīng)過7 d 培養(yǎng)，藻的生物量并沒有顯著性差異(p＞0.05)，但均明顯高于C 和D 實驗組的小球藻生物量(p＜0.05)。這說明當缺少無機碳源時，小球藻可以通過改變其代謝途徑對廢水中有機碳源進行吸收，以滿足藻類生長的需要[15]；另一方面，在以空氣中的CO為無機碳源且水中溶解性無機碳極少的情況下，可能會引發(fā)藻細胞內(nèi)的“二氧化碳濃縮機制”[16]，藻細胞可以主動運輸HCO-3或者在微藻胞內(nèi)和胞外酶共同作用下將HCO-3轉化為CO2擴散至細胞內(nèi)，使得小球藻在無機碳源受限時依然可維持快速增長。但是B實驗組中小球藻的比生長速率仍然明顯高于其他實驗組中小球藻的比生長速率(p＜0.05)，說明適當添加無機碳源利于藻的快速增長。這可能是由于藻類在生長過程中，為保持體內(nèi)平衡而向外分泌H+與HCO-3，二者反應后釋放出CO2，通過擴散作用快速被藻類吸收[17]。C 和D 實驗組中藻的生長速率和藻的密度明顯比A 和B 組中的低，說明添加過量無機碳源(HCO3-)可能使藻類合成碳的途徑發(fā)生改變，并對有機碳的有效吸收產(chǎn)生負面影響，從而抑制了高質(zhì)量濃度有機碳條件下藻的生長[18]。因此，當pH為7.0～8.0時，添加一定量的無機碳(HCO-3)能夠促進高質(zhì)量濃度有機碳培養(yǎng)條件下藻的生長，但過高濃度的無機碳會抑制藻的生長。

圖2 小球藻在模擬畜禽養(yǎng)殖廢水中的生長情況對比Fig.2 Comparison of growth of Chlorella vulgaris in simulated livestock and poultry aquaculture wastewater

2.1.2 無機碳對水質(zhì)凈化的影響

模擬畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)小球藻過程中COD 質(zhì)量濃度變化如圖3所示。由圖3可知：利用模擬畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)小球藻過程中，所有實驗組中廢水的ρCOD均隨著小球藻的生長而明顯降低。A～D實驗組ρCOD去除率在7 d 培養(yǎng)期結束時分別為(91.0±1.3)%，(77.8±14.4)%，(68.8±5.6)%和(64.8±12.1)%，但除A 組外，ρCOD均呈現(xiàn)出先減少后緩慢增加的趨勢；同時，C實驗組中ρCOD分別為A 和B 這2 組ρCOD的5.9 倍與1.4倍，D實驗組中的ρCOD分別為A和B這2組ρCOD的6.7倍與1.5 倍。由于碳源存在競爭關系，小球藻可能優(yōu)先吸收無機碳，從而影響了有機碳的吸收。B實驗組的ρCOD經(jīng)過2 d 培養(yǎng)后迅速降至(46.8±16.9)mg/L，顯著小于同時期其他實驗組的ρCOD(p＜0.05)。在藻類對數(shù)增長末期，所有實驗組藻類的ρCOD隨著時間延長而逐漸上升，這可能是因為藻向胞外分泌有機物。

圖3 模擬畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)小球藻過程中ρCOD變化Fig.3 Change of ρCOD during cultivation of Chlorella vulgaris in simulated livestock and poultry aquaculture wastewater

氮是藻類細胞的重要組成成分，對藻的結構蛋白、酶、核酸及葉綠素等合成至關重要[19]。模擬廢水培養(yǎng)小球藻過程中氨氮和總氮的質(zhì)量濃度變化如圖4所示。由圖4可知：隨著小球藻的生長，氨氮和總氮的質(zhì)量濃度都呈現(xiàn)下降趨勢；A～D 實驗組中小球藻對氨氮去除率均達到100%，總氮的去除率分別為(96.5±2.7)% ， (97.0±0.6)% ， (96.9±1.1)% 和(96.8±0.5)%，但是，各個實驗組出水總氮質(zhì)量濃度并無顯著性差異，且均達到城鎮(zhèn)污水廠一級A 的排放標準(總氮質(zhì)量濃度＜15 mg/L)。由此可見，添加無機碳對氨氮和總氮的去除影響不顯著。

圖4 模擬畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)小球藻過程中氨氮與總氮質(zhì)量濃度變化Fig.4 Changes of ammonia nitrogen and total nitrogen mass concentrations during the cultivation of Chlorella vulgaris in simulated livestock and poultry aquaculture wastewater

圖5 模擬畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)小球藻過程中總磷質(zhì)量濃度的變化Fig.5 Change of total phosphorus mass concentration during the cultivation of Chlorella vulgaris in simulated livestock and poultry aquaculture wastewater

磷是藻類生長必需的營養(yǎng)元素之一，它可以影響藻類磷脂、蛋白質(zhì)和核酸的合成，并且對能量循環(huán)具有重要作用[20-21]。模擬畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)小球藻過程中總磷質(zhì)量濃度的變化如圖5所示。由圖5可知：隨著小球藻培養(yǎng)時間的延長，A～D 組廢水中總磷質(zhì)量濃度都呈現(xiàn)下降趨勢，最終總磷去除率均大于80%。A 和B 實驗組的總磷去除率分別為(86.8±3.9)%和(86.8±2.8)%)，比C和D實驗組的總磷去除率(分別為(83.4±1.7)%和(83.3±5.7)%)略高，但C 和D 實驗組中的最終出水總磷質(zhì)量濃度與A和B實驗組中的總磷質(zhì)量濃度并沒有顯著性差異(p＞0.05)。因此，當利用畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)小球藻時，是否添加無機碳對廢水中總磷的去除無影響。

2.1.3 小球藻胞內(nèi)色素、油脂質(zhì)量變化

在小球藻培養(yǎng)過程中，無機碳濃度對油脂在藻細胞中積累量的影響如圖6所示。由圖6可知：經(jīng)過7 d培養(yǎng)，B 實驗組中單個小球藻細胞內(nèi)的油脂質(zhì)量為(0.26±0.004)ng，顯著高于其他實驗組中藻細胞的油脂質(zhì)量(p＜0.05)。這是因為，適量無機碳源的添加可能促進了細胞對有機物的吸收與油脂的轉化積累；另一方面，B 實驗組藻的生長速率較快，加快了其對氮的消耗，導致生長過程中提前形成了“氮饑餓”，從而更利于油脂的積累[22-24]。但無機碳的過量添加明顯抑制藻細胞對油脂的轉化積累，從而導致A和B組的藻細胞油脂質(zhì)量均顯著高于C和D組的藻細胞油脂質(zhì)量。

圖6 模擬畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)的小球藻油脂積累情況Fig.6 Accumulation of oil of Chlorella vulgaris in simulated livestock and poultry aquaculture wastewater

圖7 模擬廢水培養(yǎng)小球藻過程中葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素與類胡蘿卜素質(zhì)量濃度的變化Fig.7 Changes of chlorophyll a,chlorophyll b,total chlorophyll and carotenoid mass concentrations in process of cultivating Chlorella vulgaris in simulated wastewater

葉綠素是小球藻進行光合作用的重要色素，其質(zhì)量濃度直接影響小球藻光合效率和自養(yǎng)生長速率[25]。類胡蘿卜素在捕集光能、維持光合作用和消除多余能量等方面具有重要作用[26]。模擬廢水培養(yǎng)小球藻過程中葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素與類胡蘿卜素質(zhì)量濃度的變化如圖7所示。由圖7可見：小球藻中測得的各葉綠素質(zhì)量濃度均呈先增加后減小趨勢，其中，B實驗組中各類葉綠素的質(zhì)量濃度在對數(shù)增長期末期(第4 天)均明顯高于其他實驗組中各類葉綠素的質(zhì)量濃度；在第3和第4天(即小球藻生長對數(shù)增長末期與平臺期)時，實驗組A和實驗組B中的葉綠素a和葉綠素b 的質(zhì)量濃度與第5 天時的并無顯著性差異(p＞0.05)，表明這2 個實驗組藻細胞中葉綠素a 和葉綠素b的質(zhì)量濃度達到最大并穩(wěn)定一段時間后逐漸減少，而實驗組C和實驗組D的變化規(guī)律類似，在第3天時達到最大后迅速下降后并逐漸趨于穩(wěn)定。其中，B 組葉綠素a 質(zhì)量濃度最高達(8.43±0.17)mg/L，比同時期的A，C 和D 組中葉綠素a 質(zhì)量濃度高34.1%，133.7%和56.4%。但是經(jīng)過7 d培養(yǎng)，B組中葉綠素a質(zhì)量濃度卻顯著低于A組葉綠素a質(zhì)量濃度(p＜0.05)，說明經(jīng)過7 d 培養(yǎng)，B 實驗組的光合效率明顯下降。這是因為，第6天時B組的小球藻生長情況顯著優(yōu)于A 組的小球藻生長情況(p＜0.05)(見圖2)，B 組小球藻對模擬廢水中Mg2+的吸收增加，導致第7天時B組中的小球藻在缺鎂條件下生長，嚴重影響B(tài)組葉綠素的合成[27]，故7 d 后B 組的葉綠素質(zhì)量濃度顯著低于A組的葉綠素質(zhì)量濃度。另外，葉綠素b、總葉綠素、類胡蘿卜素質(zhì)量濃度的變化趨勢與葉綠素a 的均一致。A和B組的總葉綠素和類胡蘿卜素水平明顯比同期的C和D組的高，說明適量的無機碳可促進藻的光合作用，從而可釋放更多的能量用于藻對有機碳的吸收(見圖3)。

3 結論

1)小球藻可在有效凈化高質(zhì)量濃度有機畜禽廢水的同時完成自身增殖，有機物、總氮、總磷和NH+4-N 的去除率分別高達(91.0±1.3)%，(97.0±0.6)%，(86.8±3.8)%和100%。

2)一定濃度的無機碳(0.1～1 μmoL/L)可以促進小球藻的生長及其對有機物的吸收，COD 去除率可提高12.9 %～40.4%，同時，油脂和葉綠素轉化積累能力也有一定程度提高。