豐 磊 白芬芬 趙曉媛 劉獻(xiàn)文 劉 磊▲

1.山東省聊城市人民醫(yī)院麻醉科，山東聊城 252000；2.山東省棗莊職業(yè)學(xué)院，山東棗莊 277800

癌性疼痛非常劇烈，嚴(yán)重影響癌癥患者的生存質(zhì)量[1]，而大劑量長時(shí)間的應(yīng)用阿片類藥物鎮(zhèn)痛極易造成耐受甚至痛覺過敏[2-3]，目前國內(nèi)外關(guān)于阿片耐受的研究幾乎都是基于單純嗎啡耐受動(dòng)物模型，但此動(dòng)物模型并不能完全相符合癌性疼痛的臨床實(shí)際[4]。骨癌痛是臨床最常見最頑固的癌痛類型，骨癌痛大鼠模型能夠模擬臨床的實(shí)際情況，是理想的研究癌性疼痛模型。臨床實(shí)踐中，嗎啡是最常用的阿片類藥物，所以對(duì)阿片類藥物耐受研究的常以嗎啡耐受為代表。OX-42 抗體CR3 補(bǔ)體（C3bi）受體反應(yīng)，識(shí)別CD11b 和CD11c（整聯(lián)蛋白αM和αX 鏈）之間共有的表位。該抗體沉淀三種分子量在100kDa 附近的多肽，并抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的玫瑰花結(jié)產(chǎn)生和白細(xì)胞遷移。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）是結(jié)合C-C 趨化因子受體2 型（CCR2）的趨化因子。MCP-1 參與炎癥性疾病，動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥的發(fā)展。其拮抗劑正處于治療這些疾病的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)中[5-6]?？筂CP-1 抗血清可預(yù)防炎性痛覺過敏[7]。有研究表明神經(jīng)病理性疼痛可能與嗎啡耐受存在相似的分子生物學(xué)機(jī)制，可能都和痛覺敏感性增高有關(guān)[8]，小膠質(zhì)細(xì)胞（OX-42）活化可能是嗎啡耐受形成的原因[9-10]。炎性細(xì)胞因子在慢性痛的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[11-12]。傷害性刺激可引起IL-1、IL-6 的增多，其增多的程度與疼痛程度密切相關(guān)[13]。神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞上的TNF-α、IL-1 和IL-6 受體激活可提高神經(jīng)興奮性，從而導(dǎo)致中樞敏化并且提高痛覺敏感性[14]。然而，小膠質(zhì)細(xì)胞（OX-42）的活化及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是否導(dǎo)致骨癌痛大鼠嗎啡耐受仍未可知。這正是本實(shí)驗(yàn)要研究的問題。

1 材料與方法

1.1 一般資料

雌性成年SD 大鼠共72 只，隨機(jī)分為6 組（n=12）：B 組（骨癌痛組）、BM 組（骨癌痛嗎啡耐受組）、BM+Ab 組（骨癌痛嗎啡耐受注射中和抗體組）、BM+IgG 組（骨癌痛嗎啡耐受注射IgG 組）、B+Ab 組（骨癌痛注射中和抗體組）、B+IgG 組（骨癌痛注射IgG 組）。B 組大鼠脛骨髓腔注入5μL（ 2×107個(gè)細(xì)胞/mL）Walker 256 細(xì)胞，第9 天鞘內(nèi)注射生理鹽水4μL，2 次/d，連續(xù)9d；BM 組大鼠脛骨骨髓腔注入5μL（ 2×107個(gè)細(xì)胞/mL）Walker 256 細(xì)胞，第9 天開始每天鞘內(nèi)給予20μg/kg 嗎啡，2 次/d，連續(xù)9d；BM+Ab 組大鼠脛骨骨髓腔注入5μL（2×107個(gè)細(xì)胞/mL）Walker 256 細(xì)胞，第9 天開始鞘內(nèi)注射20μg/kg 嗎啡，2 次/d，連續(xù)9d，第15 天開始每天鞘內(nèi)注射MCP-1 中和抗體10μg，連續(xù)3d；BM+IgG 組大鼠脛骨骨髓腔注入5μL （ 2×107個(gè)細(xì)胞/mL）Walker 256 細(xì)胞，第9 天開始鞘內(nèi)注射20μg/kg 嗎啡，2 次/d，連續(xù)9d，第15 天開始每天鞘內(nèi)注射IgG 10μg，連續(xù)3d；B+Ab 組大鼠脛骨髓腔注入5μL（2×107個(gè)細(xì)胞/mL）Walker 256 細(xì)胞，第9 天開始每日鞘內(nèi)注射NS 4μL，2 次/d，連續(xù)9d，第15 天開始每天鞘內(nèi)注射MCP-1 中和抗體10μg，連續(xù)3d；B+IgG 組大鼠脛骨骨髓腔注入（2×107個(gè)細(xì)胞/mL）Walker 256 細(xì)胞5μL，第9 天開始每日鞘內(nèi)注射NS 4μL，2 次/d，連續(xù)9d，第15天開始每天鞘內(nèi)注射IgG 10μg，連續(xù)3d。

1.2 骨癌痛嗎啡耐受（MTBP）大鼠模型

Walker 256 乳腺癌細(xì)胞（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京，中國）。如前所述制備。簡而言之，當(dāng)腹水變得明顯并稀釋至2×107細(xì)胞/ mL 的密度時(shí)，從大鼠的腹水中收集細(xì)胞。通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉（40mg / kg；Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA）將六組中的大鼠麻醉。接下來，通過將10μL 含有1×105Walker 256 細(xì)胞的Hank’s 平衡鹽溶液（Sigma Aldrich）注射到大鼠的脛骨骨髓腔中來建立骨癌疼痛的動(dòng)物模型。通過連續(xù)鞘內(nèi)注射嗎啡（20μg/ kg，一天兩次； Sigma Aldrich），在細(xì)胞注射后第9 天和第18天之間也誘導(dǎo)嗎啡耐受性，從而建立MTBP 大鼠模型。在第18 天，所有大鼠均被處死。

1.3 免疫組化

OX-42 抗體SC-7898 來自SantaCruz 公司，SP試劑盒（60582471，北京中杉生物技術(shù)有限公司）。將脊髓組織復(fù)溫，置于20%蔗糖溶液中脫水，使用冰凍切片機(jī)冠狀位切片，然后PBS 液清洗。使用3%H2O2處理5min，用PBS 液清洗，使用5%～10%正常山羊血清封閉，在室溫下孵育30 分鐘。傾去血清，然后滴加濃度為1 ∶400 的一抗， 4℃過夜。PBS 沖洗，滴加生物素標(biāo)記二抗，于37℃環(huán)境下孵育10 ～30min。PBS 沖洗，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃孵育10 ～30min。使用PBS 液沖洗，使用DAB 顯色劑顯色。貼片，晾干，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干。

所有大鼠脊髓腰膨大切片時(shí)，每只大鼠取5 張切片，于倒置顯微鏡下使用奧林巴斯照相機(jī)照相，每張切片取5 個(gè)視野，然后用Image-Pro Plus4.5 軟件對(duì)照片進(jìn)行處理，并計(jì)算每個(gè)視野陽性細(xì)胞數(shù)目和積分光密度值，取其均值，然后取5 張切片的均值做為這只大鼠脊髓的陽性細(xì)胞數(shù)（NUM，number）和積分光密度值（IOD，integrated optical density）。

1.4 ELISA

TNF-α 試劑盒 （bsk00162，上海信裕生物科技有限公司）；IL-1 試劑盒 [JK-（a）-0006，上海晶抗生物工程有限公司]；IL-6 試劑盒 （QN-PS1726，上海喬羽生物科技有限公司）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)量資料均以的形式表示，所有組間比較都進(jìn)行單因素方差分析，P ＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鞘內(nèi)注射MCP-1中和抗體后各組大鼠脊髓OX-42表達(dá)的變化比較

與BM 組相比BM+Ab 組大鼠脊髓OX-42 表達(dá)明顯減少（P ＜0.05）。見圖1、表1。

2.2 鞘內(nèi)注射MCP-1中和抗體后各組大鼠脊髓TNF-α、IL-1、IL-6表達(dá)的變化比較

與BM 組相比BM+Ab 組大鼠脊髓TNF-α、IL-1、IL-6 表達(dá)明顯減少（P ＜0.05）。見表2。

3 討論

圖1 各組大鼠脊髓OX-42 表達(dá)情況

表1 各組大鼠脊髓OX-42表達(dá)情況比較

表1 各組大鼠脊髓OX-42表達(dá)情況比較

注：與BM 組大鼠相比，*P ＜0.05

表2 各組大鼠脊髓TNF-α、IL-1、IL-6表達(dá)情況比較）

表2 各組大鼠脊髓TNF-α、IL-1、IL-6表達(dá)情況比較）

注：與BM 組相比，*P ＜0.05

在骨癌早期腫瘤細(xì)胞在骨髓腔內(nèi)生長，產(chǎn)生明顯的骨質(zhì)破壞，可能是骨癌引起疼痛的機(jī)制[16]。在中晚期，腫瘤細(xì)胞也可分泌蛋白溶解酶，對(duì)感覺纖維和交感纖維發(fā)生蛋白溶解作用從而導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛[17]。在骨癌痛大鼠的初級(jí)傳入纖維的脊髓背角區(qū)域，脊髓背角深層神經(jīng)元中c-fos 蛋白和強(qiáng)啡肽表達(dá)增加明顯[18]。這說明外周敏化和中樞敏化是骨癌性疼痛形成的機(jī)制[19-20]，有研究證實(shí)TRPV1 在機(jī)械觸誘發(fā)痛和熱痛覺過敏中起著重要的作用[21]。腫瘤基質(zhì)中的炎癥因子參與了癌性疼痛的發(fā)生。炎癥介質(zhì)HMGB1 和IL-1β 都在脊髓背側(cè)角的表達(dá)增加，并且鞘內(nèi)注射HMGB1 中和抗體可以有效的減輕觸誘發(fā)痛反應(yīng)，并且使IL-1β 的表達(dá)明顯減少。因此，骨腫瘤可能通過誘導(dǎo)HMGB1的表達(dá)來增加脊髓IL-lbeta 的產(chǎn)生從而調(diào)節(jié)脊髓疼痛反應(yīng)[22]。研究表明，含有NR2B 的NMDA 受體增加可能在小鼠骨癌痛的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮重要作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射Nav1.8 反義寡核苷酸能顯著減改善骨癌痛大鼠的疼痛行為學(xué)表現(xiàn)，由此推斷Nav1.8 鈉通道可能參與了骨癌痛的維持[24]。也有研究證實(shí)LPA 作為一種磷脂信號(hào)傳導(dǎo)分子通過外周C 神經(jīng)纖維敏化來誘發(fā)骨癌痛[25]。董航等[26]的研究也發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)給予p38β 反義寡核苷酸能緩解骨癌痛大鼠熱痛敏和機(jī)械性痛敏，并改善疼痛行為學(xué)表現(xiàn)。Jin 等[27]報(bào)道了骨癌疼痛大鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞和脊髓背角中OX-42 和p-Akt 的表達(dá)水平升高。通過鞘內(nèi)注射MCP-1 中和抗體或磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑抑制高表達(dá)。用抑制劑處理后，機(jī)械異常性疼痛減輕。Zhao 等[28]觀察到鞘內(nèi)施用MCP-1中和抗體減少嗎啡抗性并抑制長期施用嗎啡引起的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞刺激。因此，抑制MCP-1 可為嗎啡耐受性管理提供新的治療方法。Yao P 等[29]注意到抗神經(jīng)生長因子的抗體減輕了骨癌疼痛大鼠的痛覺過敏，其作用與μ-阿片受體的增加有關(guān)。在Walker256 腫瘤模型中COX-2 抑制劑DFU 通過抑制腫瘤組織和循環(huán)系統(tǒng)中的MCP-1 的產(chǎn)生發(fā)揮消退腫瘤活性[30]。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)給予MCP-1 中和抗體后骨癌痛嗎啡耐受大鼠脊髓OX-42、TNF-α、IL-1、IL-6 表達(dá)水平顯著降低。推斷MCP-1/CCR2可能是通過活化小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)從而在大鼠骨癌痛嗎啡耐受中發(fā)揮作用。這也為解決臨床實(shí)踐癌痛治療中的阿片耐受問題提供了新的可能靶點(diǎn)和理論依據(jù)。