程子娟 葉桂山 戈玉梅 曹 娜 李肇蕤 劉漫君 朱 琳 夏春波▲

1.桂林醫(yī)學院人體解剖學教研室，廣西桂林 541004；2.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西桂林 541001

熒光示蹤劑具有靈敏性、可靠性及可同時追蹤多重纖維聯(lián)系的特點，是一類有效且應用前景廣闊的神經(jīng)通路追蹤方法。其中伊文思藍（Evans Blue，EB）和DiI[1]（1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocar- bocyanine perchlorate，DiI）是目前較為常見的熒光示蹤劑，在神經(jīng)示蹤研究中均證明了其有效性，但兩者示蹤效果的詳細特性和對比尚不清楚，在本項研究中，將EB 和DiI 注入大鼠海馬進行標記，分析比較腦橋標記細胞的熒光強度和數(shù)目，為神經(jīng)示蹤研究提供客觀參考和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

健康SD 大鼠40 只，體重（250±20）g，購于桂林醫(yī)學院科學實驗中心，合格證號：SCXK 桂2007-000。隨機分成EB 組（n=20）和DiI 組（n=20）。

1.2 主要試劑和設備

EB、DiI 均 購 于 美 國Sigma 公 司，DMSO 購于上海碧云天生物有限公司，腦立體定向儀（日本SR-6），冰凍切片機（德國LEICA CM1860 UV），熒光顯微鏡（日本OlympusIX71FL）。

1.3 神經(jīng)示蹤劑注射

大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3mL/kg），參照大鼠腦立體定位圖譜，選取大鼠左側海馬坐標前囟后3.6mm，中線右旁開3.2mm，硬膜下3.5mm，用顱骨鉆在注射點顱骨鉆孔，分別緩慢注射DiI（2.5mg/mL，DMSO）和EB（5%，DIW）各0.3μL，留針10min。將大鼠飼養(yǎng)72h 后，再次麻醉，用鈍針頭自心尖處小于10°進針插入升主動脈固定，剪開右心耳，先迅速注入PBS 溶液400 ～500mL，使肝臟顏色變淺至發(fā)白，右心耳流出液無色后，4%多聚甲醛200mL 先快后慢灌注固定，隨后立即取腦，置于4%多聚甲醛溶液中4℃條件下固定，24h 后梯度蔗糖脫水。

1.4 樣本采集及鏡下觀察

將脫水完成的腦組織用游標卡尺測量后分段切取，常規(guī)冰凍切片，置于4℃冰箱濕盒避光保存。使用熒光顯微鏡觀察注射部位腦切片，將注射點準確位于海馬的大鼠腦切片分析，摒除定位不準或熒光劑溢出者。

1.5 統(tǒng)計學處理

同一高倍顯微鏡下熒光標記細胞數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 軟件處理，用）表示計量資料，DiI 和EB 組熒光強度差異采用獨立樣本t 檢驗，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 熒光標記細胞形態(tài)學觀測結果

大鼠海馬注射DiI，腦橋部見形態(tài)完整，輪廓清晰，對比鮮明的熒光標記細胞；注射EB，腦橋部熒光標記細胞輪廓不甚明朗，核未清晰顯示，對比不明顯。見圖1。

圖1 兩種不同神經(jīng)示蹤劑追蹤效果（0.3μL，×200，↓：腦橋標記細胞）

2.2 熒光強度測定結果

使用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)對同一解剖部位，5 個不同視野標記細胞進行計量、分析熒光強度，經(jīng)SPSS 18.0 軟件處理，t 檢驗分析DiI 和EB 組數(shù)據(jù)，結果顯示DiI 組熒光強度高于EB 組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01），兩組標記細胞的數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 DiI和EB平均熒光強度和標記細胞數(shù)量測定結果

表1 DiI和EB平均熒光強度和標記細胞數(shù)量測定結果

3 討論

目前研究顯示，神經(jīng)解剖束路追蹤[2]可以闡明神經(jīng)系統(tǒng)的解剖聯(lián)系，借助示蹤劑了解神經(jīng)元之間的傳導通路、鑒別特定神經(jīng)軸突投射的目標神經(jīng)元定位等[3]。隨著熒光成像技術及敏感熒光示蹤劑的發(fā)展為分析神經(jīng)元回路提供了許多新的途徑?，F(xiàn)有神經(jīng)示蹤劑中，不同示蹤劑的追蹤效果差異較大，各有優(yōu)缺點，選擇合適的示蹤劑，對神經(jīng)通路研究十分關鍵。

DiI 作為最近引用的示蹤劑，紫紅色羰花青熒光染料，在549nm 激發(fā)光下可以產(chǎn)生發(fā)射波長為565nm 的紅色熒光，1986 年Honig 等[4]首次確定DiI 可以示蹤活體組織中的神經(jīng)通路，其在固定組織中也可進行順行和逆行示蹤[5-6]。它熒光強，穩(wěn)定可靠，無毒性，神經(jīng)元的電生理幾乎不受影響，有良好的神經(jīng)軸突特異性，對周圍纖維影響小，少見染料在細胞間遷移。DiI 已被廣泛應用到生物體神經(jīng)傳導通路的示蹤研究中[7-11]。EB 是早期發(fā)現(xiàn)的熒光示蹤劑，常應用于示蹤神經(jīng)通路[12-13]和觀察血腦屏障的完整性[14-15]，它在藍光光波的激發(fā)下發(fā)出紅色熒光，激發(fā)波長 545 ～580nm，發(fā)射波長 600nm，熒光顯微鏡下可直接觀察，簡便精確，是追蹤神經(jīng)通路的可靠方法。本研究分析比較DiI 和EB 兩種熒光追蹤劑的詳細標記特性，為神經(jīng)示蹤研究提供實驗依據(jù)。本實驗采用腦立體定位技術將熒光標記物注入大鼠海馬，有研究報道[12]注射EB 后，熒光劑擴散范圍和注射體積有關。本實驗注射熒光劑體積確定，將示蹤劑定為唯一的變量，標記結果顯示，兩種示蹤劑均可用于神經(jīng)示蹤，DiI 標記細胞形態(tài)完整，輪廓清晰，對比鮮明，持續(xù)較長時間不易淬滅。EB 標記神經(jīng)元輪廓不甚明朗，從形態(tài)學上證實了DiI 的神經(jīng)示蹤效果優(yōu)于EB，推測可能是由于DiI 的親脂性及擴散方式與EB 有差異的緣故。此外，熒光標記在腦橋處效果更佳，與常麗榮等[16]的研究結果基本一致，再次證實了海馬與腦橋的纖維聯(lián)系。DiI 和EB 標記神經(jīng)元數(shù)目無顯著性差異，但DiI 組標記熒光強度顯著高于EB 組。因此本研究認為DiI 較EB 而言可能更適合應用于神經(jīng)形態(tài)學的研究，為神經(jīng)定位、標記以及神經(jīng)通路研究提供參考和依據(jù)。