劉少強(qiáng) 陳 偉 劉伯齡 梁珪清▲ 齊 強(qiáng)

1.廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院脊柱外科，福建福州 350007；2.北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科，北京100191

脊柱融合（spinal fusion）是治療脊柱疾病的主要方法之一，已成為治療脊柱骨折、脊柱腫瘤、脊柱退行性病變和脊柱畸形的常規(guī)技術(shù)[1-3]。雖然采用聯(lián)合內(nèi)固定技術(shù)可減少融合失敗的發(fā)生，但臨床上不愈合率仍高達(dá)10%～15%，并導(dǎo)致疼痛、椎間隙塌陷、遲發(fā)性后凸畸形等并發(fā)癥[2]。因此，如何有效地提高脊柱融合率和臨床療效，一直是脊柱外科醫(yī)生亟待解決的問題。

非甾體抗炎藥物（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）在脊柱外科手術(shù)后的疼痛管理中有廣泛應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)，NSAIDs 對骨折愈合有不利影響，如延長愈合時(shí)間、降低骨痂的機(jī)械強(qiáng)度和剛度、增加骨折不愈合率[4-7]。盡管上述學(xué)者報(bào)道了NSAIDs 藥物對骨折愈合的影響，但均未直接模擬脊柱融合手術(shù)，且研究內(nèi)容局限于生物力學(xué)研究，而缺乏組織學(xué)及免疫染色學(xué)等相關(guān)研究，因此尚無法闡明NSAIDs 藥物對脊柱融合術(shù)后椎間植骨塊中成骨細(xì)胞、骨形態(tài)發(fā)生蛋白形成的影響機(jī)制。

本研究擬以日本大耳白兔的脊柱融合為模型，術(shù)后給予不同類非甾體抗炎藥，并于不同愈合期對椎體間植骨界面行組織學(xué)、影像學(xué)、生物力學(xué)進(jìn)行定量比較，以研究不同藥物對椎體間植骨融合的影響差異性，并闡明椎體間植骨融合的生物學(xué)關(guān)鍵環(huán)節(jié)和總體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型

1.1.1 同種異體骨制備 選擇成年雄性日本大耳白兔（健康8 月齡，體重2.5 ～3.0kg），以速眠新Ⅱ注射液0.2mL/kg 對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行肌肉注射以施行全身麻醉，常規(guī)皮膚消毒，在無菌條件下采集髂骨骨材，去除骨膜及周圍軟組織，洗凈骨髓腔，1%新潔爾滅中浸泡30min，置入70%乙醇中浸泡及常溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 脊柱融合手術(shù) 麻醉成功后將其置于右側(cè)臥位，左側(cè)腰背部備皮，常規(guī)皮膚消毒。以肋緣下為標(biāo)志確定L1水平，自肋骨下緣沿橫突水平做長約5cm 橫行切口，切開淺層肌肉，沿橫突間肌肉肌間隙進(jìn)入，暴露L3橫突，用蚊式鉗提拉L3橫突及L4橫突棘間韌帶，充分暴露L3～4間盤。切除L3～4間盤組織，于椎間隙內(nèi)植入已消毒好的同種異體骨。絲線逐層縫合周圍軟組織，包扎固定。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，肌注青霉素40×104U/d，共3d。

1.1.3 分組 按數(shù)字隨機(jī)化分為3 組：雙氯芬酸鈉組、塞來昔布組和對照組，術(shù)后即刻開始服藥。藥物組中雙氯芬酸鈉、塞來昔布的用量按4mg/（kg·d）口服給藥；為避免如胃腸道等不良反應(yīng)，將藥物研磨成粉，均勻分成三份，按早、中、晚混于飼料中，飼料標(biāo)準(zhǔn)為200g/d，連續(xù)藥物喂養(yǎng)2 周；2 周后則正常飼料喂養(yǎng)。而對照組僅按相應(yīng)重量進(jìn)行飼料喂養(yǎng)，不給藥物處理。

1.2 方法

1.2.1 組織學(xué)染色 在術(shù)后4、8、12 周分別取各組動(dòng)物融合節(jié)段行大體標(biāo)本。植骨融合節(jié)段于體積分?jǐn)?shù)7%～10%甲醛脫鈣液脫鈣3 ～4 周，石蠟包埋，切片，行蘇木精-伊紅染色（HE 染色）檢查，100 倍光鏡下比較各組標(biāo)本的骨痂生長情況，并依據(jù)Nilsson 骨愈合組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行評分，見表1。

表1 Nilsson骨愈合組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 影像學(xué)評估 在術(shù)后4、8、12 周，相同條件下（100cm，50kV，KODAK）拍攝所有標(biāo)本側(cè)位X 射線片，X 射線上融合融合標(biāo)準(zhǔn)為：（1）融合節(jié)段出現(xiàn)椎體前方、側(cè)方連續(xù)骨橋形成或椎間連續(xù)骨小梁通過。（2）未出現(xiàn)融合節(jié)段透亮影、植骨下沉、終板和植骨面出現(xiàn)間隙等假關(guān)節(jié)形成的表現(xiàn)。根據(jù)Lane-Sandhu 骨愈合X 線評分標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行評分，見表2。

1.2.3 生物力學(xué)測定 在術(shù)后4、8、12 周，取所有標(biāo)本，保留L3、L4、L5椎體，剔除肌肉、筋膜等軟組織，保留融合骨結(jié)構(gòu)，自椎體中央由前向后插入直徑2.0mm 克氏針，使用電子拉力機(jī)（精度0.01N）進(jìn)行融合節(jié)段（L3～4）及相鄰未融合節(jié)段（L4～5）單向拉伸測試，拉伸負(fù)荷以1cm/min 的位移率通過克氏針施加于2 個(gè)節(jié)段，記錄斷裂時(shí)數(shù)值為該節(jié)段的最大拉伸負(fù)荷值。為減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間生理變異的影響，計(jì)算同一標(biāo)本融合節(jié)段（L3～4）與相鄰未融合節(jié)段（L4～5）的強(qiáng)度比值進(jìn)行比較。

表2 Lane-Sandhu 骨愈合X線評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。三組間的計(jì)數(shù)資料采用單因素方差分析（ANOVA），組間采用兩兩比較q 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α 值取雙側(cè)0.05。

2 結(jié)果

本研究成功建立了45 只雄性日本大耳白兔的脊柱融合動(dòng)物模型，體重平均（2.83±0.18）kg。雙氯芬酸鈉組、塞來昔布組和對照組各包含15 只動(dòng)物模型。在術(shù)后4、8、12 周的每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，分別取各組5 只動(dòng)物的融合節(jié)段制備標(biāo)本，行組織學(xué)、影像學(xué)和生物力學(xué)評價(jià)。

2.1 組織學(xué)結(jié)果

按照Nilsson 骨愈合組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)對各實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行評分，術(shù)后4 周時(shí)雙氯芬酸鈉組、塞來昔布組和對照組的評分分別為（5.9±1.3）分、（6.0±0.9）分和（7.3±1.1）分，雙氯芬酸鈉組和塞來昔布組的評分顯著低于對照組（P ＜0.05）。術(shù)后8 周時(shí)雙氯芬酸鈉組、塞來昔布組和對照組的評分分別為（7.1±1.0）分、（9.3±1.5）分和（10.1±0.8）分，雙氯芬酸鈉組評分顯著低于對照組（P ＜0.05），而塞來昔布組與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后12 周時(shí)雙氯芬酸鈉組、塞來昔布組和對照組的評分分別為（9.7±0.8）分、（11.1±0.7）分和（12.3±0.9）分，雙氯芬酸鈉組評分顯著低于對照組（P ＜0.05），而塞來昔布組與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表3。

表3 各組Nilsson骨愈合組織學(xué)平均評分 s，分）

表3 各組Nilsson骨愈合組織學(xué)平均評分 s，分）

注：與對照組比較，#P ＜0.05

組別 術(shù)后4周 術(shù)后8周 術(shù)后12周雙氯芬酸鈉組 5.9±1.3# 7.1±1.0# 9.7±0.8#塞來昔布組 6.0±0.9# 9.3±1.5 11.1±0.7對照組 7.3±1.1 10.1±0.8 12.3±0.9 F 9.821 20.390 6.379 P 0.031 0.027 0.019

2.2 影像學(xué)觀察及評分

按照Lane-Sandhu 骨愈合X 線評分標(biāo)準(zhǔn)對各實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行評分，術(shù)后4 周時(shí)雙氯芬酸鈉組、塞來昔布組和對照組的評分分別為（3.8±1.1）分、（5.5±0.8）分和（6.3±1.2）分，雙氯芬酸鈉組和塞來昔布組的評分顯著低于對照組（P ＜0.05）。術(shù)后8 周時(shí)雙氯芬酸鈉組、塞來昔布組和對照組的評分分別為（6.4±0.8）分、（9.5±1.5）分和（11.0±0.9）分，雙氯芬酸鈉組評分顯著低于對照組（P ＜0.05），而塞來昔布組與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后12 周時(shí)雙氯芬酸鈉組、塞來昔布組和對照組的評分分別為（8.4±0.9）分、（10.5±1.4）分和（12.8±1.1）分，雙氯芬酸鈉組評分顯著低于對照組（P ＜0.05），而塞來昔布組與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表4。

表4 各組Lane-Sandhu骨愈合X線平均評分分）

表4 各組Lane-Sandhu骨愈合X線平均評分分）

注：與對照組比較，#P ＜0.05

組別 術(shù)后4周 術(shù)后8周 術(shù)后12周雙氯芬酸鈉組 3.8±1.1# 6.4±0.8# 8.4±0.9#塞來昔布組 5.5±0.8# 9.5±1.5 10.5±1.4對照組 6.3±1.2 11.0±0.9 12.8±1.1 F 10.571 9.306 11.528 P 0.012 0.032 0.040

2.3 生物力學(xué)測定

測量各組實(shí)驗(yàn)兔的腰椎融合節(jié)段（L3～4）與相鄰未融合節(jié)段（L4～5）的生物力學(xué)強(qiáng)度，并計(jì)算兩節(jié)段的生物力學(xué)強(qiáng)度比值（L3～4/ L4～5），詳見表5。術(shù)后4 周時(shí)雙氯芬酸鈉組、塞來昔布組和對照組的生物力學(xué)強(qiáng)度比值分別為（1.6±1.0）、（1.7±0.8）和（2.0±0.8），雙氯芬酸鈉組和塞來昔布組顯著低于對照組（P ＜0.05）。術(shù)后8 周時(shí)雙氯芬酸鈉組、塞來昔布組和對照組的生物力學(xué)強(qiáng)度比值分別為（2.1±1.1）、（2.3±0.8）和（2.5±1.3），雙氯芬酸鈉組顯著低于對照組（P ＜0.05），而塞來昔布組與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后12 周時(shí)雙氯芬酸鈉組、塞來昔布組和對照組的生物力學(xué)強(qiáng)度比值分別為（2.4±0.8）、（2.7±0.9）和（2.9±0.8），雙氯芬酸鈉組顯著低于對照組（P ＜0.05），而塞來昔布組與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表5 各組的生物力學(xué)強(qiáng)度比值（L3～4/ L4～5）

3 討論

脊柱的穩(wěn)定性對于維持脊柱的正常功能非常重要，脊柱外科常采用植骨融合術(shù)來獲得中遠(yuǎn)期的穩(wěn)定效果。脊柱融合技術(shù)技術(shù)在過去的數(shù)十年間取得了很大成功。但脊柱融合術(shù)后骨不愈合時(shí)有發(fā)生，可導(dǎo)致疼痛、椎間隙塌陷、遲發(fā)性后凸畸形等并發(fā)癥[10-11]。研究認(rèn)為，脊柱融合術(shù)后植骨融合失效的原因包括技術(shù)因素、力學(xué)因素和生物學(xué)因素[12-13]。其中，生物學(xué)因素是急待解決的重點(diǎn)。由于整個(gè)植骨愈合過程可分為3 個(gè)階段：炎癥期、修復(fù)期和重塑期[14]。骨移植物植入之后，局部發(fā)生炎癥反應(yīng)，由此產(chǎn)生化學(xué)信號(hào)機(jī)因子趨化作用，宿主體內(nèi)的免疫細(xì)胞進(jìn)入植骨塊，血管及基質(zhì)逐漸形成并包繞植骨塊，將多能干細(xì)胞輸送至此，并在移植骨塊內(nèi)分化成熟，通過爬行替代的方法完成修復(fù)和重塑。

研究發(fā)現(xiàn)NSAIDs 藥物緩解術(shù)后患者疼痛的同時(shí)，其還可抑制炎癥過程中緩激肽的釋放，干擾植骨炎癥期的正常進(jìn)行。Gerstenfeld 等[4]報(bào)道53 只閉合性股骨干骨折SD 雄性大鼠，骨折后隨訪分為4組，連續(xù)分別經(jīng)口給生理鹽水、酮咯酸、低劑量帕瑞昔布、高劑量帕瑞昔布組，發(fā)現(xiàn)NSAIDs 藥物均降低骨痂的機(jī)械強(qiáng)度和剛度，造成骨折愈合延遲，其中非選擇性NSAIDs 藥物（酮鉻酸）的影響更大，而選擇性NSAIDs 藥物（帕瑞昔布）的影響相對較小。該研究還觀察對照組大鼠骨折部位的COX 表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)骨痂內(nèi)COX-1 的表達(dá)在骨折后21d 均保持不變，而COX-2 在骨折后持續(xù)高表達(dá)到14d，后逐漸下降，在骨折后21d 回到基線水平。Akman 等[6]同樣報(bào)道雙氯芬酸可顯著影響大鼠脛骨干骨折的愈合強(qiáng)度。陳堅(jiān)等[5]報(bào)道常用非甾體抗炎藥（阿司匹林、布洛芬、雙氯芬酸鈉、美洛昔康、尼美舒利、塞來昔布）對成骨細(xì)胞增殖和骨形成蛋白有不同程度的抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后4 周時(shí)，組織學(xué)、影像學(xué)和生物力學(xué)研究均表明雙氯芬酸鈉組和塞來昔布組實(shí)驗(yàn)兔植骨愈合劣于對照組，術(shù)后8、12 周時(shí)，塞來昔布組與對照組無顯著差異，而雙氯芬酸鈉組仍劣于對照組。NSAIDs 藥物的作用機(jī)制包括：（1）通過抑制環(huán)氧合酶活性，降低前列腺素的合成；（2）抑制淋巴細(xì)胞活性和活化的T 淋巴細(xì)胞的分化，減少對傳入神經(jīng)末梢的刺激；（3）直接作用于傷害性感受器，阻止致痛物質(zhì)的形成和釋放[15]。而環(huán)氧合酶包括COX-1 和COX-2 兩種同工酶：COX-1 屬于原生型酶，在正常生理狀態(tài)下就存在于胃腸道、腎臟等部位，促進(jìn)生理性前列腺素的合成，調(diào)節(jié)正常組織細(xì)胞的生理活動(dòng)，如保護(hù)消化道黏膜，調(diào)節(jié)血管張力等；COX-2 屬于誘生型酶，由損傷或炎癥因子誘導(dǎo)生成，進(jìn)而催化前列腺素合成，產(chǎn)生后續(xù)炎癥反應(yīng)以及疼痛[16-17]。作為非特異性NSAIDs 藥物，雙氯芬酸鈉對COX-1 和COX-2 均有抑制作用，而塞來昔布作為特異性NSAIDs 藥物，僅對COX-2 有抑制作用。因此，非甾體抗炎藥物對植骨融合的影響存在差異，可能與NSAIDs 的藥理機(jī)制不同相關(guān)。術(shù)后4 周時(shí)，選擇性COX-2 和非選擇性COX 抑制劑對脊柱椎間植骨融合均有負(fù)面影響，同時(shí)引起力學(xué)強(qiáng)度的減弱。術(shù)后8 和12 周時(shí)，選擇性COX-2 非抑制劑對骨融合的負(fù)面影響消失，而非選擇性COX抑制劑的負(fù)面影響仍存在。

根據(jù)本研究結(jié)果，脊柱椎間融合術(shù)后患者鎮(zhèn)痛處理時(shí)，我們應(yīng)注意避免過多使用非甾體抗炎藥物（尤其非選擇性COX 抑制劑），以免影響患者術(shù)后椎間植骨的愈合。