郭云霞，高雙喜，周秀平，張志儒，郝慶紅，劉月琴，張英杰

（1.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河北保定071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河北保定071000；3.懷安縣農(nóng)牧局，河北張家口076150）

串葉松香草（Silphium perfoliatumL.）別名松香草，因能夠連續(xù)收割10～12年 （娜日蘇，2006），且葉蛋白質(zhì)含量豐富，可作為一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的飼用植物加以利用，同時其還具有耐熱、抗寒、耐鹽堿、抗蟲能力強等優(yōu)點（王瑋等，2004）。據(jù)報道，串葉松香草富含超氧化物歧化酶（SOD），其SOD活力為112.60 U/mL，僅次于葡萄干和大蒜（劉文海等，2008）。眾多學者從串葉松香草的引種（劉生龍，1995）、應(yīng)用價值及栽培要點（徐善光等，2010）、營養(yǎng)成分及價值分析（譚興和等，2003）、飼喂效果（趙明坤等，2001）及水提液體外抗氧化活性（張薇，2012）、不同生育期營養(yǎng)成分變化及瘤胃降解動態(tài)（聶芙蓉，2009）等方面進行了研究。但是，目前對串葉松香草藥用價值的探索及不同時期的合理運用仍不完善，且對其不同發(fā)育期類SOD活性及抗氧化能力的研究報道較少。本試驗對大葉期和開花期的串葉松香草進行提取，并對其類SOD含量及抗氧化成分的測定，初步確定串葉松香草的適宜收獲期及為牧草資源的合理利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 葉叢期和開花期串葉松香草樣品，采集于保定地區(qū)中贏自然（北京）農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司串葉松香草種植基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 SOD活性測定 將張薇（2012）方法進行改進測定串葉松香草中SOD活性，即鄰苯三酚在堿性條件下會發(fā)生自氧化，加入含有SOD活性的物質(zhì)抑制鄰苯三酚自氧化速率以確定其SOD活性。制備A液：pH 8.2，0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）-鹽酸緩沖溶液（含1 mol/L EDTA-Na2）；B液：4.5 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液。

鄰苯三酚自氧化速率（△A）的測定：25℃水浴中，于10 mL比色管中依次加入A液2.35 mL，蒸餾水2.00 mL，預熱20 min后，加入B液0.15 mL?；旌暇鶆蚝罅⒓礄z測，以A液調(diào)零，在325 nm波長下分別測定初始和1 min后吸光值，兩者之差即為△A。

樣液抑制鄰苯三酚自氧化速率（△A′）的測定：按照上述方法，在加B液之前加入不同劑量的樣液，以確定最佳的1/2△A抑制率，最終確定樣液加入量為20.0μL，加入B液混合均勻后立即檢測，以A液調(diào)零，在325 nm波長下分別測定初始和1 min后吸光值，兩者之差即為△A′。根據(jù)公式計算樣品酶活：

SOD活 力/（U/g）=（△A-△A′）/△A×100%/50%×V0×D/V×V1/m；

式中：△A為鄰苯三酚自氧化速率；△A′為樣液抑制鄰苯三酚自氧化的速率；V為加入樣液的體積，mL；V0為反應(yīng)液總體積，mL；V1為樣液總體積，mL；D為樣液的稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.2 串葉松香草水提液最適提取條件優(yōu)化

1.2.2.1 單因素試驗分析 將新鮮的串葉松香草樣品置于恒溫干燥箱中，105℃15 min，65℃4 h干燥至恒重后，粉碎過40目篩，并密封放于陰涼干燥處備用。用雙蒸水為串葉松香草的提取溶劑，以SOD活性為標準，進行單因素試驗分析。分別對提取時間、提取料液比、提取溫度進行確定。

提取時間的確定：稱取串葉松香草粉1 g，加入10 mL雙蒸水混勻，密封置于室溫下分別于2、4、6、8、10、12、24 h時對提取液進行SOD活性測定，確定最佳提取時間。

料液比的確定：稱取串葉松香草粉1 g，加入10 mL雙蒸水混勻，密封。料液比分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，以最佳提取時間，對提取液進行SOD活性測定，確定適宜料液比。

提取溫度的確定：稱取串葉松香草粉1 g，以最佳料液比和最佳提取時間進行檢測，置于37、4℃和18℃進行提取，對提取液進行SOD活性測定，最終確定提取溫度。

1.2.2.2 提取條件正交試驗優(yōu)化 以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，選取提取時間、料液比、提取溫度為自變量，以SOD活性為測定值，設(shè)計三因素兩水平的正交分析試驗（表1、表2）。

表1 大葉期提取條件正交試驗設(shè)計L4（23）

表2 開花期提取條件正交試驗設(shè)計L4（23）

1.2.3 類SOD成分含量測定

1.2.3.1 串葉松香草中維生素C含量測定 用紫外分光光度法測定串葉松香草中維生素C（VC）的含量，即根據(jù)VC在稀酸溶液中，于245 nm波長處有最大吸收的特性測定VC的含量。

標準曲線的繪制：準確稱取經(jīng)110℃干燥至恒重的抗壞血酸0.010 g，加入10%HCl溶液2 mL后用蒸餾水定容至100 mL，混勻得到濃度為100μg/mL的標準抗壞血酸溶液。梯度量取上述標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL于6支10 mL具塞比色管中，用蒸餾水定容至刻度。以抗壞血酸空白調(diào)零，在245 nm處測定吸光值，并以標準抗壞血酸濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制抗壞血酸標準曲線。

VC標 準 曲 線 公 式：y=0.0598x+0.0159，R2=0.9992。

樣液VC含量的測定：量取0.2 mL樣液于10 mL具塞比色管中，向其中加入0.4 mL 10%的HCl溶液，并用蒸餾水定容至刻度后搖勻。以蒸餾水調(diào)零，在245 nm波長處測定其吸光度值，并根據(jù)標準曲線得出VC的濃度。再根據(jù)如下公式計算出樣液中VC的含量。

式中：X為樣液中維生素C含量，mg/kg；C為樣液中抗壞血酸的濃度，μg/mL；10為樣液定容體積，mL；A為樣液稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3.2 串葉松香草中總黃酮含量測定 測定串葉松香草中總黃酮的含量，依據(jù)黃酮類化合物被NaNO2還原后能與Al3+絡(luò)合形成在堿性條件下顯紅色的絡(luò)合物，于510 nm波長處檢測其吸光值來計算總黃酮化合物的含量。

標準曲線的繪制：準確稱取經(jīng)120℃干燥至恒重的蘆丁標準品0.100 g，用95%的乙醇定容至100 mL，量取15 mL于50 mL容量瓶中，用95%的乙醇定容，即得0.3 mg/mL的蘆丁標準液。分別量取蘆丁標準液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，并用95%的乙醇稀釋至6 mL后，分別加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻后靜置6 min；再加10%Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻后靜置6 min；最后加入10 mL 4%NaOH溶液搖勻，靜置12 min。以蘆丁空白調(diào)零，在510 nm處測定吸光值，并以蘆丁標品溶液的濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

標 準 曲 線 公 式：y=9.5167x+0.0295，R2=0.9935。

樣液總黃酮含量的測定：量取4.0 mL樣液于25 mL容量瓶中，余下按照標準曲線繪制中的操作，測定其吸光度值，并根據(jù)標準曲線得出總黃酮的濃度。再根據(jù)如下公式計算出樣液中總黃酮的含量。

式中：X為樣液中總黃酮含量，mg/kg；C為樣液中蘆丁的濃度，mg/mL；25為樣液定容體積，mL；A為樣品稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3.3 串葉松香草中總多酚含量測定 用福林酚比色法測定串葉松香草中總多酚的含量，即根據(jù)多酚類化合物在堿性溶液中可將鎢鉬酸還原成藍色化合物，于765 nm處有最大吸收的特性測定總多酚的含量。

標準曲線的繪制：制備濃度0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0 mg/L的沒食子酸標準液。分別吸取1.0 mL標準液，各加5.0 mL水、1.0 mL福林酚試劑和3.0 mL碳酸鈉溶液，混勻后放置2 h顯色。以沒食子酸空白調(diào)零，在765 nm波長處測定其吸光值并繪制標準曲線。

樣液總多酚含量的測定：量取0.1 mL樣液代替沒食子酸標準液，余下按照標準曲線繪制中的操作，測定其吸光度，并根據(jù)標準曲線得出總多酚的濃度。總多酚標準曲線公式：y=0.1004x+0.056，R2=0.9999。再根據(jù)如下公式計算出樣液中總多酚的含量。

式中：X為樣液中總多酚含量，mg/kg；C為樣液中沒食子酸的濃度，mg/L；10為樣液定容體積，mL；A為樣品稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 抗氧化能力分析

1.2.4.1 清除羥自由基能力的測定 用水楊酸法測定串葉松香草水提液對羥自由基的清除能力，按表3所示，在具塞試管中依次加入以下各藥品后搖勻，并于37℃水浴中加熱15 min，于510 nm處測定其吸光值。A0測定時，以不加雙氧水的體系調(diào)零；Ax、Ax0測定時，以蒸餾水調(diào)零。

根據(jù)如下公式計算樣液清除羥自由基的速率：

羥自由基清除率/%=[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100；

式中：A0為空白對照的吸光值；Ax為加樣品的吸光值；AX0為試劑空白的吸光值。

1.2.4.2 清除1，1-二苯代苦味酞基（DPPH）能力的測定 用分光光度法測定串葉松香草水提液對DPPH的清除能力，即根據(jù)紫色的DPPH無水乙醇溶液在517 nm處有最大吸收，若向其中加入具有清除DPPH功能的樣液，就可結(jié)合或代替DPPH，使自由基數(shù)量減少，吸光值變小，以此評價樣液對DPPH的清除作用。

制備DPPH溶液：準確稱取DPPH標準品0.005 g，溶于適量無水乙醇中，并超聲5 min，使其充分溶解后，定容至100 mL。取適量DPPH溶液，在517 nm處測定其吸光度，使A=1.2～1.3為最佳。

表3 清除羥自由基試驗方法mL

取DPPH溶液2 mL，向其中由少至多漸加樣液，邊加邊混合并觀察溶液的褪色情況，記下溶液顏色基本褪去時的加樣量，以確定樣液加入量。按表4所示，在具塞試管中依次加以下各藥品后搖勻，避光靜置30 min后，以無水乙醇調(diào)零，在517 nm處測定吸光值。

表4 清除DPPH試驗方法mL

根據(jù)如下公式計算樣液清除DPPH的速率：

式中：A0為空白對照的吸光值；Ax為加樣品的吸光值；Ax0為試劑空白的吸光值。

1.2.4.3 清除超氧陰離子自由基能力的測定用鄰苯三酚法測定串葉松香草水提液對超氧陰離子的清除能力，即鄰苯三酚在堿性條件下自氧化可產(chǎn)生有色中間產(chǎn)物使吸光值增加，此過程中吸光度值與反應(yīng)時間呈線性關(guān)系。當在該反應(yīng)體系中加入抗氧化物質(zhì)后，抗氧化物催化超氧陰離子反應(yīng)為過氧化氫，使有色中間產(chǎn)物生成受阻，鄰苯三酚自氧化的速率降低，吸光值下降，以此作為測定該抗氧化物清除超氧陰離子的依據(jù)。

制備A液：pH 8.2，0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）-鹽酸緩沖溶液（含1 mol/L EDTANa2）；B液：4.5 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液。按表5所示，在具塞試管中依次加入以下各藥品，以A液調(diào)零，在325 nm處測其吸光值。

根據(jù)如下公式計算樣液清除超氧陰離子的速率：

超氧陰離子清除率/%=[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100；

式中：A0為空白對照的吸光值；Ax為加樣品的吸光值；Ax0為試劑空白的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)分析 本試驗的數(shù)據(jù)用Excel進行整理得到均值與方差，并通過SPSS（17.0）軟件進行顯著性分析，以最小顯著差異（LSD）的t檢驗方法，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 串葉松香草水提液的提取條件優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗

2.1.1.1 提取時間確定 由圖1可知，隨著提取時間的延長，不同生長期串葉松香草的SOD活性逐漸上升，在12 h時提取效果最佳，葉叢期與開花期分別為2129.48、2021.73 U/g。因此兩個不同的生長期均選擇12 h的提取時間進行提取。

2.1.1.2 料液比確定 由圖2可知，隨著料液比的減小，不同生長期串葉松香草的SOD活性逐漸上升，在料液比為1∶20時，開花期SOD活力較葉叢期高55.94%（P＜0.05）。在1∶25時兩個時期的提取效果均最佳，其中葉叢期比開花期SOD活力顯著升高了10.83%（P＜0.05）。因此兩個不同的生長期均可選擇1∶25的料液比進行提取。

表5 清除超氧陰離子試驗方法mL

圖1 串葉松香草各生長期不同提取時間的SOD活力

圖2 串葉松香草各生長期不同料液比SOD活力

2.1.1.3 提取溫度確定 由圖3可知，隨著提取溫度的提高，不同生長期串葉松香草的SOD活性逐漸上升，在37℃時提取效果最佳，葉叢期與開花期分別為3912.49、4367.09 U/g。因此兩個不同的生長期均選擇37℃的提取溫度進行提取。

2.2 提取條件正交試驗優(yōu)化 由表6、表7可知，用正交試驗法確定提取條件的最佳組合，各組比較發(fā)現(xiàn)葉叢期與開花期均是料液比為1:25，37℃水浴中浸提12 h時SOD活性最高，分別為4030.12、4445.31 U/g。

2.3 串葉松香草類SOD活性 由表8可知，按最優(yōu)提取方案對串葉松香草的類SOD其他成分進行分析得出，串葉松草開花期維生素C、總黃酮和總多酚含量極顯著高于葉叢期，分別高了34.51%（P＜0.01）、56.59%（P＜0.01）和23.15%（P＜0.01）。

圖3 串葉松香草各生長期不同提取溫度的SOD活力

表6 葉叢期提取條件正交試驗結(jié)果

表7 開花期提取條件正交試驗結(jié)果

表8 串葉松香草類SOD活性成分含量比較mg/kg

2.4 串葉松香草提取液的抗氧化能力檢測 由表9可知，串葉松香草開花期清除羥自由基和DPPH的能力極顯著高于葉叢期，分別增加了205.65%（P＜0.01）和12.20%（P＜0.01）；開花期清除超氧陰離子的能力較葉叢期降低8.39%（P＜0.05）。

表9 不同生長期串葉松香草對自由基的清除率%

3 討論

串葉松香草為多年生草本植物，其提取液具有抗糞腸球菌和大腸桿菌的功能（Kowalski，2007）。Shang等（2017）利用響應(yīng)面法對串葉松香草活性成分提取條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明，以水料比為15 mL/g，提取時間為61 min，提取溫度為97℃的工藝提取的多糖濃度最高，且冷凍干燥所保留的抗氧化活性物質(zhì)濃度最高。本試驗結(jié)果顯示，1∶25料液比，37℃，提取12 h時得到串葉松香草水提液，葉叢期SOD活力為4030.12 U/g，開花期為4445.31 U/g。有機體生理代謝過程中細胞均會產(chǎn)生活性氧（ROS），在正常代謝下，細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，只有當ROS的產(chǎn)生與清除失去平衡時，才會引起氧化脅迫，多余的ROS會導致生物大分子、生物膜發(fā)生可逆或不可逆損傷，甚至引起細胞死亡。在活性氧清除反應(yīng)中首先啟動的抗氧化酶是SOD，通過歧化超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為氧分子和過氧化氫（H2O2），然后經(jīng)過氧化氫酶和谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)，將H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)樗头肿友酰╕ergaliyev等，2016），解除氧脅迫，保證機體健康。開花期SOD活力顯著增加，表明串葉松香草在開花期的抗氧化能力強于葉叢期，且開花期類SOD活性成分VC、總黃酮和總多酚的含量分別比大葉期極顯著增加了34.51%、56.59%和23.15%。本研究發(fā)現(xiàn)開花期比葉叢期總黃酮的含量極顯著升高。黃酮類化合物可通過與金屬離子螯合阻斷自由基生成或與脂質(zhì)過氧基（ROO·）反應(yīng)，阻斷脂質(zhì)的過氧化過程或阻斷自由基所引發(fā)的連鎖反應(yīng)，達到清除氧自由基和抗氧化的效果。據(jù)報道，VC清除DPPH的能力強于黃酮和蘆丁，同時VC與黃酮復配抗氧化能力強于各自單獨的功能（劉軍軍，2014）。

DPPH是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，當羥自由基的有效濃度降低時，表明該物質(zhì)能將其清除。一般情況下，植物開花期的抗氧化酶活性要高于營養(yǎng)生長階段，對于多年生植物，在適應(yīng)了生存環(huán)境后，在生長旺盛階段，體內(nèi)的抗氧化酶對于環(huán)境的脅迫反應(yīng)更敏感，更能快速的清除多余的氧自由基。Almeselmani等（2006）證實，在高溫脅迫試驗中，小麥的抗氧化酶活性均為開花期明顯高于營養(yǎng)生長階段。本試驗結(jié)果表明，開花期比葉叢期串葉松香草提取液清除羥自由基和DPPH的能力極顯著增加了205.65%和12.20%。超氧陰離子是體內(nèi)重要的自由基之一，同時也是所有活性氧自由基的前體，是導致自由基連鎖反應(yīng)的啟動者，其可經(jīng)過一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化生成H2O2、羥自由基（·OH）和單線態(tài)氧（1O2），作為生理環(huán)境中的毒性因子，引發(fā)一系列疾病。本試驗結(jié)果表明，在開花期超氧陰離子極顯著低于葉叢期。綜上表明，開花期比葉叢期具有更強的抗氧化能力。

4 結(jié)論

4.1 通過單因素和正交試驗，確定葉叢期與開花期串葉松香草SOD提取條件為：料液比1∶25，溫度37℃，浸提時間12 h，此時提取液SOD活性分別為4030.12、4445.31 U/g。

4.2 串葉松香草水提液，開花期類SOD成分VC、總黃酮和總多酚含量較叢葉期分別極顯著增加34.51%、56.59%和23.15%，同時清除羥自由基和DPPH的能力分別極顯著增加205.65%和12.20%。