李蒙蒙，王雨萱，唐蕾,*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

血紅素(heme)是一種含鐵卟啉化合物，又稱為血紅素鐵，是血紅蛋白和肌紅蛋白的重要組成部分，參與生物體內(nèi)的電子傳遞、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等重要的生理生化反應(yīng)過(guò)程。在大腸桿菌中主要以C5途徑合成血紅素，如圖1所示，其生物合成受到嚴(yán)格調(diào)控[1-2]。血紅素也是許多過(guò)氧化物酶的輔基，其生物合成量對(duì)過(guò)氧化物酶的活性具有重要作用，如提高血紅素的合成有利于抗壞血酸過(guò)氧化物酶[3]、染料脫色過(guò)氧化酶[4]活性的提高。而且血紅素鐵有易于被吸收、無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)，因而作為食品添加劑、補(bǔ)鐵劑等被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)[5]。

圖1 大腸桿菌血紅素合成途徑Fig.1 The heme synthesis pathway of E.coli

鐵離子是大多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，胞內(nèi)鐵離子過(guò)多或過(guò)少都會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響，同時(shí)血紅素的生物合成也受到鐵的可用性調(diào)節(jié)[6]。鐵攝取調(diào)節(jié)子(ferric uptake regulator，F(xiàn)ur) 是細(xì)菌鐵離子代謝中最重要的調(diào)節(jié)子，鐵的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控由Fur蛋白介導(dǎo)。此外，F(xiàn)ur還參與細(xì)菌的能量代謝、抗酸能力、毒力和氧化應(yīng)激等多種生物過(guò)程的調(diào)節(jié)[7]。Fur通過(guò)抑制或者激活基因的轉(zhuǎn)錄，來(lái)調(diào)節(jié)與鐵攝取、利用和儲(chǔ)存相關(guān)的基因，維持胞內(nèi)鐵離子濃度動(dòng)態(tài)平衡[8-9]，而在血紅素合成途徑的最后一步中，原卟啉Ⅸ在亞鐵鰲合酶的作用下鰲合Fe2+生成血紅素[10]，但關(guān)于fur基因?qū)Υ竽c桿菌(Escherichacoli)血紅素合成的影響未見進(jìn)一步的研究。

本文以E.coliBL21為出發(fā)菌株，通過(guò)對(duì)鐵攝取調(diào)節(jié)子Fur蛋白基因fur的過(guò)量表達(dá)，分別探究了不同條件下fur基因?qū)w生長(zhǎng)、鐵離子濃度、血紅素合成、血紅素合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平的影響，為尋找提高血紅素合成策略提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 本研究中使用的菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑及儀器

限制性內(nèi)切酶(EcoR I，XhoI)、T4DNA連接酶、DNA聚合酶:寶生物工程(大連)有限公司；2,2′-聯(lián)吡啶(2,2′-dipyridyl，dip):阿拉丁試劑公司；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside， IPTG)、硫酸卡那霉素(Kan)、氨芐青霉素鈉(Amp):生工生物工程(上海)股份有限公司；胰蛋白胨、NaCl、酵母粉:國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

核酸電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司；可見光分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；Enspire多標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)(酶標(biāo)儀)，珀金埃爾默有限公司；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，德國(guó)布魯克公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

細(xì)菌肉湯培養(yǎng)基(LB)(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，固體LB培養(yǎng)基加入20 g/L的瓊脂。

限鐵培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加終濃度為200 μmol/L的Dip。

搖瓶發(fā)酵條件：250 mL搖瓶裝液量50 mL，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)。在菌株構(gòu)建和發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)基添加的氨芐青霉素和硫酸卡那霉素終質(zhì)量濃度分別為100和50 mg/L，IPTG終濃度0.2 mmol/L。

1.2 鐵攝取調(diào)節(jié)子基因過(guò)表達(dá)重組菌的構(gòu)建

(1)引物設(shè)計(jì)及合成：通過(guò)NCBI下載fur基因序列，利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物，在5′端分別引入EcoRI 與XhoI限制性酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。引物序列及限制性酶切位點(diǎn)見表2。

表2 過(guò)表達(dá)菌株構(gòu)建所用引物Table 2 List of primers used in the construction of over expressing strains

注：″-GCG-″為保護(hù)堿基，″-GAATTC-″與″-CTCGAG-″分別為EcoRI 與XhoI限制性酶識(shí)別序列。

(2)產(chǎn)物擴(kuò)增與連接：以E.coli基因組DNA為模板，以相應(yīng)引物對(duì)fur基因的全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后先加A尾后，再進(jìn)行連接pMD19-T載體，將連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化E.coliJM109中，挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的保菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將上述驗(yàn)證正確的質(zhì)粒pMD19-T-fur與pET28a質(zhì)粒進(jìn)行酶切40 min，膠回收后進(jìn)行16 ℃過(guò)夜連接。

(3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性克隆驗(yàn)證：將連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化E.coliJM109中，挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的保種。重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖2所示。測(cè)序正確的質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主E.coliBL21中，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行保種，并名為Eco/pEF。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-fur示意圖Fig.2 Scheme of recombinant plasmid pET28a-fur

1.3 重組蛋白表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)

參照文獻(xiàn)陳丹園等[11]實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)重組菌株蛋白表達(dá)情況。

1.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將各菌株于37 ℃、200 r/min搖床上過(guò)夜培養(yǎng)后以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基及限鐵培養(yǎng)基中，相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)到2 h時(shí)，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，每間隔2 h取樣測(cè)定菌液在600 nm下的吸光值，每株菌3個(gè)平行，共測(cè)定12 h的數(shù)據(jù)。

1.5 ICP-MS法測(cè)定胞內(nèi)鐵含量

參考文獻(xiàn)[12]利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)測(cè)定胞內(nèi)鐵含量。

將過(guò)夜活化的菌株按1%的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)，培養(yǎng)2 h后加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)5 h后收集菌體。用含有5 mmol/L EDTA的磷酸鹽PBS緩沖液清洗2遍(10 000 r/min，5 min)，再用不含有EDTA的PBS緩沖液清洗菌體2遍(10 000 r/min，5 min)，之后轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中 105 ℃過(guò)夜烘干；分別稱取干重后加5 mL濃硝酸進(jìn)行石墨消解120 ℃ 45 min，經(jīng)蒸發(fā)后使用超純水定容到50 mL，之后用于ICP-MS測(cè)定，得到樣品鐵的濃度。計(jì)算方法如公式(1)、(2)：

(1)

(2)

式中：A為菌體干重，mg；B為定容體積，50 mL；C為樣品質(zhì)量濃度，g/L；D為鐵質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.6 血紅素及5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)濃度測(cè)定

將各菌株于37 ℃、200 r/min搖床上過(guò)夜培養(yǎng)后以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基及限鐵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到2 h時(shí)加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h后取樣測(cè)定血紅素及卟啉物質(zhì)的含量。根據(jù)參考文獻(xiàn)陳丹園等[11]、MICHENER等[13]利用熒光法測(cè)定血紅素濃度。血紅素合成的前體物質(zhì)ALA的測(cè)定參照Z(yǔ)HANG等[14]。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

各菌株于37 ℃、200 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)后以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接新鮮LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 h后加入IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后12 000 r/min、4 ℃、5 min收集菌體，用50 g/L的溶菌酶37 ℃破壁30 min。之后按照TaKaRa試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行總RNA提取，提取的RNA濃度及純度使用核酸定量?jī)x測(cè)定，然后RNA直接反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于熒光定量實(shí)驗(yàn)。以上述cDNA為模板，熒光定量PCR引物見表3，選擇編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶的基因gapA作為內(nèi)參基因，采用SYBR? Green I嵌合熒光法，反應(yīng)體系參照試劑盒說(shuō)明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵攝取調(diào)節(jié)子基因過(guò)表達(dá)重組菌的構(gòu)建

2.1.1 基因fur片段的擴(kuò)增與連接

提取E.coliBL21基因組，以E.coliBL21基因組為模板，以fur-P-F/fur-P-R為引物擴(kuò)增目的片段。擴(kuò)增片段如圖3所示。由圖3可知，片段大小與理論值相符，目的片段擴(kuò)增成功。

2.1.2 擴(kuò)增產(chǎn)物連接與轉(zhuǎn)化

擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMD19-T載體，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，如圖4-A。雙酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果正確。將pET28a空載質(zhì)粒進(jìn)行相同的雙酶切，如圖4-B。由圖4可知酶切驗(yàn)證正確，膠回收后16 ℃過(guò)夜進(jìn)行連接。

表3 熒光定量PCR引物Table 3 Primers used in RT-qPCR

M-DNA marker；1-基因fur圖3 目的基因fur的擴(kuò)增Fig.3 Amplification of the target gene fur

A-質(zhì)粒pMD19-T-fur雙酶切;B-質(zhì)粒pET28a雙酶切圖4 質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證Fig.4 Double enzyme digestion verification of plasmid注：M-DNA marker；A-1：基因fur；B-1：酶切后的pET28a。

2.1.3 陽(yáng)性克隆篩選與鑒定

將連接產(chǎn)物熱轉(zhuǎn)化到克隆宿主E.coliJM109中，在Kan抗性平板上篩選陽(yáng)性克隆單菌落，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖5所示。

M-DNA marker；1-重組質(zhì)粒pET28a-fur雙酶切后的凝膠電泳圖5 重組質(zhì)粒pET28a-fur的雙酶切驗(yàn)證Fig.5 Verification of recombinant plasmid pET28a-fur by double enzyme digestion

由圖5可知，雙酶切條帶驗(yàn)證正確。之后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將測(cè)序正確的單克隆保種后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并將其命名為Eco/pEF。

2.1.4 重組蛋白表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)

為了檢測(cè)鐵攝取調(diào)節(jié)子基因fur過(guò)表后產(chǎn)生的蛋白是否可溶，對(duì)Eco/pEF菌株誘導(dǎo)然后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，蛋白Fur分子質(zhì)量約為17 kDa，其蛋白的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。

M-Marker；1-E.coli BL21全細(xì)胞；2-E.coli BL21 破碎上清；3-E.coli BL21破碎沉淀；4-Eco/pEF誘導(dǎo)后全細(xì)胞；5-Eco/pEF誘導(dǎo)破碎上清；6-Eco/pEF誘導(dǎo)破碎沉淀圖6 重組蛋白的檢測(cè)Fig.6 Detection of recombinant protein

由圖6可知，在誘導(dǎo)后的全細(xì)胞中即第4泳道、在破碎細(xì)胞的上清中即第5泳道及在誘導(dǎo)破碎后的沉淀中即第6泳道都檢測(cè)到Fur蛋白的條帶，第5泳道的Fur蛋白條帶說(shuō)明重組菌中有可溶性表達(dá)的Fur。以泳道1的Fur條帶為參照，通過(guò)Image Lab軟件對(duì)泳道4、5、6的Fur條帶進(jìn)行掃描定量，其蛋白表達(dá)量分別增加了12.23、9.47、8.49倍。因此，F(xiàn)ur蛋白表達(dá)量增加，重組菌株Eco/pEF可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.2 鐵攝取調(diào)節(jié)子基因過(guò)表達(dá)對(duì)重組菌生長(zhǎng)的影響

由于Fur蛋白調(diào)控鐵代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，而鐵元素對(duì)于細(xì)菌的生長(zhǎng)和生理過(guò)程又至關(guān)重要。為了分析Fur的過(guò)表達(dá)是否能夠影響菌株的生長(zhǎng)，我們測(cè)定了野生型(wild)與fur過(guò)表達(dá)菌株(Eco/pEF)在LB培養(yǎng)基和限鐵培養(yǎng)基中(LB+Dip培養(yǎng)基)中的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果如圖7所示。

圖7 菌株在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線Fig.7 Growth curve of each strain under different culture conditions

由圖7可知，相比于對(duì)照組(wild)，LB培養(yǎng)條件下鐵攝取調(diào)節(jié)子基因fur的過(guò)表達(dá)抑制了Eco/pEF菌株的生長(zhǎng)；對(duì)照LB培養(yǎng)條件下，限鐵條件下wild菌株與Eco/pEF菌株的生長(zhǎng)均受到抑制；同時(shí)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，限鐵條件下Eco/pEF菌株的生長(zhǎng)進(jìn)一步受到抑制。此結(jié)果說(shuō)明，鐵攝取調(diào)節(jié)子基因fur的過(guò)表達(dá)會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)；并且由缺鐵條件下菌體生長(zhǎng)受到抑制可以進(jìn)一步說(shuō)明胞外鐵離子濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)至關(guān)重要。我們推測(cè)鐵攝取調(diào)節(jié)子基因fur的過(guò)表達(dá)引起了菌株胞內(nèi)鐵離子含量的變化，進(jìn)而影響了菌株的生長(zhǎng)代謝。

2.3 鐵攝取調(diào)節(jié)子基因過(guò)表達(dá)對(duì)重組菌胞內(nèi)鐵離子濃度的影響

一方面，鐵元素對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)是必需的，鐵含量減少時(shí)會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)；另一方面，過(guò)量的鐵又會(huì)引起Fenton反應(yīng)來(lái)毒害細(xì)胞[15]。所以，細(xì)胞內(nèi)鐵含量的穩(wěn)態(tài)對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)是必需的。在絕大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌中，F(xiàn)ur是調(diào)控鐵吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。因此，我們通過(guò)ICP-MS方法測(cè)定了LB培養(yǎng)條件下與LB+Dip培養(yǎng)條件下wild菌株與Eco/pEF菌株中鐵離子的含量。結(jié)果如圖8所示。

圖8 不同培養(yǎng)條件下菌株胞內(nèi)總鐵含量Fig.8 Total intracellular iron content of strains under different culture conditions

由圖8可知，LB培養(yǎng)條件下，鐵攝取調(diào)節(jié)子基因過(guò)表達(dá)菌株Eco/pEF的胞內(nèi)鐵離子含量減少；鐵攝取調(diào)節(jié)子Fur蛋白作為細(xì)菌胞內(nèi)鐵離子濃度感受器和鐵離子依賴性轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白，在有亞鐵離子作為輔因子的條件，F(xiàn)ur與Fe2+形成Fur-Fe2+復(fù)合物對(duì)鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有轉(zhuǎn)錄抑制作用[16-17]。Fur蛋白大量存在時(shí)，與Fe2+結(jié)合形成的Fur-Fe2+復(fù)合物會(huì)抑制鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的表達(dá)，因而鐵離子含量減少。

由圖8可以看出，LB+Dip培養(yǎng)條件下，菌株胞內(nèi)鐵離子均顯著減少。菌株胞內(nèi)鐵離子的減少，會(huì)造成胞內(nèi)鐵離子代謝的不平衡，從而影響菌體的生長(zhǎng)。由于外源鐵螯合劑Dip的加入，使菌體處于相對(duì)缺鐵的環(huán)境，菌體鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收會(huì)進(jìn)一步受到限制，所以其菌體胞內(nèi)鐵離子含量顯著減少，同時(shí)菌體的生長(zhǎng)也受到顯著限制。

綜上結(jié)果表明，F(xiàn)ur蛋白的過(guò)表達(dá)對(duì)菌體生長(zhǎng)不利，會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)鐵離子量減少?gòu)亩咕w的生長(zhǎng)受到抑制。外源環(huán)境缺鐵時(shí)，菌體胞內(nèi)鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)受到影響，胞內(nèi)鐵離子濃度進(jìn)一步減少，菌體生長(zhǎng)受到的抑制更顯著。

2.4 鐵攝取調(diào)節(jié)子基因過(guò)表達(dá)對(duì)血紅素合成的影響

在大腸桿菌中，血紅素合成途徑中的前體物質(zhì)ALA是血紅素合成的限速步驟[18]；另外，原卟啉Ⅸ在亞鐵鰲合酶的作用下鰲合鐵離子形成血紅素也是其中的一個(gè)限速步驟[19]。為了分析鐵攝取調(diào)節(jié)子Fur蛋白對(duì)血紅素合成途徑的影響，以明確Fur蛋白在血紅素合成途徑中的作用，本研究按照1.6的方法對(duì)不同條件下培養(yǎng)后的wild菌株與Eco/pEF菌株進(jìn)行血紅素及前體物質(zhì)ALA的測(cè)定。結(jié)果如圖9所示。

a-ALA質(zhì)量濃度;b-血紅素質(zhì)量濃度圖9 菌株的ALA與血紅素含量Fig.9 Content of ALA and heme of strains

由圖9可知，LB培養(yǎng)條件下，過(guò)表達(dá)菌株Eco/pEF的血紅素合成量降低，胞外ALA的合成量增加，說(shuō)明Fur蛋白的過(guò)量產(chǎn)生對(duì)血紅素的合成有抑制作用；限鐵條件下，過(guò)表達(dá)菌株Eco/pEF的血紅素合成量增加，胞外ALA的合成量減少，說(shuō)明限鐵條件下Fur蛋白的過(guò)量產(chǎn)生卻促進(jìn)了血紅素的合成，由于血紅素在細(xì)胞呼吸、電子傳遞、氧氣運(yùn)輸及信號(hào)傳導(dǎo)等生理過(guò)程中具有重要作用[20]，推測(cè)可能在限鐵條件下，F(xiàn)ur蛋白的過(guò)量產(chǎn)生使鐵離子更多地流向血紅素合成途徑，以維持細(xì)胞一些重要的生理活動(dòng)和生長(zhǎng)。

2.5 鐵攝取調(diào)節(jié)子基因過(guò)表達(dá)對(duì)血紅素合成途徑關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

由于在生物體內(nèi)血紅素的合成途徑是高度保守和嚴(yán)格調(diào)控的，并且會(huì)受到自身血紅素合成量的反饋調(diào)控。為了進(jìn)一步分析過(guò)量表達(dá)鐵攝取調(diào)節(jié)子基因fur對(duì)血紅素合成途徑基因的影響，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)重組菌株的血紅素合成途徑的關(guān)鍵酶基因gltX、hemA、hemL、hemB、hemC、hemD、hemE、hemF、hemG、hemH的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR，其基因轉(zhuǎn)錄水平的變化結(jié)果如圖10所示。

圖10 不同培養(yǎng)條件下重組菌株血紅素合成酶基因轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.10 Transcription level of the heme synthase gene of recombinant strains under different culture conditions

由圖10可以看出，兩種培養(yǎng)條件下重組菌株Eco/pEF中過(guò)表達(dá)的基因fur的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，說(shuō)明基因得到成功表達(dá)。此外，LB培養(yǎng)條件下，fur基因的過(guò)表達(dá)使得大部分血紅素合成途徑基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生不同程度的上調(diào)，其中上調(diào)水平變化較大的是gltX、hemB、hemC，分別上調(diào)了4.93倍、4.61倍和9.39倍；血紅素合成途徑的最后一個(gè)限速步驟中的關(guān)鍵酶基因hemH的轉(zhuǎn)錄水平輕微上調(diào)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)另一個(gè)限速步驟中的關(guān)鍵酶基因hemA的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，在血紅素合成途徑中(圖1)，hemA基因編碼的谷氨酰-tRNA還原酶催化谷氨酰-tRNA往下游合成ALA，ALA再往下游合成血紅素，當(dāng)前體物質(zhì)合成不足時(shí)，會(huì)影響下游血紅素的合成。因此，LB培養(yǎng)條件下，fur基因的過(guò)表達(dá)并未使血紅素合成量提高。

與此相反的是，限鐵條件下(LB+Dip)鐵攝取調(diào)節(jié)子基因fur的過(guò)表達(dá)使血紅素的合成相比于wild有所增加(圖9)，由圖10可知，血紅素合成途徑的關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平都處于不同程度的上調(diào)狀態(tài)，以基因hemB與hemG上調(diào)最為明顯，分別上調(diào)了5.59和4.49倍，同時(shí)發(fā)現(xiàn)基因hemL與hemH分別上調(diào)了2.60與2.40倍?；騢emB編碼的ALA脫水酶催化前體物質(zhì)ALA合成膽色素原，膽色素原再經(jīng)酶促反應(yīng)合成血紅素的前體卟啉物質(zhì)，基因hemG編碼的原卟啉原Ⅸ氧化酶催化原卟啉原Ⅸ合成原卟啉Ⅸ；基因hemH編碼的亞鐵鰲合酶催化原卟啉Ⅸ合成血紅素(圖1)。因此，限鐵條件下鐵攝取調(diào)節(jié)子基因fur的過(guò)表達(dá)使血紅素的合成量有所增加，以維持細(xì)胞正常的生理活動(dòng)。

同時(shí)，以上結(jié)果也表明血紅素的合成受到嚴(yán)格的調(diào)控，F(xiàn)ur蛋白、鐵離子及血紅素合成途徑基因的表達(dá)三者之間相互影響與作用，共同調(diào)控血紅素的合成。

3 討論

鐵是血紅素的重要組成部分，也是生物生長(zhǎng)代謝的必需元素，其表達(dá)調(diào)控受多種因素的制約[21-23]。鐵攝取調(diào)節(jié)子Fur對(duì)鐵有全局調(diào)控作用，而在血紅素合成的最后一步中，需要在亞鐵鰲合酶的作用下鰲合鐵離子生成血紅素。已有研究表明Fur同系物FurA蛋白調(diào)控魚腥藻(Anabaenasp.)的鐵穩(wěn)態(tài)和血紅素合成[24]。通過(guò)過(guò)表達(dá)和轉(zhuǎn)錄分析，GONZALEZ等[25]發(fā)現(xiàn)FurA抑制Anabaenasp.的hemB與hemC表達(dá)，同時(shí)激活hemH的表達(dá)。本研究結(jié)果表明,與魚腥藻不同，大腸桿菌fur基因的過(guò)量表達(dá)抑制了hemA的表達(dá)，顯著上調(diào)了gltX、hemB、hemC的表達(dá)，而限鐵條件下hemB進(jìn)一步上調(diào)，由此可見，以gltX、hemA、hemB、hemC為靶點(diǎn)，結(jié)合Fur與鐵的調(diào)控，可為控制E.coli胞內(nèi)血紅素的含量提供一個(gè)新的策略。

此外，fur對(duì)需要血紅素參與的細(xì)胞生理過(guò)程和以血紅素為輔基的蛋白表達(dá)也會(huì)產(chǎn)生顯著影響。FU等[26]發(fā)現(xiàn)在奧奈達(dá)希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)的fur突變菌株中，血紅素b的合成、細(xì)胞色素c的水平以及細(xì)胞呼吸活性發(fā)生改變；COLPA等[27]在異源表達(dá)脫色過(guò)氧化物酶時(shí)發(fā)現(xiàn)，重組蛋白表達(dá)量的增加并未提升酶的活性，原因在于與重組酶結(jié)合的是缺乏鐵的血紅素前體原卟啉Ⅸ，而非血紅素。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)ur的過(guò)量表達(dá)抑制了菌體的生長(zhǎng)和血紅素的合成。Fur對(duì)鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄有抑制作用[17]，F(xiàn)ur的大量表達(dá)會(huì)抑制鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，造成胞內(nèi)鐵離子含量減少，進(jìn)而限制了參與血紅素合成途徑最后一步的亞鐵螯合酶的作用。此外，由于血紅素及前體卟啉物質(zhì)過(guò)多會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[28]，所以菌體生長(zhǎng)受限，相應(yīng)的血紅素需求減少，合成量降低。因此血紅素含量的變化是途徑中的基因表達(dá)水平、鐵離子濃度和菌體生長(zhǎng)狀況的綜合體現(xiàn)。

綜上所述，F(xiàn)ur介導(dǎo)的血紅素合成調(diào)控對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝具有十分重要的意義。然而，不同微生物的調(diào)控機(jī)制存在差異，目前相關(guān)信息還十分有限。大腸桿菌作為模式菌株和常用的基因工程菌，深入研究其Fur、鐵和血紅素之間的相互關(guān)系，在血紅素包括其前體合成以及以血紅素為輔基的重組酶生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。