邵曉雁， 王雪珂， 陳健華， 朱忠政， 孟松樹， 許 青

(1. 同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院腫瘤科，上海 200072; 2. 上海市皮膚病醫(yī)院腫瘤科，上海 200443; 3. 大連醫(yī)科大學(xué)腫瘤干細(xì)胞研究院，大連 116044)

惡性黑色素瘤是一種高度侵襲性的腫瘤，預(yù)后差、嚴(yán)重威脅人類健康[1]。據(jù)報道，中國的晚期黑色素瘤患者約25.5%存在鼠類肉瘤病毒癌基因同源B1(v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1, BRAF)基因突變[2]。2011年8月，維羅非尼(vemurafenib)被批準(zhǔn)用于BRAF突變的轉(zhuǎn)移性晚期黑色素瘤患者[3]。維羅非尼可提高患者的無進展生存期(progression-free survival, PFS)，但大多數(shù)患者6～7個月出現(xiàn)耐藥[4]。維羅非尼耐藥以后，治療手段有限且療效不佳，因此需要探討維羅非尼耐藥后惡性黑色素瘤新的治療手段。

溶瘤病毒(oncolytic virus, OVs)在腫瘤治療方面取得重要突破，但是OVs在惡性黑色素瘤vemurafenib耐藥治療中的價值尚不清楚。既往文獻[5-6]顯示，OVs除對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生直接的溶解作用外，還可誘導(dǎo)表達或釋放鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin, CRT)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)、高遷移率族蛋白1(high mobility group protein 1, HMGB1)、熱休克蛋白90(heat shock protein 90, HSP90)等激起細(xì)胞免疫原性的損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)，進而誘發(fā)非耐藥腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡(immunogenic cell death, ICD)[8-9]。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與免疫機制關(guān)聯(lián)密切[9-10]，本研究旨在細(xì)胞水平上驗證新城疫病毒毒株FMW(Newcastle disease virus, NDV/FMW)對惡性黑色素瘤WM3248/vemurafenib細(xì)胞株的殺傷效應(yīng)，進一步探討NDV/FMW對耐藥細(xì)胞殺傷效應(yīng)的可能免疫機制，為惡性黑色素瘤維羅非尼耐藥的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

人BRAF突變的黑色素瘤WM3248細(xì)胞株和WM3248/vemurafenib細(xì)胞株由Joon Kim實驗室提供[11]；雞胚成纖維細(xì)胞株DF1購自美國ATCC公司；NDV/FMW由大連醫(yī)科大學(xué)孟松樹實驗室提供；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶(Trypsin-EDTA)、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、雙抗(Pen Strep)購自美國Gibco公司；兔抗人cleaved Caspase-3抗體、兔抗人poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)抗體、兔抗人GAPDH抗體購自美國Cell公司；鼠抗人HN抗體和鼠抗人HSP90抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗人CRT多克隆抗體和兔抗人HMGB1抗體購自英國Abcam公司；羊抗兔Alexa Fluor488抗體和羊抗鼠Alexa Fluor 568抗體購自美國Invitrogen公司；米托蒽醌(MTX)購自美國Selleckchem公司；DAPI購自美國Sigma公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自美國Med Chem Express公司；ATP檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Pierce蛋白濃縮管購自美國Thermo Scientific公司；多功能酶標(biāo)儀-PE(多模式微孔板檢測系統(tǒng))購自美國Perkin Elmer公司；激光(掃描)共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司；凝膠成像(蛋白)儀購自美國Bio-Rad公司；流式細(xì)胞分析系統(tǒng)-C6購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人BRAF突變的黑色素瘤WM3248細(xì)胞株和WM3248/vemurafenib細(xì)胞株用含5%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，雞胚成纖維細(xì)胞株DF1用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中按照常規(guī)方法培養(yǎng)。

1.3 病毒滴度測定

感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為0.01的NDV/FMW感染W(wǎng)M3248細(xì)胞株和WM3248/vemurafenib細(xì)胞株，收集上清液進行梯度稀釋，用DF-1細(xì)胞株進行病毒滴度檢測。

1.4 CCK8檢測細(xì)胞存活率

將黑色素瘤細(xì)胞分為4組，WM3248CON組，WM3248NDV/FMW組，WM3248/vemurafenibCON組，WM3248/vemurafenibNDV/FMW組。除對照組外，其他組用MOI=1的NDV/FMW感染黑色素瘤細(xì)胞1h后，更換2%RPMI-1640培養(yǎng)基，將96孔板置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h，每孔設(shè)5個復(fù)孔。待培養(yǎng)時間結(jié)束后向待測孔中加入10μL的CCK-8溶液，將細(xì)胞培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1～4h。用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞培養(yǎng)板在450nm處的光密度值(D450)，并計算分析。

1.5 Western印跡法檢測凋亡及自噬相關(guān)蛋白變化

WM3248細(xì)胞株和WM3248/vemurafenib細(xì)胞株10×105個/皿，分別設(shè)為對照組與NDV/FMW組，MOI=1的NDV/FMW感染1h后，每皿更換3mL無血清RPMI-1640后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。NDV/FMW感染24、48h后，收集上清液濃縮至100μL，并收集細(xì)胞裂解液，用考馬斯亮藍法測定裂解液中的蛋白濃度。取30μg蛋白用10%的分離膠和4%的濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)印到NC膜上，5%的脫脂奶粉封閉2h，然后用兔抗人cleaved Caspase-3抗體，兔抗人PARP抗體，兔抗人GAPDH抗體，鼠抗人HN抗體，兔抗人HMGB1抗體，鼠抗人HSP90抗體4℃冰箱孵育過夜，用TBST洗滌2次，每次10min，后加入1∶10000的二抗室溫孵育1h，用TBST洗滌2次后顯影。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測CRT表達

MOI=1的NDV/FMW處理WM3248細(xì)胞株和WM3248/vemurafenib細(xì)胞株48h，胰酶消化后PBS洗滌2次，加入1∶200稀釋的兔抗人CRT多克隆抗體，冰上孵育1～2h，PBS洗滌，加入1∶1000的羊抗兔AlexaFluor 488抗體，冰上避光孵育30min，PBS洗滌，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面CRT的表達。

1.7 激光共聚焦檢測細(xì)胞表面CRT的表達

MOI=1的NDV/FMW感染W(wǎng)M3248細(xì)胞株和WM3248/vemurafenib細(xì)胞株48h，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定15min后PBS洗滌2遍，加入1∶75稀釋的兔抗人CRT多克隆抗體和鼠抗人HN抗體，孵育2～3h，PBS洗滌，加入1∶1000的羊抗兔Alexa Fluor 488抗體和羊抗鼠Alexa Fluor 568抗體，孵育30min，PBS洗滌后DAPI染色，清洗2次，激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞表面CRT的表達。

1.8 熒光素酶法檢測ATP釋放

WM3248細(xì)胞株和WM3248/vemurafenib細(xì)胞株(1×105/孔)鋪于12孔板，MOI=1的NDV/FMW感染48h后，收集上清液。根據(jù)ENLITEN ATP試劑盒說明書檢測上清液中ATP的含量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 NDV/FMW在WM3248/vemurafenib細(xì)胞株中有效復(fù)制

通過病毒滴度檢測考察病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況。NDV/FMW感染W(wǎng)M3248/vemurafenib細(xì)胞株24、48、72h后，病毒滴度逐漸增加。結(jié)果表明，NDV/FMW在WM3248/vemurafenib細(xì)胞株內(nèi)有效復(fù)制，見圖1。

圖1 NDV/FMW在WM3248/vemurafenib 細(xì)胞株中有效復(fù)制Fig.1 NDV/FMW effectively replicated in WM3248/ vemurafenib cell line

2.2 NDV/FMW降低WM3248/vemurafenib細(xì)胞株存活率并促進細(xì)胞凋亡

NDV/FMW感染W(wǎng)M3248/vemurafenib細(xì)胞株24、48、72h后，細(xì)胞存活率逐漸降低(P<0.001)，見圖2A。Western印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白變化，HN為NDV/FMW感染指示蛋白。NDV/FMW感染W(wǎng)M3248/vemurafenib細(xì)胞株后，cleaved-caspase-3和cleaved-PARP蛋白在48h明顯增加，見圖2B。上述結(jié)果表明，NDV/FMW顯著降低WM3248/vemurafenib細(xì)胞株存活率并促進凋亡。

圖2 NDV/FMW顯著降低WM3248/vemurafenib 細(xì)胞株存活率并促進耐藥細(xì)胞凋亡Fig.2 NDV/FMW significantly reduced cell viability and induced apoptosis in WM3248/vemurafenib cellsA: NDV/FMW感染W(wǎng)M3248/vemurafenib細(xì)胞株24、48、72h后，細(xì)胞存活率逐漸降低，***P<0.001，親本細(xì)胞用藍色*代表，耐藥細(xì)胞用紅色*代表；B: Western印跡法檢測NDV/FMW對WM3248/vemurafenib凋亡的影響

2.3 NDV/FMW誘導(dǎo)WM3248/vemurafenib細(xì)胞株免疫原性死亡相關(guān)分子表達或釋放

NDV/FMW感染W(wǎng)M3248/vemurafenib細(xì)胞株48h后，細(xì)胞膜CRT陽性細(xì)胞數(shù)從1.3%±0.84%增至53.2%±2.56%(P<0.001)，見圖3A。激光共聚焦結(jié)果也顯示NDV/FMW感染耐藥細(xì)胞后，細(xì)胞膜表面CRT表達比對照組明顯增加，HN也表達增加，見圖3B。與對照組相比，NDV/FMW感染W(wǎng)M3248/vemurafenib細(xì)胞株后培養(yǎng)液上清液中的HMGB1和HSP90顯著釋放，ATP分泌增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但NDV/FMW感染W(wǎng)M3248細(xì)胞48h后ATP比對照組有所消耗(P<0.01)，見圖3C、D。結(jié)果表明NDV/FMW誘導(dǎo)WM3248/vemurafenib細(xì)胞株表達或釋放免疫原性死亡相關(guān)分子。

3 討 論

新城疫病毒屬溶瘤病毒的一種，目前應(yīng)用于腫瘤治療的MTH68/H、PV-701、73-T、90D和FMW等毒株均具有良好的溶瘤性[12-13]。既往研究已經(jīng)證明，NDV/FMW可在神經(jīng)膠質(zhì)瘤親本細(xì)胞株U251、肺癌順鉑(DDP)耐藥細(xì)胞株A549/DDP和肺癌紫杉醇(PTX)耐藥細(xì)胞株A549/PTX中復(fù)制，抑制腫瘤細(xì)胞存活率并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或自噬[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，NDV/FMW不僅對惡性黑色素瘤WM3248細(xì)胞株有殺傷作用，也對WM3248/vemurafenib細(xì)胞株起作用。

本研究進一步發(fā)現(xiàn)NDV/FMW對WM3248/vemurafenib細(xì)胞株發(fā)生ICD相關(guān)分子表達的影響，包括細(xì)胞膜表面CRT表達增加、ATP分泌、HMGB1和HSP90釋放。上述分子的變化與ICD的發(fā)生密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞在死亡早期，CRT從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)迅速翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面，腫瘤細(xì)胞膜上的CRT可作為一種“eat me”信號被DC細(xì)胞識別和結(jié)合，促進腫瘤細(xì)胞被DC細(xì)胞識別和吞噬，多種腫瘤模型中已證實抑制CRT的表達使腫瘤細(xì)胞的免疫原性清除[16]。HSP90同樣作為“eat me”信號促進抗腫瘤的免疫原性[17]。HMGB1存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞壞死和凋亡后的細(xì)胞均可釋放HMGB1，HMGB1同樣作為危險信號，有介導(dǎo)細(xì)胞免疫原性的潛力[17]。凋亡細(xì)胞釋放出的ATP被認(rèn)為是“find-me”信號，由此通過ATP的介導(dǎo)將吞噬細(xì)胞聚集在凋亡細(xì)胞周圍，進而促進凋亡細(xì)胞的吞噬和清除[18]。但本研究結(jié)果提示NDV/FMW感染W(wǎng)M3248細(xì)胞后ATP未見釋放增加。既往研究表明，ICD相關(guān)的ATP分泌是涉及多種分子的復(fù)雜途徑，如自噬(ATG 5、ATG 7和BCN 1)、溶酶體外吞(LAMP 1、VAMP 1)、凋亡(Caspases)、膜泡(ROCK 1，肌球蛋白Ⅱ)和質(zhì)膜透性(Panx 1)等[19]。這些系統(tǒng)中任何分子的缺失都可造成細(xì)胞分泌的ATP減少，這意味著細(xì)胞自噬、溶酶體功能、caspase活化、膜泡和質(zhì)膜通透性的改變可能對WM3248細(xì)胞ATP的分泌產(chǎn)生影響，需做進一步探討。

圖3 NDV/FMW誘導(dǎo)WM3248/vemurafenib細(xì)胞株免疫原性死亡相關(guān)分子表達或釋放Fig.3 NDV/FMW induced the expression or release of immunogenic cell death related molecules in WM3248/vemurafenib cellsA: 流式細(xì)胞術(shù)檢測耐藥細(xì)胞表面CRT百分比，**P<0.01，***P<0.001；B: 激光共聚焦檢測細(xì)胞表面綠色熒光增強，綠色熒光代表CRT，紅色熒光代表NDV/FMW特異性HN蛋白，藍色熒光代表DAPI，米托蒽醌(mitoxantrone，MTX)為陽性對照；C: Western印跡法檢測耐藥細(xì)胞上清液中HMGB1和HSP90的釋放；D: 熒光素酶法檢測ATP釋放，*P<0.05，**P<0.01

本研究不僅在細(xì)胞水平上驗證NDV/FMW對WM3248/vemurafenib細(xì)胞株有細(xì)胞毒作用，還進一步證明NDV/FMW可誘導(dǎo)WM3248/vemura-fenib細(xì)胞株ICD相關(guān)分子表達，進而增強耐藥細(xì)胞的免疫應(yīng)答，為NDV/FMW作為惡性黑色素瘤vemurafenib耐藥治療的可行方案提供實驗依據(jù)。后期實驗將進一步研究影響ATP分泌的相關(guān)因素，構(gòu)建惡性黑色素瘤vemurafenib耐藥的荷瘤小鼠，進一步探討NDV/FMW對vemurafenib耐藥的體內(nèi)免疫機制。