蔡海亞+徐得澤+程建平+趙鋒+吳建平

摘要：為揭示形成我國雜交稻及其骨干親本抽穗期多樣性的影響因素，研究選取雜交稻骨干親本并用其配制了38個雜交組合，通過抽穗期田間調(diào)查，結果表明，親本材料和F1組合的播始期表現(xiàn)廣泛變異；通過對部分材料抽穗期控制基因Hd1、Ehd1、Hd3a、RFT1以及Hd3a啟動子測序比較表明，僅Hd1表現(xiàn)出多種等位基因的變異，并且不同類型等位基因及其組合解釋了抽穗期表型變異的19.75%。研究結果表明Hd1等位基因多態(tài)性是我國雜交稻骨干親本抽穗期變異的遺傳基礎之一。

關鍵詞：水稻；抽穗期；多樣性；信號通路

中圖分類號：S511；S336 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0508-04

水稻抽穗期是決定品種地區(qū)與季節(jié)適應性的重要農(nóng)藝性狀，選育早熟高產(chǎn)水稻品種一直為水稻育種工作者所重視。一般來講，水稻是一種短日照植物，當日照逐漸變短時誘導營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)換。目前對于水稻抽穗期分子遺傳信號通路的研究已非常詳盡，OsGI感知外界的生物鐘信號和光信號后調(diào)控下游基因Heading date 1（Hd1）和OsMADS51表達。Hd1調(diào)控Heading date 3a（Hd3a）表達，Hd3a編碼可移動的成花素信號，RICE FLOWERING LOCUS T1（RFT1）與Hd3a具有90%的同源序列，在功能上和Hd3a是冗余的；OsMADS51在Early heading date 1（Ehd1）上游誘導其表達，而Ehd1作為Hd3a的激活因子獨立于Hd1起作用[1]。盡管水稻抽穗期信號通路已經(jīng)非常清晰，但是形成水稻抽穗期多樣性的分子機制還不清楚。本研究以我國雜交秈稻骨干親本及其F1雜種為研究對象，通過自然日照條件下抽穗期的觀察和重要抽穗期控制基因的測序比對，試圖揭示我國雜交秈稻生育期多樣性的遺傳機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取具有生育期差異的長江流域雜交秈稻骨干親本不育系和恢復系，并利用這些材料配制了38個雜交稻組合（F1），所有親本與雜交稻組合（F1）見表1。

1.2 試驗設計

F1雜交組合于2011年冬天在海南配制，親本與F1雜種在湖北省農(nóng)業(yè)科學院南湖試驗站于2012年5月25日播種，6月20日移栽。每份材料單本種植3行，種植密度行距20.0 cm，株距16.7 cm。記錄每份材料的抽穗期（至少有1個稻穗抽出1/2的單株數(shù)達到80%的日期），計算播始期。

1.3 試驗方法

選取Hd1、Ehd1、Hd3a、RFT1這4個水稻中控制抽穗期的關鍵基因以及Hd3a的啟動子，從不同親本材料的基因組DNA擴增后送公司測序，然后進行序列比對分析。水稻抽穗期控制基因信號通路見圖1A，基因結構及引物所在位置見圖1B，基因擴增使用的引物序列見表2。

1.3.1 PCR擴增目的片段 PCR反應體系為20 μL， 含2.0 μL 10×Buffer，1.0 μL dNTPs（10 mmol/L），2條10 mmol/L引物各0.5 μL，0.2 μL Taq酶（5U/μL），2.0 μL模板DNA，13.8 μL ddH2O；PCR反應程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃ 變性1 min，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1～3 min（根據(jù)目的片段長度確定延伸時間），共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.2 PCR產(chǎn)物回收 使用TIANGEN公司的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，按照說明書進行。

1.3.3 PCR產(chǎn)物連接 回收產(chǎn)物連接使用TaKaRa公司pMD18-T試劑盒，按照說明書進行。

1.3.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、測序 將連接產(chǎn)物全量轉(zhuǎn)入100 μL制備好的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞懸液中，冰上放置30 min；42 ℃水浴45 s，冰上放置1～2 min，加入400 μL LB培養(yǎng)基，37 ℃恒溫搖床低速培養(yǎng)1 h；取200 μL涂LB平板（預先加Amp），37 ℃ 倒置培養(yǎng)12～16 h/d，菌落PCR檢測陽性，將有目標條帶擴增的菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均在Excel軟件中進行分析和處理，序列拼接、比對用DNAMAN（軟件版本：6.0.40），基因結構及氨基酸預測用MIT提供的The Genescan Web Server（http：//genes.mit.edu/GENSCAN.html）。基因效應分析采用單因素方差分析，單因素（如Hd1等位基因變異）對總表型變異的貢獻率R2=SSintergroup/SSoverall，其中SSintergroup為組間方差，SSoverall為總方差；F1雜種播始期超親天數(shù)占親本播始期比例MP1=[（F1-P1）/P1]×100%，其中F1為F1雜種播始期，P1為早抽穗親本的播始期（計算超親早抽穗時間）或晚抽穗親本的播始期（計算超親晚抽穗時間）。

2 結果與分析

2.1 親本材料及其F1雜種的播始期

表1的結果表明，親本材料和F1組合的播始期表現(xiàn)廣泛變異，親本材料播始期59～101 d，F(xiàn)1材料播始期60～120 d；通過計算F1雜種與兩親本播始期的相關系數(shù)，表明F1播始期與不育系的播始期沒有顯著的相關性，但是和恢復系播始期呈極顯著正相關，相關系數(shù)為r=0.77（P<0.01），因此F1雜種播始期主要受恢復系支配。

與雙親相比，少數(shù)F1雜種播始期表現(xiàn)出超親現(xiàn)象，6份F1雜種表現(xiàn)出較強的超親晚抽穗，除雜交組合HD9802S/HR015的超親晚抽穗天數(shù)占遲抽穗親本播始期比例的8.4%外，其余5份雜交組合為18.8%～20.2%。7份材料表現(xiàn)出超親早抽穗，超親早抽穗天數(shù)占早抽穗親本播始期比例的5.6%～13.0%；相同的恢復系與不同的不育系會產(chǎn)生超親F1，相同的不育系與不同的恢復系也會產(chǎn)生超親F1，因此F1的生育期超親表現(xiàn)與雙親的組配有關。

2.2 不同材料抽穗期控制基因的序列比對

選取了16份具有不同抽穗期的水稻材料（表3），對其抽穗期控制基因Hd1、Ehd1、Hd3a、RFT1以及Hd3a啟動子序列進行PCR擴增測序分析。除Hd1基因存在4種不同的等位基因外，其余基因均無差異。與日本晴Hd1編碼區(qū)相比，4個等位基因的編碼區(qū)分別表現(xiàn)出單核苷酸的替換、片段插入與缺失、無義突變等不同的SNP類型（圖2）。利用軟件預測分析，這4個等位基因分別編碼4種不同的蛋白質(zhì)（圖3）。通過與Takahashi等[2]對水稻Hd1序列及功能分析結果的比對確定本研究中的Hd1-1和Hd1-4為有功能的等位基因，Hd1-2和Hd1-3則因為出現(xiàn)了大片段的缺失，表現(xiàn)為功能缺失型等位基因。通過計算有功能等位基因材料的播始期的平均值和功能缺失型等位基因材料的播始期的平均值可知，前者為86 d， 后者為83 d（表3），并且兩者呈顯著差異（P<0.05）。通過計算基因的遺傳效應，表明Hd1等位基因在不同的親本材料之間解釋了抽穗期這一性狀表型變異的19.75%，因此Hd1等位基因在一定程度上解釋了抽穗期的表型變異，在自然日照條件下有功能的Hd1等位基因表現(xiàn)出抑制抽穗。

通過分析F1雜種播始期與Hd1等位基因的關系，結果表明有功能Hd1純合型F1（HD1/HD1）的播始期平均值為89 d，雜合型（HD1/hd1）為94 d，功能缺失型Hd1的純合型F1（hd1/hd1）的播始期平均值為83 d，并且HD1/HD1和 HD1/hd1基因型與hd1/hd1基因型的播始期均表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05）（表4），因此在F1雜種中有功能的Hd1相對于功能缺失型等位基因為顯性，起到抑制抽穗的作用。

3 討論

3.1 Hd1等位基因變異是長江流域雜交秈稻骨干親本抽穗期變異的遺傳基礎之一

本研究選取的雜交稻骨干親本材料中，Ehd1、Hd3a、RFT1的編碼區(qū)以及Hd3a的啟動子序列非常保守，沒有表現(xiàn)出差異，Hd1的編碼區(qū)表現(xiàn)出了4種不同等位基因類型，并且不同類型Hd1等位基因解釋了自然日照條件下抽穗期19.75%的表型變異；因此，本研究結果表明Hd1等位基因多態(tài)性是我國長江流域雜交秈稻骨干親本抽穗期變異的遺傳基礎之一。

3.2 關于F1雜種抽穗期的超親現(xiàn)象

親本間感光性和基本營養(yǎng)生長性組合的多樣性及強弱的不同使得F1雜種抽穗期呈現(xiàn)多種多樣的變化。在雜種優(yōu)勢利用，特別是秈粳亞種間雜種優(yōu)勢的利用中，常遇到超親晚熟現(xiàn)象，而許多研究表明，F(xiàn)1雜種抽穗期是否嚴重超親主要取決于雙親是否帶有不同位點的互補的顯性感光基因[3-5]，如果帶有一對互補基因，那么F1將會表現(xiàn)超親晚抽穗；徐俊鋒[6]的研究結果表明F1超親晚抽穗主要受兩對顯性互補感光基因E1（Hd4）和Se-1（Hd1）控制，雜種超親晚抽穗主要由感光性引起。本研究材料中也出現(xiàn)了抽穗期超親的雜交組合，其中不育系親本814A和HD9802S與恢復系親本HR020和HR935配組的F1超親晚抽穗天數(shù)與晚抽穗親本播始期的比例為18.8%～20.2%，而且不育系親本含有有功能的Hd1等位基因，而恢復系親本含有功能缺失型等位基因，因此存在潛在的互補基因的可能。

Chang等[7]對感光品種的感光性（PSP）和基本營養(yǎng)生長性（BVP）同時進行研究，認為PSP受單一顯性基因或2個顯性基因（Se）控制，BVP則受2個或2個以上基因（Ef）控制，這些基因具有累加效應，短的BVP相對于長的BVP為顯性，因此不同Ef基因在F1材料中的互補可能會導致營養(yǎng)生長期比雙親的縮短，從而導致提前抽穗[8]，因此還需要進一步的試驗去驗證本研究中的超親早抽穗是否也是由Ef基因?qū)е碌摹?/p>

參考文獻：

[1] TSUJI H， TAMAKI S， KOMIYA R， et al. Florigen and the photoperiodic control of flowering in rice[J]. Rice，2008，1（1）：25-35.

[2] TAKAHASHI Y， TESHIMA K M.， YOKOI S，et al. Variations in Hd1 proteins， Hd3a promoters， and Ehd1 expression levels contribute to diversity of flowering time in cultivated rice[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（11）：4555-4560.

[3] 董世鈞，李春壽，李關土，等. 水稻秈粳雜種一代生育期的表現(xiàn)[J].中國水稻科學，1995，9（2）：77-81.

[4] 李和標，鄒江石.水稻秈粳亞種間F1生育期超親表現(xiàn)與遺傳分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，1992，8（1）：7-12.

[5] 羅林廣，翟虎渠，萬建民，等.水稻抽穗期的遺傳學研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，2001，17（2）：119-126.

[6] 徐俊鋒. 水稻主要雜交稻親本抽穗期基因型分析及秈粳交F1抽穗期超親分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2004.

[7] CHANG T T， LI C C， VERGARA B S. Component analysis of duration from seeding to heading in rice by the basic vegetative phase and the photoperiod-sensitive phase[J]. Euphytica，1969，18：79-91.

[8] 蔡俊邁，周元昌，李維明.雜交水稻抽穗期遺傳研究Ⅱ.抽穗期基因互作的遺傳[J].福建農(nóng)學院學報，1988，17（1）：1-9.

2.2 不同材料抽穗期控制基因的序列比對

選取了16份具有不同抽穗期的水稻材料（表3），對其抽穗期控制基因Hd1、Ehd1、Hd3a、RFT1以及Hd3a啟動子序列進行PCR擴增測序分析。除Hd1基因存在4種不同的等位基因外，其余基因均無差異。與日本晴Hd1編碼區(qū)相比，4個等位基因的編碼區(qū)分別表現(xiàn)出單核苷酸的替換、片段插入與缺失、無義突變等不同的SNP類型（圖2）。利用軟件預測分析，這4個等位基因分別編碼4種不同的蛋白質(zhì)（圖3）。通過與Takahashi等[2]對水稻Hd1序列及功能分析結果的比對確定本研究中的Hd1-1和Hd1-4為有功能的等位基因，Hd1-2和Hd1-3則因為出現(xiàn)了大片段的缺失，表現(xiàn)為功能缺失型等位基因。通過計算有功能等位基因材料的播始期的平均值和功能缺失型等位基因材料的播始期的平均值可知，前者為86 d， 后者為83 d（表3），并且兩者呈顯著差異（P<0.05）。通過計算基因的遺傳效應，表明Hd1等位基因在不同的親本材料之間解釋了抽穗期這一性狀表型變異的19.75%，因此Hd1等位基因在一定程度上解釋了抽穗期的表型變異，在自然日照條件下有功能的Hd1等位基因表現(xiàn)出抑制抽穗。

通過分析F1雜種播始期與Hd1等位基因的關系，結果表明有功能Hd1純合型F1（HD1/HD1）的播始期平均值為89 d，雜合型（HD1/hd1）為94 d，功能缺失型Hd1的純合型F1（hd1/hd1）的播始期平均值為83 d，并且HD1/HD1和 HD1/hd1基因型與hd1/hd1基因型的播始期均表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05）（表4），因此在F1雜種中有功能的Hd1相對于功能缺失型等位基因為顯性，起到抑制抽穗的作用。

3 討論

3.1 Hd1等位基因變異是長江流域雜交秈稻骨干親本抽穗期變異的遺傳基礎之一

本研究選取的雜交稻骨干親本材料中，Ehd1、Hd3a、RFT1的編碼區(qū)以及Hd3a的啟動子序列非常保守，沒有表現(xiàn)出差異，Hd1的編碼區(qū)表現(xiàn)出了4種不同等位基因類型，并且不同類型Hd1等位基因解釋了自然日照條件下抽穗期19.75%的表型變異；因此，本研究結果表明Hd1等位基因多態(tài)性是我國長江流域雜交秈稻骨干親本抽穗期變異的遺傳基礎之一。

3.2 關于F1雜種抽穗期的超親現(xiàn)象

親本間感光性和基本營養(yǎng)生長性組合的多樣性及強弱的不同使得F1雜種抽穗期呈現(xiàn)多種多樣的變化。在雜種優(yōu)勢利用，特別是秈粳亞種間雜種優(yōu)勢的利用中，常遇到超親晚熟現(xiàn)象，而許多研究表明，F(xiàn)1雜種抽穗期是否嚴重超親主要取決于雙親是否帶有不同位點的互補的顯性感光基因[3-5]，如果帶有一對互補基因，那么F1將會表現(xiàn)超親晚抽穗；徐俊鋒[6]的研究結果表明F1超親晚抽穗主要受兩對顯性互補感光基因E1（Hd4）和Se-1（Hd1）控制，雜種超親晚抽穗主要由感光性引起。本研究材料中也出現(xiàn)了抽穗期超親的雜交組合，其中不育系親本814A和HD9802S與恢復系親本HR020和HR935配組的F1超親晚抽穗天數(shù)與晚抽穗親本播始期的比例為18.8%～20.2%，而且不育系親本含有有功能的Hd1等位基因，而恢復系親本含有功能缺失型等位基因，因此存在潛在的互補基因的可能。

Chang等[7]對感光品種的感光性（PSP）和基本營養(yǎng)生長性（BVP）同時進行研究，認為PSP受單一顯性基因或2個顯性基因（Se）控制，BVP則受2個或2個以上基因（Ef）控制，這些基因具有累加效應，短的BVP相對于長的BVP為顯性，因此不同Ef基因在F1材料中的互補可能會導致營養(yǎng)生長期比雙親的縮短，從而導致提前抽穗[8]，因此還需要進一步的試驗去驗證本研究中的超親早抽穗是否也是由Ef基因?qū)е碌摹?/p>

參考文獻：

[1] TSUJI H， TAMAKI S， KOMIYA R， et al. Florigen and the photoperiodic control of flowering in rice[J]. Rice，2008，1（1）：25-35.

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[6] 徐俊鋒. 水稻主要雜交稻親本抽穗期基因型分析及秈粳交F1抽穗期超親分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2004.

[7] CHANG T T， LI C C， VERGARA B S. Component analysis of duration from seeding to heading in rice by the basic vegetative phase and the photoperiod-sensitive phase[J]. Euphytica，1969，18：79-91.

[8] 蔡俊邁，周元昌，李維明.雜交水稻抽穗期遺傳研究Ⅱ.抽穗期基因互作的遺傳[J].福建農(nóng)學院學報，1988，17（1）：1-9.

2.2 不同材料抽穗期控制基因的序列比對

選取了16份具有不同抽穗期的水稻材料（表3），對其抽穗期控制基因Hd1、Ehd1、Hd3a、RFT1以及Hd3a啟動子序列進行PCR擴增測序分析。除Hd1基因存在4種不同的等位基因外，其余基因均無差異。與日本晴Hd1編碼區(qū)相比，4個等位基因的編碼區(qū)分別表現(xiàn)出單核苷酸的替換、片段插入與缺失、無義突變等不同的SNP類型（圖2）。利用軟件預測分析，這4個等位基因分別編碼4種不同的蛋白質(zhì)（圖3）。通過與Takahashi等[2]對水稻Hd1序列及功能分析結果的比對確定本研究中的Hd1-1和Hd1-4為有功能的等位基因，Hd1-2和Hd1-3則因為出現(xiàn)了大片段的缺失，表現(xiàn)為功能缺失型等位基因。通過計算有功能等位基因材料的播始期的平均值和功能缺失型等位基因材料的播始期的平均值可知，前者為86 d， 后者為83 d（表3），并且兩者呈顯著差異（P<0.05）。通過計算基因的遺傳效應，表明Hd1等位基因在不同的親本材料之間解釋了抽穗期這一性狀表型變異的19.75%，因此Hd1等位基因在一定程度上解釋了抽穗期的表型變異，在自然日照條件下有功能的Hd1等位基因表現(xiàn)出抑制抽穗。

通過分析F1雜種播始期與Hd1等位基因的關系，結果表明有功能Hd1純合型F1（HD1/HD1）的播始期平均值為89 d，雜合型（HD1/hd1）為94 d，功能缺失型Hd1的純合型F1（hd1/hd1）的播始期平均值為83 d，并且HD1/HD1和 HD1/hd1基因型與hd1/hd1基因型的播始期均表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05）（表4），因此在F1雜種中有功能的Hd1相對于功能缺失型等位基因為顯性，起到抑制抽穗的作用。

3 討論

3.1 Hd1等位基因變異是長江流域雜交秈稻骨干親本抽穗期變異的遺傳基礎之一

本研究選取的雜交稻骨干親本材料中，Ehd1、Hd3a、RFT1的編碼區(qū)以及Hd3a的啟動子序列非常保守，沒有表現(xiàn)出差異，Hd1的編碼區(qū)表現(xiàn)出了4種不同等位基因類型，并且不同類型Hd1等位基因解釋了自然日照條件下抽穗期19.75%的表型變異；因此，本研究結果表明Hd1等位基因多態(tài)性是我國長江流域雜交秈稻骨干親本抽穗期變異的遺傳基礎之一。

3.2 關于F1雜種抽穗期的超親現(xiàn)象

親本間感光性和基本營養(yǎng)生長性組合的多樣性及強弱的不同使得F1雜種抽穗期呈現(xiàn)多種多樣的變化。在雜種優(yōu)勢利用，特別是秈粳亞種間雜種優(yōu)勢的利用中，常遇到超親晚熟現(xiàn)象，而許多研究表明，F(xiàn)1雜種抽穗期是否嚴重超親主要取決于雙親是否帶有不同位點的互補的顯性感光基因[3-5]，如果帶有一對互補基因，那么F1將會表現(xiàn)超親晚抽穗；徐俊鋒[6]的研究結果表明F1超親晚抽穗主要受兩對顯性互補感光基因E1（Hd4）和Se-1（Hd1）控制，雜種超親晚抽穗主要由感光性引起。本研究材料中也出現(xiàn)了抽穗期超親的雜交組合，其中不育系親本814A和HD9802S與恢復系親本HR020和HR935配組的F1超親晚抽穗天數(shù)與晚抽穗親本播始期的比例為18.8%～20.2%，而且不育系親本含有有功能的Hd1等位基因，而恢復系親本含有功能缺失型等位基因，因此存在潛在的互補基因的可能。

Chang等[7]對感光品種的感光性（PSP）和基本營養(yǎng)生長性（BVP）同時進行研究，認為PSP受單一顯性基因或2個顯性基因（Se）控制，BVP則受2個或2個以上基因（Ef）控制，這些基因具有累加效應，短的BVP相對于長的BVP為顯性，因此不同Ef基因在F1材料中的互補可能會導致營養(yǎng)生長期比雙親的縮短，從而導致提前抽穗[8]，因此還需要進一步的試驗去驗證本研究中的超親早抽穗是否也是由Ef基因?qū)е碌摹?/p>

參考文獻：

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