張光遠 吳曉利 張志明 何冬旭

摘?要：目的：探究大豆皂甙通過影響腸道菌群對高鹽引起的小鼠高血壓的調(diào)控，并篩選起到穩(wěn)定血壓作用的目標腸道菌群，為新的功能食品和益生菌的開發(fā)提供科學依據(jù)。方法：15只健康成年雄性小鼠被隨機分成3組：（1）喂食含0.5%NaCl的飼料（正常飲食，NSD組）;（2）喂食含8%NaCl的飼料（高鹽飲食，HSD組）;（3）喂食含8%NaCl的飼料，高鹽飲食9w后，飲食中添加大豆皂甙Bb，持續(xù)3w（高鹽飲食+大豆皂甙，HSD_SI組）。實驗結(jié)束前，分別收集3組小鼠新鮮糞便，提取糞便總DNA，并對16s rDNA的V3-V4區(qū)進行高通量測序，微生物多樣性分析和差異OTU比對。結(jié)果：大豆皂甙可以顯著降低由高鹽飲食誘導的小鼠血壓升高。同時減少部分在高鹽飲食過程中顯著增加的OTU的豐度，這部分OTU中可能包含使機體血壓升高的有害菌;另外使部分在高鹽飲食過程中減少的OTU的豐度得到恢復和增加，這部分OTU中可能存在潛在的可以降低機體血壓的益生菌。推論：大豆皂甙可能通過影響腸道菌群而調(diào)控血壓。

關(guān)鍵詞：大豆皂甙;高血壓;腸道菌群

高鹽飲食誘導血壓升高的機制研究主要集中在腎臟和交感神經(jīng)系統(tǒng)[1-4]，不過，Wilck等[5]的發(fā)現(xiàn)使研究者們的注意力轉(zhuǎn)移到機體自身腸道菌群對血壓的影響上。大豆皂甙是大豆膳食中重要的功能性成分，是齊墩果烷型三萜糖苷類，存在于大豆和其他一些豆科植物中[6]。離體和在體實驗中都發(fā)現(xiàn)大豆皂甙對心血管系統(tǒng)具有保護作用，如通過抗氧化、降低血漿膽固醇等功能可能對機體血壓產(chǎn)生影響[7-8]。Takahashi等[9]在自發(fā)性高血壓大鼠模型中發(fā)現(xiàn)口服大豆皂甙Bb可以顯著降低血管收縮壓，離體實驗中大豆皂甙Bb可以作為腎素的抑制劑，通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)降低血壓。但是，Kamo等[10]在對大豆皂甙的生物利用率的研究中顯示，大豆皂甙被吸收進入血液循環(huán)的量低于離體實驗中的有效作用濃度。由此，筆者認為大豆皂甙對機體的直接作用并不能完全解釋其對心血管系統(tǒng)的影響。鑒于大豆皂甙首先需要經(jīng)過腸道微生物群落的代謝才能被機體吸收，且大豆皂甙可抑制某些特定菌群的生長[11]，我們推測大豆皂甙也可以通過改變結(jié)腸中微生物群落組成的方式參與機體血壓的調(diào)節(jié)。

本研究構(gòu)建了與人類鹽敏感性高血壓相似的高鹽飲食誘導的小鼠高血壓模型[12]，然后通過飲食中添加大豆皂甙，觀察和記錄小鼠血壓的變化，并對小鼠糞便樣品進行16s rDNA擴增子測序，分析高鹽攝入和大豆皂甙對小鼠結(jié)腸中微生物群落的影響。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?實驗動物?C57BL/6J雄性小鼠，8w齡，SPF（Specific Pathogen Free）級，購自南京模式動物研究所。

1.1.2?主要試劑?正常小鼠飼料（NSD，Normal Salt Diet，0.5% NaCl）和高鹽小鼠飼料（HSD，High Salt Diet，8% NaCl），南京特洛菲飼料科技有限公司;大豆皂甙Bb（Soyasaponin I），CAS 51330-27-9，純度：HPLC，≥98%，上海源葉生物科技有限公司;糞便基因組DNA提取試劑盒（DP328-02），天根生物科技有限公司;Qubit dsDNA Assay Kit（Q328520），Life Technologies;HiFi Hot Start Ready Mix（KK2501），Kapa。

1.1.3?主要儀器?小鼠無創(chuàng)血壓測試設(shè)備（4通道），美國IITC公司;臺式高速離心機（Centrifuge 5418），Eppendorf;PCR 儀（580BR10905），Bio-rad;電泳儀（HE-120），Tanon;凝膠成像儀（2500），Tanon;Bioanalyzer（2100），Aglient;MiSeq基因測序儀，Illumina公司。

1.2?方法

1.2.1?實驗動物分組和處理?所有動物實驗都嚴格按照國家《實驗動物管理條例》和《江蘇省實驗動物管理實施辦法》相關(guān)規(guī)定進行，并得到江南大學實驗動物管理與動物福利倫理委員會的允許。實驗小鼠飼養(yǎng)在12h光照（白天）和12h黑暗（夜間）循環(huán)，溫度控制在20～24℃，濕度40%～60%的屏障環(huán)境中，自由攝食和飲水。實驗使用8w齡，C57BL/6J，雄性小鼠，體重22～25g，共15只。進入屏障環(huán)境后，正常飼料預飼養(yǎng)1w。之后隨機平均分為3組：正常飲食組（NSD，n=5）;高鹽飲食組（HSD，n=5）;高鹽飲食+大豆皂甙組（HSD_SI，n=5）。處理：NSD組喂食正常飼料，HSD組和HSD_SI組喂食高鹽飼料，持續(xù)9w，第10周開始對HSD_SI組小鼠灌胃大豆皂甙Bb[1.51mg/（kg·d）]，灌胃體積為100μL/10 g，溶劑為1%吐溫80]，NSD組和HSD組灌胃等體積溶劑，持續(xù)3w。同時記錄攝食、飲水、體重和血壓變化。

1.2.2?劑量設(shè)計?大豆皂甙在大豆中的含量在0.1%～0.5%之間，取最低值，若成人每日攝入大豆類膳食10g，則攝入大豆皂甙的量為10mg，以成人體重為60kg，根據(jù)體表面積將人體劑量換算為小鼠劑量[13]為1.51mg/（kg·d）。

1.2.3?糞便樣品收集?灌胃3w后，分別收集3組小鼠新鮮糞便，通過壓迫腹腔的方法，在肛門口直接收集，每組3只（n=3），樣品置于干凈無菌EP管中，立即放在冰上，隨后放入-80℃冰箱冷凍保存，以備后續(xù)分析。

1.2.4?基因組DNA的提取和高通量測序樣品的準備?使用糞便DNA抽提試劑盒對小鼠糞便樣品基因組DNA進行提取，增加添加蛋白酶K（終濃度5mg/mL）65℃孵育10min和95℃孵育10min的步驟，以使革蘭氏陽性菌更充分裂解。瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 的純度和濃度，之后無菌水稀釋樣品至1ng/μL。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，選擇測序區(qū)域為細菌16S rDNA的V3-V4 區(qū)，使用帶 Barcode 的特異引物（343F：5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′和798R：5′-AGGGTATCTAATCCT-3′），KAPA公司的HiFi Hot Start Ready Mix高保真酶，進行 PCR，以確保擴增效率和準確性。對PCR產(chǎn)物進行 Qubit 定量。根據(jù) PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，隨后上機測序。

1.2.5?原始測序數(shù)據(jù)處理?原始雙端測序數(shù)據(jù)使用Trimmomatic[14]軟件進行去雜，之后使用FLASH（v1.2.11）[15]軟件拼接，拼接后的數(shù)據(jù)使用QIIME（version 8.0）[16]軟件，根據(jù)barcode序列區(qū)分各個樣品的序列數(shù)據(jù)，生成不含barcode的各樣品序列文件，之后序列進行進一步去雜，去除低質(zhì)量的堿基序列以及模糊堿基序列，最后采用usearch[17]軟件去除嵌合體序列，統(tǒng)計各個樣本中所含的最終序列數(shù)。

1.2.6?生物信息分析?最終得的序列使用Uparse[18]軟件以97% 相似度進行可操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）[19]劃分。從各OTU中挑選豐度最大的序列作為代表序列與Silva 數(shù)據(jù)[20]進行比對。比對注釋采用RDP classifier Naive Bayesian[21]分類算法。之后對各樣品中OTU進行多樣性分析和群落結(jié)構(gòu)分析。通過單因素方差分析分別對小鼠糞便微生物物種豐度在NSD組、HSD組和HSD_SI組間的差異進行顯著性分析和比對，篩選出同時受高鹽攝入和大豆皂甙反向調(diào)節(jié)的OTU。

2?結(jié)果與分析

2.1?動物模型構(gòu)建和血壓變化

如圖1所示，將正常飼料換為高鹽飼料后，相比于NSD組小鼠，HSD組小鼠的收縮壓和舒張壓都顯示出上升趨勢，并在第8周之后收縮壓大于120mm Hg和舒張壓大于90mm Hg，隨后保持相對穩(wěn)定，并且與NSD組小鼠收縮壓和舒張壓顯示出顯著差異，表明高鹽攝入使高鹽飲食小鼠血壓顯著升高;在第10周開始對HSD_SI組小鼠灌胃大豆皂甙，1.5mg/（kg·d），持續(xù)3w，該組小鼠的收縮壓和舒張壓同時顯現(xiàn)出下降趨勢，表明大豆皂甙可以緩解由高鹽攝入誘導的小鼠血壓升高。

同時通過3組小鼠攝食量、飲水量和體重的對比（圖2），發(fā)現(xiàn)不同組別在攝食量和體重上沒有出現(xiàn)明顯的差異，只有飲水量在正常飲食和高鹽飲食間出現(xiàn)明顯改變，這與飼料成分除NaCl含量不同以外其他成分相同相一致。同時也說明我們的實驗中所用大豆皂甙的灌胃劑量不會對小鼠的胃腸道產(chǎn)生明顯的刺激作用，排除了可能單獨由灌胃引起的炎癥和體重改變對小鼠血壓產(chǎn)生的影響。

2.2?3組小鼠糞便中菌群組成比對

對3組小鼠糞便中微生物進行了擴增子測序，OTU聚類和注釋，基于OTU分類，繪制了3組小鼠糞便中菌群組成的柱狀圖，顯示3組小鼠結(jié)腸中菌群組成具有一定差異（圖3）。

Chao指數(shù)反映各樣品的α多樣性，是通過實際觀察到的OTU數(shù)目和群落中只檢測到1次和2次的OTU 數(shù)目計算，估計樣品中實際存在的OTU數(shù)目，如圖4所示，NSD組和HSD組樣品間沒有顯著差異，表明相比于NSD組高鹽攝入并沒有使HSD組小鼠結(jié)腸微生物的α多樣性發(fā)生顯著改變，同樣HSD組和HSD_SI組間也沒有顯著差異，說明飲食中大豆皂甙Bb的添加沒有使小鼠結(jié)腸內(nèi)菌群的α多樣性發(fā)生顯著改變。

PCA分析顯示，3組樣品間OTU的組成改變，差異反映在二維坐標軸上為距離遠近。圖5中HSD組樣品和NSD組樣品間在二維坐標軸上顯示出不同分布，說明相比于NSD組高鹽攝入改變了HSD組小鼠結(jié)腸中菌群OTU的組成，高鹽攝入對結(jié)腸中微生物群落組成具有一定的影響;而HSD_SI組樣品在坐標系里的分布介于HSD組和NSD組之間，表明大豆皂甙同樣作用于腸道菌群，緩解了高鹽攝入造成的部分腸道菌群組成的改變。

2.3?高鹽飲食和大豆皂甙反向調(diào)節(jié)的OTU

分別通過單因素方差分析對在高鹽攝入后豐度改變的OTU和在飲食中補充大豆皂甙Bb后豐度發(fā)生改變的OTU，進行了差異顯著性分析。通過HSD組和NSD組間的比較，HSD組相比于NSD組有33個OTU的豐度發(fā)生了顯著改變（P<0.05）;通過HSD_SI組和HSD組間比較，發(fā)現(xiàn)22個OTU的變化具有顯著性（P<0.05）。對兩次的結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)其中11個OTU在兩次方差分析中都發(fā)生了顯著改變，并且受到高鹽攝入和飲食中大豆皂甙Bb添加的反向調(diào)節(jié)。8個OTU在HSD組豐度顯著高于NSD組和HSD_SI組，分別屬于Anaerotruncus（厭氧棍狀菌屬）、Christensenellaceae（克里斯滕森菌科）、Lachnospiraceae（毛螺菌科）、Alistipes（另枝菌屬）、Anaerotruncus（厭氧棍狀菌屬）、Ruminiclostridium_9（瘤胃梭菌屬_9）和Streptococcus saliva（唾液鏈球菌）;3個OTU在HSD組豐度顯著低于NSD組和HSD_SI組，分別屬于Bacteroidales_S24-7 group（擬桿菌S24-7科）和Desulfovibrio（脫硫弧菌屬）（圖6）。

3?結(jié)論

大豆皂甙Bb可以顯著緩解由高鹽飲食造成的小鼠血壓升高，同時使部分在高鹽飲食后豐度升高的腸道菌的豐度降低，也會使部分在高鹽飲食過程中降低的腸道菌群的豐度得到一定程度的恢復和升高，這些腸道菌群與血壓的變化具有一定程度的相關(guān)性，可能參與機體血壓的調(diào)節(jié)過程，可以被認為是潛在的對機體血壓有影響的有害菌或益生菌。

4?討論

膳食成分和腸道菌群與心血管疾病的關(guān)系越來越受到人們的關(guān)注，大豆皂甙作為大豆膳食中的重要功能性成分對鹽敏感性高血壓具有顯著的調(diào)節(jié)作用，它的代謝和吸收也需要腸道菌群的充分參與并同時對腸道菌群的組成和功能產(chǎn)生影響。小鼠經(jīng)過長時間高鹽飲食誘導的高血壓模型與人的鹽敏感性高血壓相似，所以本實驗采用長期高鹽攝入構(gòu)建了小鼠高血壓模型，并在小鼠高鹽高血壓模型的基礎(chǔ)上，通過大豆皂甙灌胃證實了大豆皂甙對高鹽高血壓的調(diào)節(jié)作用。另外，還通過擴增子分析篩選了11個受到高鹽攝入和大豆皂甙反向調(diào)節(jié)的OTU，但是它們的豐度改變對機體血壓是否具有調(diào)節(jié)作用有待進一步研究。

本研究旨在更深入地了解高鹽飲食和膳食成分在高血壓發(fā)生和發(fā)展過程中的作用，對《中國防治慢性病中長期規(guī)劃（2017—2025年）》中提出的降低我國居民高血壓等心血管相關(guān)疾病的發(fā)病率提供科學依據(jù)。◇

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Effect of Soyasaponin on Blood Pressure and Intestinal Bacteria in High-salt-diet Mice

ZHANG Guang-yuan?1，WU Xiao-li?1，ZHANG Zhi-ming?1，HE Dong-xu?2

（?1School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;?2 National Engineering Research Center for Functional Food，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of soyasaponin on blood pressure and intestinal bacteria in high-salt-diet mice，and to screen the target intestinal bacteria that stabilizes blood pressure，providing scientific basis for the development of new functional foods and probiotics.MethodHealthy adult male mice（n=15）were randomly assigned into 3 groups including fed with diet containing 0.5% NaCl（NSD），fed with diet containing 8% NaCl（HSD group），fed with high-salt diet for 9 weeks，gavaged with soyasaponin Bb for another 3 weeks and remain in high-salt diet（HSD_SI group）.Fresh feces from 3 groups of mice were collected aseptically，and intestinal microbiota was detected by Illumina high-throughput sequencing.Microbial diversity analysis and differential OTUs comparison were performed.ResultSoyasaponin could significantly reduce the increase in blood pressure in high-salt-diet mice.At the same time，it reduced the abundance of several OTUs that were significantly increased during the high-salt diet.These OTUs might contain harmful bacteria that raise the bodys blood pressure.In addition，it also increased the abundance of several other OTUs that reduced during the high-salt diet，these OTUs might contain potential probiotics that could lower the bodys blood pressure.ConclusionSoyasaponin may regulate blood pressure via interact with intestinal bacteria.

Keywords：soyasaponin;hypertension;intestinal bacteria

（責任編輯?李婷婷）