王晶晶　張新笑　卞歡　耿志明　李鵬鵬　王道營(yíng)　徐為民

摘要：【目的】克隆麻鴨磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶基因（GPx4）并在大腸桿菌中表達(dá)，分析其酶學(xué)特性，為研究GPx4功能及其在羥基脂肪酸形成過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎肦T-PCR克隆麻鴨GPx4（DGPx4）的編碼基因，利用定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建半胱氨酸突變體DGPx4表達(dá)載體pMBP-DGPx4（48Sec→Cys），并在大腸桿菌中通過添加His標(biāo)簽進(jìn)行可溶性表達(dá)，經(jīng)Ni-NTA親和層析和離子交換層析純化得到融合蛋白DGPx4;采用總谷胱甘肽過氧化物酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)DGPx4活力以研究其酶學(xué)性質(zhì)?！窘Y(jié)果】克隆獲得的DGPx4基因編碼序列全長(zhǎng)516 bp，編碼172個(gè)氨基酸，編碼蛋白分子量約20 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為8.9。構(gòu)建的突變體基因原核表達(dá)載體pMBP-DGPx4（48Sec→Cys）可在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)表達(dá)獲得融合蛋白DGPx4，經(jīng)Ni-NTA親和層析和離子交換層析即獲得高純度的DGPx4。以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）為底物時(shí)，DGPx4的最適反應(yīng)溫度為32 ℃，最適pH為8.0，對(duì)NaCl濃度較敏感;Cu2+和Ni2+對(duì)DGPx4活力有較高的促進(jìn)作用，Mg2+和Mn2+對(duì)DGPx4活力有一定的抑制作用，Ca2+和Zn2+對(duì)DGPx4活力則無明顯的促進(jìn)或抑制作用?！窘Y(jié)論】從鴨肝細(xì)胞中克隆獲得的DGPx4基因序列經(jīng)定點(diǎn)突變后可在原核細(xì)胞中高效表達(dá)，且純化后的高純度融合蛋白DGPx4具有GPx4活力，能在抗脂質(zhì)氧化過程中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞： 麻鴨;磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（GPx4）;原核表達(dá);純化;酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào)： S843.83 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）05-1120-07

Abstract：【Objective】The ?shelduck phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase gene（GPx4） was cloned and expressed in ?Escherichia coli， and its enzymatic properties were analyzed， which laid a foundation for preliminary study of GPx4 function and its regulation mechanism in the formation of hydroxy fatty acids. 【Method】Shelduck GPx4（DGPx4） encoded gene was cloned by RT-PCR， and site-directed mutation was used to established cysteine mutant DGPx4 expression vector pMBP-DGPx4（48Sec→Cys）. ?His tag was added into E. coli to achieve soluble expression. Fusion protein DGPx4 was obtained by Ni-NTA affinity chromatography and ion exchange chromatography purification. DGPx4 activity and the enzymatic properties were measured by total glutathione peroxidase activity assay kit. 【Result】The results showed that the obtained DGPx4 gene coding sequence was 516 bp in length and encoded 172 amino acids. The encoded protein had a molecular weight of approximately 20 kD and a theoretical isoelectric point （pI） of 8.9. The constructed mutant gene prokaryotic expression vector pMBP-DGPx4（48Sec→Cys） was successfully induced to express the fusion protein DGPx4 in Escherichia coli， and high purity DGPx4 was obtained by Ni-NTA affinity chromatography and ion exchange chromatography. When nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH） was used as the substrate， the optimum reaction temperature for DGPx4 was 32 ℃， and the optimum pH was 8.0， and sensitive to NaCl concentration. Cu2+ and Ni2+ could activate the activity of DGPx4， Mg2+ and Mn2+ inhibited its activity， while Ca2+ and Zn2+ had no obvious effect on DGPx4 activity. 【Conclusion】The DGPx4 gene sequence cloned from duck liver cells can be highly expressed in prokaryotic cells after site-directed mutagenesis， and the purified high-purity fusion protein DGPx4 has GPx4 activity and can play a role in anti-lipid oxidation.

Key words： shelduck; phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase（GPx4）; prokaryotic expression; purification; enzymatic properties

0 引言

【研究意義】磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase，PHGPx，GPx4）是一種廣泛存在于細(xì)胞線粒體、微粒體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的含硒酶（張丹丹等，2012），能特異性還原氫過氧化的磷脂和脂肪酸等，降低脂質(zhì)過氧化程度，防止細(xì)胞膜過氧化損傷，維持細(xì)胞的正常功能（施力光等，2012;馮凱等，2016;楊杰等，2017）。此外，在食品加工過程中GPx4參與食物羥基亞油酸（Hydroxyoctadecaenoicacids，HODEs）的形成，當(dāng)人體過多攝入HODEs會(huì)明顯提高動(dòng)脈硬化、癌癥等疾病的發(fā)生概率（Jira et al.，1998;Choque et al.，2014;Vangaveti et al.，2014）。因此，加強(qiáng)GPx4誘導(dǎo)表達(dá)、純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，對(duì)揭示其調(diào)控調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今，有關(guān)PHGPx或GPx4的研究國(guó)內(nèi)外已有較多報(bào)道（Scheerer et al.，2007;閆春燕等，2008;蔡絲絲等，2014）。趙文然等（2004）利用定點(diǎn)突變將人類GPx4編碼基因中編碼硒半胱氨酸（Sec）的密碼子UGA突變?yōu)榫幋a半胱氨酸（Cys）的UGU，并利用大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果成功制備出可用于鑒定GPx4的多克隆抗體。李甜等（2010）利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)出蘿卜PHGPx，并證實(shí)其能快速清除多種脂類過氧化物，主要通過抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損傷而發(fā)揮作用。李洋等（2010）利用畢赤酵母細(xì)胞表達(dá)結(jié)合酸銨分級(jí)沉淀、脫鹽柱脫鹽、凝膠過濾等步驟純化獲得蘿卜PHGPx，并證實(shí)其具有依賴于谷胱甘肽（GSH）的還原活性。劉冠蘭（2010）也利用大腸桿菌表達(dá)和純化獲得含有GST融合標(biāo)簽的蘿卜PHGPx，并通過體外試驗(yàn)證實(shí)蘿卜PHGPx可有效降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平，抑制氧化脅迫下的細(xì)胞凋亡，該結(jié)論可為PHGPx基因表達(dá)分子調(diào)控研究提供一定的理論依據(jù)。Wang等（2012）從大馬哈魚的嗅覺組織中克隆獲得兩種GPx4亞型（GPx4a和GPx4b），并比較二者在嗅覺和肝臟組織中的調(diào)節(jié)作用。蔡絲絲等（2014）通過綜述PHGPx在精子發(fā)育和成熟中的作用，認(rèn)為PHGPx活性是評(píng)價(jià)精液品質(zhì)的重要參數(shù)之一。劉春云等（2015）研究表明，擬穴青蟹PHGPx可能在免疫防御反應(yīng)及精巢的發(fā)育和成熟等過程中發(fā)揮重要作用。馮凱等（2016）利用RACE克隆獲得的山參PHGPx基因全長(zhǎng)序列具有3個(gè)真核生物PHGPx特有的保守亞結(jié)構(gòu)域，其編碼蛋白為跨膜親水性穩(wěn)定蛋白質(zhì)，與柑橘、蓖麻等PHGPx氨基酸序列同源性分別為76%和75%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】GPx4不僅在保護(hù)細(xì)胞免受過氧化損傷中發(fā)揮重要作用，還在食物有害物質(zhì)羥基脂肪酸的形成過程中起重要作用，但目前針對(duì)禽類GPx4基因表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)的研究尚無文獻(xiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)麻鴨GPx4進(jìn)行體外表達(dá)純化，并在此基礎(chǔ)上分析溫度、pH、NaCl濃度及金屬離子對(duì)麻鴨GPx4活力的影響，為進(jìn)一步研究GPx4功能及其在羥基脂肪酸形成過程中的調(diào)節(jié)機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

谷胱甘肽過氧化物酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京碧云天生物技術(shù)有限公司;酵母提取物和胰蛋白胨購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自南京擎科生物科技有限公司;pMBP表達(dá)載體由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供;質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;異丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素和卡那霉素購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;Taq DNA聚合酶、pMD19-T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司。主要設(shè)備儀器：UV-6100型分光光度計(jì)（普析通用）、Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀（BIO-RAD）、BioTek Synergy2多功能酶標(biāo)儀、Tanon-1600全自動(dòng)凝膠成像分析儀和AKTA蛋白純化系統(tǒng)（GE Healthcare）。

1. 2 麻鴨GPx4基因（DGPx4）克隆

以去掉信號(hào)肽的DGPx4基因序列為模板，運(yùn)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物[F：5'-CGCGGA TCCATGCGGAGAATGT-3'（下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）;R：5'-AACGTCGACCAGGTAGGCGGGCA-3'（下劃線為SalⅠ酶切位點(diǎn)）]，由南京擎科生物科技有限公司合成。以麻鴨肌肉cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20.0 μL：cDNA模板 1.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，2×Taq Master Mix 10.0 μL，ddH2O 7.4 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并采用試劑盒純化回收目的條帶。

1. 3 重組表達(dá)載體pMBP-DGPx4構(gòu)建

參照張玉梅等（2018）的方法，在37 ℃下采用BamHⅠ和SalⅠ酶切pMBP表達(dá)載體及擴(kuò)增獲得的DGPx4基因2 h，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化回收后，用T4連接酶連接（4 ℃，過夜）。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行菌液PCR鑒定，篩選出陽性重組質(zhì)粒并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1. 4 半胱氨酸突變體DGPx4表達(dá)載體pMBP-DGPx4（48Sec→Cys）構(gòu)建

采用QuickChange的方法將pMBP-DGPx4中第48位Sec突變?yōu)镃ys。定點(diǎn)突變是通過設(shè)計(jì)引物，并利用PCR將模板擴(kuò)增出來，然后去掉模板，即獲得已突變成功的產(chǎn)物，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、測(cè)序確定。設(shè)計(jì)引物F（5'-CGTGGCGTACAAATGCGGAAAGACCGC GGT-3'）和R（5'-ACCGCGGTCTTTCCGCATTTGTA CGCCACG-3'），引物由南京擎科生物科技有限公司合成，引物稀釋到10 mmol/L備用。點(diǎn)突變反應(yīng)體系50.0 μL：重組表達(dá)載體pMBP-DGPx4 1.0 μL，上、下游引物各1.5 μL，2×Phanta Max Master Mix 25.0 μL，ddH2O 21.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 15 s，68 ℃ 4 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。突變產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，并用Dpn I酶切去甲基化，以清除DNA模板，反應(yīng)體系50.0 μL：質(zhì)粒40.0 μL，Dpn I酶1.0 μL，10×Dpn I 酶緩沖液5.0 μL，ddH2O 4.0 μL。置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)3 h，將其全部轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后提取質(zhì)粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pMBP-DGPx4（48Sec→Cys），-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 5 融合蛋白原核表達(dá)及可溶性分析

參照張玉梅等（2018）的方法，將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Transetta2感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種至5 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃下振蕩（200 r/min）培養(yǎng)，當(dāng)菌液濃度OD600 nm為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.25 mmol/L，22 ℃下誘導(dǎo)（200 r/min）過夜。離心收集沉淀，按1∶5的比例加入緩沖液（20 mmol/L磷酸鹽，120 mmol/L NaCl，pH 7.6）重懸菌體，置于超聲波細(xì)胞破碎儀上破碎10 min（功率80 W，φ2，超聲波1 s，停3 s），取40.0 μL作為總菌，4 ℃下12000 r/min離心5 min，分別取出上清液和沉淀，加入10.0 μL SDS-PAGE上樣緩沖液，用12% SDS-PAGE進(jìn)行分析，設(shè)不加IPTG誘導(dǎo)的菌液為對(duì)照。

1. 6 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

參照張玉梅等（2018）的方法，將上述鑒定能可溶性表達(dá)的菌落接種于1 L含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，4000 r/min離心20 min，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，冰浴條件下超聲波破碎30 min（功率180 W，超聲波1 s，停3 s）后，4 ℃下12000 r/min離心20 min，收集上清液。鎳柱平衡后將上清液加入鎳親和層析柱中，用不同濃度的咪唑洗脫液洗脫并收集，初步純化蛋白，取樣液加入SDS-PAGE上樣緩沖液，用12% SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況。將較純的樣品用10 kD超濾管離心進(jìn)行濃縮（4 ℃，4000 r/min），以離子交換層析進(jìn)一步純化，再采用SDS-PAGE檢測(cè)純化產(chǎn)物并濃縮;用BCA法測(cè)定蛋白濃度，分裝后置于-80 ℃保存。

1. 7 DGPx4活力測(cè)定及酶學(xué)性質(zhì)研究

DGPx4活力以總谷胱甘肽過氧化物酶活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)（Peng et al.，2012）。GPx可催化GSH產(chǎn)生氧化型GSH（GSSG），而GSH還原酶可利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）催化GSSG產(chǎn)生GSH，通過檢測(cè)NADPH的減少量可計(jì)算出GPx的活力水平。由于NADPH在340 nm處有最大吸收，隨NADPH的逐漸消耗，在340 nm 處的吸光值將逐漸降低，因此通過檢測(cè)NADPH消耗量，即可檢測(cè)GPx4活力。

1. 7. 1 最適溫度 分別在15、20、27、32、37和47 ℃下測(cè)定DGPx4活力，設(shè)酶活力最高值為100%，計(jì)算各溫度下的相對(duì)酶活力。

1. 7. 2 最適pH 分別配制0.05 mol/L的檸檬酸—檸檬酸三鈉緩沖液（pH 4.5和6.0）、磷酸氫二鈉—磷酸二氫鈉緩沖液（pH 7.5和8.0）和甘氨酸—?dú)溲趸c緩沖液（pH 9.0和9.6）。設(shè)酶活力最高值為100%，測(cè)定并計(jì)算各pH下的相對(duì)酶活力。

1. 7. 3 NaCl添加量 分別配制0、1%、2%、3%、4%和5%的NaCl。設(shè)酶活力最高值為100%，測(cè)定并計(jì)算不同NaCl添加量下的相對(duì)酶活力。

1. 7. 4 金屬離子 分別配制0.2 mol/L的Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Ni2+溶液，按酶活力測(cè)定方法依次加入183.0 μL檢測(cè)緩沖液、2.0 μL酶液、11.0 μL GPx檢測(cè)工作液，混勻后加入4.0 μL的15 mmol/L過氧化物溶液，最后加入2.0 μL不同金屬離子溶液，混勻，測(cè)定340 nm處的吸光值。設(shè)不加酶液為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2. 1 DGPx4基因全長(zhǎng)克隆及序列分析結(jié)果

以麻鴨骨骼肌細(xì)胞cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得DGPx4編碼基因全長(zhǎng)516 bp（圖1），擴(kuò)增條帶大小與預(yù)期結(jié)果相符。序列分析結(jié)果表明，DGPx4基因編碼172個(gè)氨基酸，編碼蛋白分子量約20 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為8.9。

2. 2 DGPx4基因及其突變體基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

采用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ對(duì)pMBP表達(dá)載體和擴(kuò)增獲得的DGPx4基因及其突變體基因進(jìn)行酶切和連接，以獲得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定，結(jié)果獲得約500 bp的片段（圖2和圖3），與DGPx4基因大小相符。進(jìn)一步的測(cè)序結(jié)果證實(shí)，插入位置、閱讀框及重組基因序列均準(zhǔn)確無誤，表明DGPx4基因已成功克隆至pMBP表達(dá)載體中，突變重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pMBP-DGPx4（48Sec→Cys）。由于DGPx4基因編碼區(qū)內(nèi)有編碼Sec的密碼子UGA，在原核生物中無法正常翻譯該密碼子，而導(dǎo)致蛋白翻譯過程終止，因此需將該密碼子突變?yōu)閁GC，即將Sec突變?yōu)镃ys，確保蛋白翻譯過程正常進(jìn)行，構(gòu)建成功后測(cè)序讀碼框內(nèi)的序列也完全正確。

2. 3 DGPx4融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性檢測(cè)結(jié)果

由圖4可看出，第4泳道（未加IPTG誘導(dǎo)劑）重組菌在預(yù)期位置未出現(xiàn)明顯的表達(dá)條帶，第3泳道則獲得高效表達(dá)的可溶性融合蛋白條帶，目的條帶大小約60 kD（DGPx4融合蛋白20 kD，pMBP表達(dá)載體40 kD），與預(yù)期結(jié)果一致。

2. 4 DGPx4融合蛋白的純化

2. 4. 1 DGPx4融合蛋白的初步純化 由于DGPx4融合蛋白N-端帶有His標(biāo)簽，首先采用Ni-NTA進(jìn)行親和層析純化，收集不同濃度咪唑洗脫液得到的組分，再進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果（圖5）顯示，20、50、100 mmol/L咪唑洗脫可去除較多雜蛋白，經(jīng)250 mmol/L咪唑洗脫可得到較純的DGPx4融合蛋白，說明Ni-NTA親和層析能有效純化獲得DGPx4融合蛋白。收集100和250 mmol/L咪唑的洗脫液，用分子截留量為10 kD的超濾離心管進(jìn)行濃縮，為下一步離子層析做準(zhǔn)備。

2. 4. 2 DGPx4融合蛋白的離子交換層析 Ni-NTA親和層析樣品經(jīng)離子交換層析柱純化后得到1個(gè)洗脫峰（圖6），收集后采用12% SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示在60 kD附近出現(xiàn)1條目的條帶（圖7），與預(yù)期結(jié)果一致。將收集的洗脫峰濃縮后用BCA法測(cè)定蛋白濃度，分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 5 DGPx4的酶學(xué)性質(zhì)

2. 5. 1 溫度對(duì)DGPx4活力的影響 由圖8可看出，隨反應(yīng)溫度的升高，DGPx4活力呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，最適反應(yīng)溫度為32 ℃;當(dāng)溫度上升至37 ℃時(shí)，DGPx4活力下降至最適溫度下酶活力的50%以下;而溫度達(dá)47 ℃時(shí)酶活力基本為0，表明DGPx4對(duì)熱較敏感。

2. 5. 2 pH對(duì)DGPx4活力的影響 由圖9可看出，在pH 4.5～8.0間DGPx4的活力逐漸增加，在pH 8.0下酶活力達(dá)最大值，之后隨pH的升高而降低，當(dāng)pH達(dá)9.6時(shí)，DGPx4活力已不足30%?？梢姡h(huán)境過酸或過堿均不利于DGPx4催化反應(yīng)的進(jìn)行。

2. 5. 3 NaCl添加量對(duì)DGPx4活力的影響 由圖10可看出，NaCl添加量為3%時(shí)的相對(duì)酶活力約50%，當(dāng)NaCl添加量達(dá)5%時(shí)相對(duì)酶活力下降至20%左右，說明DGPx4對(duì)NaCl濃度較敏感。

2. 5. 4 金屬離子對(duì)DGPx4活力的影響 由圖11可看出，Cu2+和Ni2+對(duì)DGPx4活力有較高的促進(jìn)作用，Mg2+和Mn2+對(duì)DGPx4活力有一定的抑制作用，Ca2+和Zn2+對(duì)DGPx4活力則無明顯的促進(jìn)或抑制作用。

3 討論

麻鴨是我國(guó)鴨子的祖先之一，屬于野生鴨子種類，其肌肉中蛋白含量16%～25%，脂肪含量適中，約7.5%，且脂肪酸中含有不飽和脂肪酸和短鏈飽和脂肪酸，富含煙酸，對(duì)心肌梗死等心臟疾病患者具有保護(hù)作用。麻鴨在加工儲(chǔ)藏過程中極易發(fā)生脂質(zhì)氧化，適度氧化對(duì)麻鴨風(fēng)味及品質(zhì)產(chǎn)生良性影響，但過度氧化會(huì)影響食品的風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而GPx4在抗脂質(zhì)氧化過程中發(fā)揮重要作用（Jostarndt et al.，2002;張超等，2017）。GPx4是目前已知唯一能直接作用于脂質(zhì)氫過氧化物的含硒谷胱甘肽過氧化物酶，其單體結(jié)構(gòu)有助于其與細(xì)胞膜上的氫氧化物結(jié)合并進(jìn)行反應(yīng)，從而保護(hù)細(xì)胞膜免受過氧化損傷（Imai and Nakagawa，2003;Yant et al.，2003）。近年來的研究表明，在人類精子發(fā)育的最后階段GPx4將轉(zhuǎn)化為精子后端的結(jié)構(gòu)蛋白，在精子成熟過程中發(fā)揮重要作用;且GPx4在線粒體凋亡途徑中可減少線粒體產(chǎn)生的過氧化氫物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡過程中起決定性作用（閆春燕等，2008）。此外，氫過氧化脂質(zhì)在食品加工過程中隨產(chǎn)品加工周期的延長(zhǎng)而不斷上升（Song et al.，2016），且氫過氧化脂質(zhì)的攝入會(huì)增加人體動(dòng)脈硬化等疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)（Jira et al.，1998;Choque et al.，2014;Vangaveti et al.，2014），而GPx4在脂質(zhì)氫過氧化物的產(chǎn)生中扮演著重要角色。

盡管目前已認(rèn)識(shí)到GPx4在肉品加工中的潛在應(yīng)用價(jià)值，但從鴨肉中直接獲得純GPx4成本高且后期純化難。為了更好地研究鴨肉加工和貯藏過程中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)理和途徑，既保留風(fēng)味物質(zhì)又能保持鴨肉加工過程中的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，本研究以鴨肉為原料，采用RT-PCR克隆GPx4的編碼基因，經(jīng)原核誘導(dǎo)表達(dá)和提取純化后對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，以期為鴨肉制品的加工和貯藏提供技術(shù)支持。GPx4活性中心是由氨基酸殘基Gln、Trp聯(lián)合Sec組成的三聯(lián)體催化結(jié)構(gòu)，其中，Sec是由終止密碼子UGA編碼，但在大腸桿菌中無法進(jìn)行蛋白表達(dá)，因此本研究通過定點(diǎn)突變的方法將Sec突變?yōu)镃ys，然后在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。在進(jìn)行GPx4原核表達(dá)時(shí)，本課題組發(fā)現(xiàn)DGPx4在大腸桿菌中主要以包涵體形式存在，其氨基酸無法形成正確的空間結(jié)構(gòu)，而影響蛋白活性及后續(xù)研究與應(yīng)用。經(jīng)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以麥芽糖結(jié)合蛋白（Maltose binding protein，MBP）作為分子伴侶蛋白與DGPx4融合表達(dá)，可有效解決蛋白以包涵體形式在大腸桿菌中表達(dá)的問題，因此，本研究將MBP編碼基因malE通過基因重組技術(shù)導(dǎo)入普通表達(dá)載體中，結(jié)果成功構(gòu)建了能大量表達(dá)可溶性目的蛋白的載體pMBP-DGPx4（48Sec→Cys）。

4 結(jié)論

從鴨肝細(xì)胞中克隆獲得的DGPx4基因序列經(jīng)定點(diǎn)突變后可在原核細(xì)胞中高效表達(dá)，且純化后的高純度融合蛋白DGPx4具有GPx4活力，能在抗脂質(zhì)氧化過程中發(fā)揮作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）