孫立亭　林添資　景德道　余波　錢華飛　曾生元　李闖　姚維成　杜燦燦　胡慶峰　周義文　龔紅兵

摘要：【目的】研究多基因聚合對水稻稻瘟病抗性的效應，并開發(fā)Pb1基因功能標記，為江蘇省培育持久抗稻瘟病品種及提高其育種效率提供理論依據(jù)?！痉椒ā块_發(fā)Pb1基因的功能標記，并結合Pita、Pib、Pi54、Pikm和Pizt功能標記檢測2015─2017年參加江蘇省預試的703份常規(guī)粳稻材料的抗病基因，分析其聚合方式與稻瘟病抗性的相關性?！窘Y果】在Pb1基因編碼區(qū)上游926～1085 bp設計1個存在/缺失標記M1，其引物可擴增獲得160 bp的片段。703份供試材料中，Pita、Pib和Pi54基因頻率高于Pikm、Pb1和Pizt，雖然抗病頻率（稻瘟病綜合指數(shù)≤5.0的材料所占比例）在2015─2017年呈逐年快速升高趨勢，但3年間達中抗及以上等級的材料所占比例均較低。不含抗病基因的材料11份，綜合指數(shù)≤5.0的材料4份，抗病頻率為36.36%;當所含抗病基因數(shù)≤3個時，隨著含抗病基因數(shù)的增加，對應的材料數(shù)量、出現(xiàn)頻率和綜合指數(shù)≤5.0的材料數(shù)量均明顯增加，當所含抗病基因數(shù)≥4個時，隨著含抗病基因數(shù)的增加，對應的材料數(shù)量、出現(xiàn)頻率和綜合指數(shù)≤5.0的材料數(shù)量均明顯降低。抗病基因數(shù)越多，抗病頻率越高，當抗病基因數(shù)達6個時，抗病頻率達100.00%，說明聚合的抗病基因數(shù)與抗病頻率呈正相關。3個抗病基因聚合的最佳方式為：Pi54+Pib+Pb1或Pita+Pib+Pikm。4個抗病基因聚合的最佳方式為Pita+Pib+Pikm+Pizt或Pita+Pi54+Pib+Pb1。【結論】開發(fā)的Pb1基因功能標記可應用于水稻稻瘟病抗性育種，以提高選擇效率。多基因聚合能提高水稻稻瘟病抗性，但抗性強弱取決于抗性基因間的互作效應，并不是簡單的累加效應。

關鍵詞： 稻瘟病;多基因聚合;分子標記;抗性育種

中圖分類號： S511.220.32 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）05-0913-11

Abstract：【Objective】Studying the effect of multiple genes polymerization on rice blast resistance could guide bree-ding rice blast resistant varieties and improve breeding efficiency in Jiangsu Province. 【Method】Functional markers of Pb1 was developed， and resistance genes of 703 japonica rices for preliminary experiment in the year of 2015，2016 and 2017 in Jiangsu were detected using functional markers of Pita，Pib，Pi54，Pikm and Pizt，then the correlation between polymerization mode and rice blast resistance was analyzed. 【Result】A presence/deletion marker M1 was designed near 1016 bp upstream of the coding region of Pb1. Its primer could amplify 160 bp fragment. Among the 703 materials， the gene frequency of Pita，Pib and Pi54 was higher than that of Pikm，Pb1 and Pizt. Although the frequency of rice blast resistance （the proportion of materials with composite index of blast ≤5.0） increased rapidly year by year from 2015 to 2017，the moderate resistance and above level ratios were low during the three years. Among the 703 materials tested，11 did not contain resistance genes，of which 4 materials had a composite index ≤5.0 and the resistance frequency of 36.36%. When the number of disease-resistant genes was ≤3，the number of materials，frequency of occurrence and the number of materials whose composite index was ≤5.0 increased greatly with the increase of the number of disease resistant genes. When the number of disease resistant genes was ≥4，the number of materials，the frequency of gene occurrence and the number of materials whose composite index was ≤5.0 decreased greatly with the increase of the number of disease resistant genes.The higher the number of resistance genes，the higher the resistance frequency. When the number of resistance genes reached 6，the resistance frequency reached 100.00%. This indicated that the number of multiple genes polymerization was positively correlated with the resistance frequency. The optimal polymerization mode for three genes was Pi54+Pib+Pb1 or Pita+Pib+Pikm. The optimal polymerization mode for four genes was Pita+Pib+Pikm+Pizt or Pita+Pi54+Pib+Pb1. 【Conclusion】The developed functional markers of Pb1 can be used in rice blast resistance breeding to improve selection efficiency. Polygenic polymerization can improve the resistance level of rice blast，but the resistance depends on the interaction between resistant genes，not simply the cumulative effect.

Key words： rice blast; multiple genes polymerization; molecular marker; resistance breeding

0 引言

【研究意義】稻瘟病是由子囊菌（Magnaporthe oryzae）引發(fā)的一種嚴重的水稻病害，對水稻產(chǎn)量產(chǎn)生嚴重影響（Khush and Jena，2009;Skamnioti and Gurr，2009;劉萬才等，2016）。長期實踐證明，培育抗病品種是最環(huán)保、最經(jīng)濟有效的方法（Koide et al.，2009;Miah et al.，2013）。水稻對稻瘟病的抗性可分為水平抗性和垂直抗性，其中垂直抗性具有很強的小種?；?，易隨小種的變化而喪失，尤其是含有單個主效抗病基因的品種（Mackill and Bonman，1992;孫大元等，2017）。水稻聚合多個抗病基因后其植株抗譜和抗性均得到提高，是獲得持久抗性的有效方法之一（Hittalmani et al.，2000）。因此，分析我國江蘇省多基因聚合對稻瘟病抗性的效應，對改良現(xiàn)有品種的稻瘟病抗性具有重要意義。【前人研究進展】隨著分子生物學和基因定位技術的發(fā)展，水稻稻瘟病抗性基因的研究取得長足進展。為開展高效的分子育種，對分子標記進行篩選即能實現(xiàn)性狀篩選，其原因是一個分子標記位點代表一個特定的等位基因，并與該基因控制的性狀相聯(lián)系，水稻抗稻瘟病基因的克隆為開發(fā)基因功能標記提供了基礎和前提（Andersen and Lǖbberstedt，2003）。目前，成功克隆的稻瘟病抗性基因有Pib（Wang et al.，1999）、Pita（Bryan et al.，2000）、Pi5（Jeon et al.，2003）、Pid2（Chen et al.，2006）、Piz-t（Zhou et al.，2006）、Pi2（Zhou et al.，2006）、Pi9（Qu et al.，2006）、Pi37（Lin et al.，2007）、Pi21（Fukuoka et al.，2009）、Pid3（Shang et al.，2009）、Pb1（Hayashi et al.，2010b）、Pit（Hayashi et al.，2010a）、Pish（Takahashi et al.，2010）、Pi2（Chen et al.，2011）、Pia（Okuyama et al.，2011）、Pik-p（Yuan et al.，2011）、Pikm（Zhai et al.，2011）、Pik（Ashikawa et al.，2012）、Pik-h/Pi54（Das et al.，2012）、Pi1（Hua et al.，2012）、Pi56（Liu et al.，2013）、Pi63（Xu et al.，2014）和Pigm（Deng et al.，2017）等。其中Pita基因位于第12條染色體上，編碼細胞質膜受體蛋白，該蛋白與稻瘟病菌的無毒基因AVR-Pita表達產(chǎn)物相互作用引發(fā)抗病反應（Bryan et al.，2000）;Pib基因定位于第2條染色體上，對日本大多數(shù)稻瘟病菌小種有抗性，對我國的菌株ZB13和ZC15也有抗病反應（Wang et al.，1999）;pik座位上有5個等位基因，分別為Pi-l、Pik-h、Pi54、Pikm和Pikp基因，其中，Pi54基因屬于抗病基因的CC-NBS-LRR家族，對稻瘟病菌具有廣譜抗性（Das et al.，2012），Pikm是由兩個緊密連鎖的具有獨立功能NBS-LRR類基因（Pikm1-TS和Pikm2-TS）組成（Ashikawa et al.，2008）;Pizt基因位于第6條染色體上的Piz位點，屬于NBS-LRR類基因，其編碼1033個氨基酸，含1個核苷酸結合位點（NBS）和3個富亮氨酸重復區(qū)（LRR）（Zhou et al.，2006）。大量研究表明，聚合多個抗性基因是培育廣譜、持久抗性品種的一條有效途徑。范方軍等（2014）對2012年審定的江蘇水稻品種進行抗病基因檢測，結果發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)水稻品種含有稻瘟病抗性基因Pita、Pib、Pi54和Pikm。劉斌等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，云南省56個主栽水稻品種中Pita2、pi5、Pi9和Pizt基因出現(xiàn)頻率較高，且對稻瘟病抗性良好。張善磊等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，國內外238個粳稻品種（系）中同時含有Pita、Pi5和Pikm基因的品種（系）表現(xiàn)出較強的穗頸瘟抗性。黃乾龍等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，重慶自育骨干親本攜帶抗病基因及聚合方式不同，稻瘟病抗性均存在差異?！颈狙芯壳腥朦c】目前，稻瘟病抗性基因Pita、Pib、Pi54、Pikm、Pb1和Pizt等在江蘇省的聚合效應仍不清楚。因此，有必要對江蘇省常規(guī)粳稻的抗病基因與抗性效應進行分析，總結基因聚合模式與稻瘟病抗性間的關系，并根據(jù)基因型和抗病性制定育種策略。【擬解決的關鍵問題】通過開發(fā)Pb1基因功能標記，結合前人已開發(fā)的Pita、Pib、Pi54、Pikm和Pizt基因功能標記，對2015—2017年江蘇省703個常規(guī)粳稻預試品種（系）進行抗病基因檢測，并測定其稻瘟病抗性，分析抗病基因聚合方式與稻瘟病抗性的相關性，為江蘇省抗病品種（系）的合理布局、培育持久抗病品種（系）及提高育種效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為2015─2017年參加江蘇省預試的703常規(guī)粳稻材料。其中，2015年參加江蘇省預試的材料222份，包括中熟中粳79份、遲熟中粳93份、早熟晚粳50份;2016年參加江蘇省預試的材料221份，包括中熟中粳83份、遲熟中粳89份、早熟晚粳49份;2017年參加江蘇省預試的材料260份，包括中熟中粳92份、遲熟中粳104份、早熟晚粳64份，均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院提供。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成;Taq DNA聚合酶和dNTP購自上海捷瑞生物工程有限公司。主要儀器設備：PCR擴增儀（Biometra TProfessional PCR）、電泳槽（DYCZ-30C）、電泳儀（BIO-RAD）和高通量組織研磨儀（DHS TL2020）。

1. 2 Pb1基因功能標記開發(fā)與驗證

Hayashi等（2010b）對日本品種St. No1中的Pb1和P5基因進行克隆及分析，結果發(fā)現(xiàn)Pb1位于一個以60 kb為單位的串聯(lián)重復序列中，且Pb1位于第二個重復基序中，與第一個重復基序的P5相對應，Pb1與P5均具有穗瘟抗性，但Pb1的穗瘟抗性高于P5，兩個基因的抗穗瘟差異取決于Pb1基因編碼區(qū)上游1～2056 bp的特有序列?；谏鲜鲅芯拷Y果，通過NCBI搜索獲得Pb1基因（登錄號AB570371.1）和P5基因（登錄號LOC_Os11g38480）及感病品種日本晴等位基因Os11g0598500（登錄號LOC_Os11g38580）。將P5基因編碼區(qū)上游序列和日本晴等位基因Os11g0598500Pb1與Pb1基因編碼區(qū)上游序列進行序列比對，尋找差異位點，利用Primer 5.0設計特異引物，并利用鎮(zhèn)稻88、鎮(zhèn)稻18號和日本晴進行驗證。

1. 3 PCR擴增

水稻基因組DNA提取采用SDS法（孫立亭等，2017）。根據(jù)等位基因PCR擴增原理，針對Pita、Pi54、Pib、Pikm、Pb1和Pizt抗感等位基因序列的差異設計特異引物（表1）。以基因組DNA為模板，PCR克隆稻瘟病抗性基因標記。反應體系10.0 μL：1.2 μL 10×Taq Buffer，50 ng/μL基因組DNA 1.5 μL，2 mmol/L上、下游引物各0.5 μL，1 mmol/L dNTP 0.3 μL，1000 U Taq DNA聚合酶0.1 μL，ddH2O補足至10.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，進行33個循環(huán);72 ℃延伸10 min。Pita和Pib基因標記的擴增產(chǎn)物用4%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，其他基因標記的擴增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。取PCR產(chǎn)物2.0 μL，以100 bp-ⅠDNA Ladder作為DNA Marker，在240 V恒壓下電泳1 h。最后，采用銀染法顯示DNA條帶。

1. 4 抗病基因檢測

根據(jù)片段大小判斷抗病基因功能標記。利用Pita-F/Pita-R引物可擴增出1042 bp條帶，同時NPita-F/NPita-R引物擴增不出條帶，則判定為該材料含有Pita基因。利用Pib-F/Pib-R引物可擴增出365 bp條帶，同時NPib-F/NPib-R擴增不出條帶，則判定為該材料含Pib基因。利用A-F/A-R引物可擴增出160 bp條帶，同時G-F/G-R引物擴增不出條帶，則該材料含Pizt基因。利用Pi54-F/Pi54-R引物擴增，若擴增片段為216 bp，則判定為該材料含Pi54基因，若擴增片段為359 bp，則判定為該材料不含Pi54基因。利用Pikm由Pikm1-F/Pikm1-R和Pikm2-F/Pikm2-R兩對引物進行擴增，若Pikm1-F/Pikm1-R擴增片段為174 bp，則判定該材料含Pikm1基因，若擴增片段為213 bp則判定不含Pikm1基因;若Pikm2-F/Pikm2-R擴增片段為290 bp，則判定該材料含Pikm2基因，若擴增片段為332 bp，則判定該材料不含Pikm2基因。利用M1-F/M1-R引物擴增，若擴增片段為160 bp，則判定該材料含Pb1基因，若無條帶，則判定該材料不含Pb1基因。

1. 5 稻瘟病抗性鑒定與抗病頻率評價

供試材料的抗性鑒定綜合指數(shù)評價分級標準如表2所示。鑒定結果參考《江蘇省水稻新品種中間試驗總結匯編（2015─2017）》江蘇省種子管理站，2015，2016，2017）。綜合指數(shù)=（葉瘟病級×25%+穗瘟發(fā)病率病級×25%+穗瘟損失指數(shù)病級×50%。

2 結果與分析

2. 1 稻瘟病抗性基因Pb1功能標記的開發(fā)及驗證結果

通過比對Pb1和P5基因的編碼區(qū)上游1～1016 bp序列，結果發(fā)現(xiàn)，Pb1基因在356 bp處比P5基因多17 bp，在1 bp處比P5基因少17 bp，但日本晴等位基因Os11g0598500不含此段序列（圖1）。通過比對Pb1基因編碼區(qū)上游1017～2056 bp與日本晴等位基因Os11g0598500序列，結果發(fā)現(xiàn)Pb1基因與日本晴基因組序列存在31處單堿基替換，其他序列完全匹配（圖2）。

本研究在Pb1基因編碼區(qū)上游1016 bp附近設計1對存在/缺失標記M1（表1），該標記具體位于Pb1基因編碼區(qū)上游926～1085 bp，其引物可擴增160 bp片段，若材料不含Pb1基因則擴增不出該片段，如圖3所示鎮(zhèn)稻88和鎮(zhèn)稻18號（抗稻瘟?。┚軘U增出160 bp的片段，而日本晴擴增不出對應的片段。Pb1基因的供體為Modan，而鎮(zhèn)稻88含有Modan血緣且抗稻瘟病，測序結果表明，鎮(zhèn)稻88中含有Pb1基因（圖4和圖5）。說明該功能標記可特異性檢測Pb1基因。

2. 2 抗性基因檢測及其分布情況

利用Pita、Pib、Pi54、Pikm、Pizt和Pb1等6個抗性基因的功能標記對703份供試材料進行抗性基因檢測，結果發(fā)現(xiàn)含Pita、Pi54、Pib、Pikm、Pb1和Pizt基因的材料比例在2015─2017年發(fā)生明顯變化，2015年分別為51.8%、40.1%、75.2%、20.7%、23.0%和22.1%，2016年分別為62.4%、53.4%、83.7%、24.9%、31.7%和27.1%，2017年分別為69.6%、54.6%、83.5%、18.8%、26.9%和22.3%（圖6）?？梢姡?015—2017年江蘇省預試材料中Pita、Pib和Pi54基因頻率高于Pikm、Pb1和Pizt。

2. 3 稻瘟病的抗性鑒定結果

由表3可知，2015─2017年未鑒定出高抗材料，2015年抗病材料比例為4.05%，2016和2017年抗病材料均為0，2017年中抗材料比例（28.46%）明顯高于2015年（18.02%）和2016年（10.86%），2015─2017年中感材料比例逐年升高，但感病和高感材料比例有所降低。整體來看，雖然抗病頻率在2015─2017年呈逐年快速升高趨勢，但3年間達中抗及以上等級的材料所占比例均偏低。

2. 4 抗病基因與綜合病指的相關性分析結果

江蘇省品種審定對稻瘟病的抗性要求綜合指數(shù)≤5.0，因此，以綜合指數(shù)5.0為界限研究抗病基因與稻瘟病抗性的關系。由表4可知，不含抗病基因的材料11份，綜合指數(shù)≤5.0的材料4份，抗病頻率為36.36%。當所含抗病基因數(shù)≤3個時，隨著含抗病基因數(shù)的增加，對應的材料數(shù)量、出現(xiàn)頻率和綜合指數(shù)≤5.0的材料數(shù)量均明顯增加;當所含抗病基因數(shù)≥4個時，隨著抗病基因數(shù)的增加，對應的材料數(shù)量、出現(xiàn)頻率和綜合指數(shù)≤5.0的材料數(shù)量均明顯降低?？共』驍?shù)越多，抗病頻率越高，當抗病基因數(shù)達3個時，抗病頻率達69.93%，當抗病基因數(shù)達6個時，抗病頻率達100.00%，表明抗病基因數(shù)與抗病頻率呈正相關。703份供試材料中，含有5和6個抗病基因的出現(xiàn)頻率較低，僅為1.85%和0.71%，因此本研究進一步分析3和4個抗病基因聚合方式與稻瘟病抗性的相關性。

2. 5 3個抗病基因的聚合效應分析結果

3個抗病基因的聚合效應如表5所示。703份供試材料中含有3個抗病基因的材料286份，其中稻瘟病綜合指數(shù)≤5.0的材料有200份，抗病頻率為69.93%。不同抗病基因聚合方式的抗病頻率存在明顯差異，其中抗病頻率大于69.93%的聚合方式有7種，從高到低依次為：Pita+Pikm+Pizt=Pita+Pb1+Pizt=Pi54+Pib+Pb1>Pita+Pib+Pikm>Pita+Pib+Pizt>Pi54+Pib+Pikm>Pita+Pi54+Pikm，這7種聚合方式的出現(xiàn)頻率從高到低依次為：Pita+Pib+Pikm>Pita+Pib+Pizt>Pi54+Pib+Pikm>Pi54+Pib+Pb1>Pita+Pi54+Pikm> Pita+Pikm+Pizt>Pita+Pb1+Pizt。綜上所述，抗病頻率最高且出現(xiàn)頻率相對較高的基因聚合方式為Pi54+Pib+Pb1，出現(xiàn)頻率最高且抗病頻率相對較高的基因聚合方式為Pita+Pib+Pikm，即3個抗病基因聚合的最佳方式為Pi54+Pib+Pb1或Pita+Pib+Pikm。

2. 6 4個抗病基因的聚合效應分析結果

4個抗病基因的聚合效應見表6。703份供試材料中含4個抗病基因的材料107份，其中稻瘟病綜合指數(shù)≤5.0的材料79份，抗病頻率為73.83%。抗病頻率大于73.83%的聚合方式有6種，從高到低依次為：Pita+Pib+Pikm+Pizt=Pita+Pib+Pikm+Pb1=Pita+Pi54+Pikm+Pb1>Pita+Pi54+Pib+Pizt>Pita+Pi54+Pib+Pikm>Pita+Pi54+Pib+Pb1，這6種聚合方式的出現(xiàn)頻率由高到低依次為：Pita+Pi54+Pib+Pb1>Pita+Pi54+Pib+Pikm>Pita+Pib+Pikm+Pizt>Pita+Pi54+Pib+Pizt>Pita+Pib+Pikm+Pb1>Pita+Pi54+Pikm+Pb1。綜上所述，抗病頻率最高且出現(xiàn)頻率相對較高的基因聚合方式為Pita+Pib+Pikm+Pizt，出現(xiàn)頻率最高且抗病頻率相對較高的基因聚合方式為Pita+Pi54+Pib+Pb1，即4個抗病基因聚合的最佳方式為Pita+Pib+Pikm+Pizt或Pita+Pi54+Pib+Pb1。

3 討論

傳統(tǒng)的水稻抗病育種是采用雜交、回交或復交等手段，費時費力，且通常達不到預期目的，但分子標記輔助選擇育種可快速鑒定材料中是否含有抗性基因，且不受水稻生育期和環(huán)境的影響（宋兆強等，2017;肖宇龍等，2018）。分子標記分為連鎖標記和功能標記，應用連鎖標記常達不到育種目的，且連鎖標記可能受遺傳背景的限制，無法應用于非多態(tài)群體（Fujii et al.，2000）。Pb1基因是一種來自秈稻品種Modan的抗性基因，可介導水稻成株期持久的穗瘟病抗性（Hayashi et al.，2010）。有關Pb1基因分子標記的前人研究多集中在連鎖標記（Fujii et al.，2000），但其選擇效率不高且應用具有局限性。本研究開發(fā)了Pb1基因的功能標記并進行驗證，可將其應用于水稻稻瘟病抗性育種，提高選擇效率。

目前，大量水稻稻瘟病基因被定位及克隆，并開發(fā)出一批稻瘟病基因功能標記，其中Pita、Pib、Pikm和Pi54稻瘟病抗性基因及其功能標記已廣泛存在于江蘇省水稻品種（系）中（范方軍等，2014）。本研究對2015─2017年703份江蘇省預試材料抗病基因進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)Pita、Pib和Pi54基因分布最廣，為江蘇省近年主要的稻瘟病抗性基因，但稻瘟病的抗性鑒定結果顯示，2015─2017年達中抗及以上等級的比例偏低，表明Pita、Pib和Pi54基因不能滿足水稻對稻瘟病的抗性需求，需聚合更多抗病基因才能提高水稻持久抗稻瘟病能力。

多基因聚合并不是單個抗病基因抗譜的簡單累加，而是抗性基因間極顯著的互作效應（劉士平等，2003）。因此，多基因聚合育種的前提是了解抗性資源的基因遺傳背景，明確基因聚合類型。本研究對2015─2017年江蘇省預試材料所含抗病基因數(shù)與稻瘟病抗性進行相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)抗病基因數(shù)與抗病頻率呈正相關，但含5和6個抗病基因的材料較少，出現(xiàn)頻率較低，因此本研究進一步分析3和4個抗病基因的聚合方式與稻瘟病抗性的相關性。由于3和4個基因聚合方式存在多樣化，導致每種聚合方式的材料數(shù)量偏低，出現(xiàn)頻率較低，因此，選擇抗病基因聚合的最佳方式時既要考慮各聚合方式的抗病頻率又要考慮其出現(xiàn)頻率，最終確定3個抗病基因聚合的最佳方式為Pi54+Pib+Pb1或Pita+Pib+Pikm，4個抗病基因聚合的最佳方式為Pita+Pib+Pikm+Pizt或Pita+Pi54+Pib+Pb1。此外，由于抗性基因聚合方式Pita+Pi54+Pib+Pizt和Pita+Pi54+Pib+Pizt/Pikm的抗病頻率均達80.00%以上，因此這兩種基因聚合方式也可供育種工作者參考。

本研究中6個抗病基因均不含的材料有11份，其中有2份表現(xiàn)出中抗，可能是由于該品種（系）含有大量其他廣譜抗性基因。在今后的研究中，應對更多的抗性基因進行定位及克隆，并開發(fā)出其特異性功能標記，建立完整的抗稻瘟病水稻資源抗性基因數(shù)據(jù)庫，應用于水稻分子標記輔助選擇育種，以提高水稻稻瘟病抗性。

4 結論

開發(fā)的Pb1基因功能標記可應用于水稻稻瘟病抗性育種，以提高選擇效率。多基因聚合能提高水稻稻瘟病抗性，聚合的抗病基因數(shù)與抗病頻率呈正相關，但稻瘟病抗性取決于抗性基因間的互作效應。

參考文獻：

蔡海亞，周雷，閘雯俊，李三和，劉凱，焦春海，游艾青，徐得澤. 2015. 水稻抗稻瘟病基因Piz-t特異性分子標記開發(fā)及應用[J]. 分子植物育種，13（7）：1457-1461. [Cai H Y，Zhou L，Zha W J，Li S H，Liu K，Jiao C H，You A Q，Xu D Z. 2015. Development and application of rice blast resistant gene Piz-t gene-specific molecular marker[J]. Molecular Plant Breeding，13（7）：1457-1461.]

范方軍，王芳權，劉永峰，王軍，朱金燕，李文奇，仲維功，楊杰. 2014. Pi-b，Pi-ta，Pikm和Pi54對水稻穗頸瘟的抗性評價[J]. 華北農(nóng)學報，29（3）：221-226. [Fan F J，Wang F Q，Liu Y F，Wang J，Zhu J Y，Li W Q，Zhong W G，Yang J. 2014. Evaluation of resistance to rice panicle blast with resistant genes Pi-b，Pi-ta，Pikm and Pi54[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica，29（3）：221-226.]

黃乾龍，管玉圣，歐陽杰，郭爽，王楚桃，李賢勇. 2019. 重慶自育水稻骨干親本稻瘟病抗性評價[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報，50（1）：8-15. [Huang Q L，Guan Y S，Ouyang J，Guo S，Wang C T，Li X Y. 2019. Resistance evaluation of self-bred rice backbone parents germplasms against rice blast in Chongqing and resistance gene distribution analysis[J]. Journal of Southern Agriculture，50（1）：8-15.]

江蘇省種子管理站. 2015. 江蘇省農(nóng)作物品種中間試驗總結匯編（2015）[G]. 南京：江蘇省種子管理站. [Jiangsu Seed Station. 2015. Summary and compilation of intermediate trials of crop varieties in Jiangsu Province（2015）[G]. Nanjing：Jiangsu Seed Station.]

江蘇省種子管理站. 2016. 江蘇省農(nóng)作物品種中間試驗總結匯編（2016）[G]. 南京：江蘇省種子管理站. [Jiangsu Seed Station. 2016. Summary and compilation of intermediate trials of crop varieties in Jiangsu Province（2016）[G]. Nanjing：Jiangsu Seed Station.]

江蘇省種子管理站. 2017. 江蘇省農(nóng)作物品種中間試驗總結匯編（2017）[G]. 南京：江蘇省種子管理站. [Jiangsu Seed Station. 2017. Summary and compilation of intermediate trials of crop varieties in Jiangsu Province（2017）[G]. Nanjing：Jiangsu Seed Station.]

劉斌，畢振佳，何平，韓光煜，董麗英，楊勤忠，王云月. 2018. 云南省主栽水稻品種抗稻瘟病基因型鑒定[J]. 分子植物育種，16（22）：7362-7371. [Liu B，Bi Z J，He P，Han G Y，Dong L Y，Yang Q Z，Wang Y Y. 2018. Genotype identification of blast resistance in major rice varieties in Yunnan Province[J]. Molecular Plant Breeding，16（22）：7362-7371.]

劉士平，李信，汪朝陽，李香花，何予卿. 2003. 基因聚合對水稻稻瘟病的抗性影響[J]. 分子植物育種，1（1）：22-26. [Liu S P，Li X，Wang Z Y，Li X H，He Y Q. 2003. Gene pyramiding to increase the blast resistance in rice[J]. Molecular Plant Breeding，1（1）：22-26.]

劉萬才，劉振東，黃沖，陸明紅，劉杰，楊清坡. 2016. 近10 年農(nóng)作物主要病蟲害發(fā)生危害情況的統(tǒng)計和分析[J]. 植物保護，42（5）：1-9. [Liu W C，Liu Z D，Huang C，Lu M H，Liu J，Yang Q P. 2016. Statistics and analysis of crop yield losses caused by main diseases and insect pests in recent 10 years[J]. Plant Protection，42（5）：1-9.]

宋兆強，劉艷，王寶祥，王芳權，遲銘，劉金波，陳庭木，方兆偉，邢運高，徐波，楊波，楊杰，徐大勇. 2017. 稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi-km的育種利用價值評價[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，33（5）：968-974. [Song Z Q，Liu Y，Wang B X，Wang F Q，Chi M，Liu J B，Chen T M，F(xiàn)ang Z W，Xing Y G，Xu B，Yang B，Yang J，Xu D Y. 2017. Application value of blast resistant genes Pi-ta，Pi-b，Pi54 and Pi-km inrice breeding[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，33（5）：968-974.]

孫大元，周丹華，張景欣，王慧，朱小源，楊祁云，陳志強. 2017. 廣譜抗源H4中2個主效抗病基因的單基因系構建及評價[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，33（1）：1-5. [Sun D Y，Zhou D H，Zhang J X，Wang H，Zhu X Y，Yang Q Y，Chen Z Q. 2017. Development of near-isogenic lines for two blast resistance genes in an indicarice H4[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，33（1）：1-5.]

孫立亭，林添資，王云龍，牛梅，胡婷婷，劉世家，王益華，萬建民. 2017. 水稻白條紋突變體st13的表型分析及基因定位[J]. 中國水稻科學，31（4）：355-363. [Sun L T，Lin T Z，Wang Y L，Niu M，Hu T T，Liu S J，Wang Y H，Wan J M. 2017. Phenotypic analysis and gene mapping of a white stripe mutant st13 in rice[J]. Chinese Journal of Rice Science，31（4）：355-363.]

肖宇龍，李湘民，余傳元，雷建國，王智權，王曉玲，何虎，邱在輝，肖宇華. 2018. 江西省稻瘟病生理小種致病力測定及1組水稻優(yōu)質新種質的稻瘟病抗性表現(xiàn)及應用評估[J]. 江西農(nóng)業(yè)學報，30（4）：9-13. [Xiao Y L，Li X M，Yu C Y，Lei J G，Wang Z Q，Wang X L，He H，Qiu Z H，Xiao Y H. 2018. Pathogenicity of physiological races of rice blast disease in Jiangxi Province，blast-resistant performance and application evaluation of a set of new high-quality rice germplasms[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，30（4）：9-13.]

張善磊，孫旭超，陳濤，趙春芳，朱鎮(zhèn)，趙慶勇，周麗慧，趙凌，姚姝，王才林. 2018. Pi-ta、Pi-5、Pi-km和Pi-b基因在粳稻品種（系）中的分布及對穗頸瘟的抗性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，34（5）：961-971. [Zhang S L，Sun X C，Chen T，Zhao C F，Zhu Z，Zhao Q Y，Zhou L H，Zhao L，Yao S，Wang C L. 2018. Distribution of Pi-ta，Pi-5，Pi-km and Pi-b genes in japonica rice varieties（lines） and their relationship with neck blast resistance[J]. Jiangsu Journal of Agriculture Sciences，34 （5）：961-971.]

Andersen J R，Lǖbberstedt T. 2003. Functional markers in plants[J]. Trends in Plant Science，8（11）：554-560.

Ashikawa I，Hayashi N，Abe F，Wu J，Matsumoto T. 2012. Characterization of the rice blast resistance gene Pik cloned from Kanto 51[J]. Molecular Breeding，30（1）：485-494.

Ashikawa I，Hayashi N，Yamane H，Kanamori H，Wu J，Matsumoto T，Ono K，Yano M. 2008. Two adjacent nucleotide-binding site-leucine-rich repeat class genes are required to confer Pikm-specific rice blast resistance[J]. Genetics，180（4）：2267-2276.

Bryan G T，Wu K S，F(xiàn)arrall L，Jia Y L，Hershey H P，Mc Adams S A，F(xiàn)aulk K N，Donaldson G K，Tarchini R，Valent B. 2000. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta[J]. The Plant Cell Online，12（11）：2033-2046.

Chen J，Shi Y F，Liu W Z，Chai R Y，F(xiàn)u Y P，Zhuang J Y，Wu J L. 2011. A Pid3 allele from rice cultivar Gumei2 confers resistance to Magnaporthe oryzae[J]. Journal of Genetics and Genomics，38（5）：209-216.

Chen X，Shang J，Chen D，Lei C，Zou Y，Zhai W，Liu G，Xu J，Ling Z，Cao G，Ma B，Wang Y，Zhao X，Li S，Zhu L. 2006. A B-lectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance[J]. The Plant Journal，46（5）：794-804.

Das A，Soubam D，Singh P K，Thakur S，Singh N K，Sharma T R. 2012. A novel blast resistance gene，Pi54rh cloned from wild species of rice，Oryza rhizomatis confers broad spectrum resistance to Magnaporthe oryzae[J]. Functio-nal & Integrative Genomics，12（2）：215-228.

Deng Y，Zhai K，Xie Z，Yang D，Zhu X，Liu J，Wang X，Qin P，Yang Y，Zhang G，Li Q，Zhang J，Wu S，Milazzo J，Mao B，Wang E，Xie H，Tharreau D，He Z. 2017. Epigene-tic regulation of antagonistic receptors confers rice blast resistance with yield balance[J]. Science，355（6328）：962-965.

Fjellstrom R，Conaway-Bormans C A，McClung A M，Marchetti M A，Shank A R，Park W D. 2004. Development of DNA markers suitable for marker assisted selection of three Pi genes conferring resistance to multiple Pyricula-ria grisea pathotypes[J]. Crop Science，44（5）：1790-1798.

Fujii K，Saito Y H，Saito K，Sugiura N，Hayashi N，Tsuji T，Izawa T，Iwasaki M. 2000. Identification of a RFLP marker tightly linked to the panicle blast resistance gene，Pb1，in rice[J]. Breeding science，50（3）：183-188.

Fukuoka S，Saka N，Koga H，Ono K，Shimizu T，Ebana K，Hayashi N，Takahashi A，Hirochika H，Okuno K，Yano M. 2009. Loss of function of a proline-containing protein confers durable disease resistance in rice[J]. Science，325（5943）：998-1001.

Hayashi K，Yasuda N，F(xiàn)ujita Y，Koizumi S，Yoshida H. 2010a. Identification of the blast resistance gene Pit in rice cultivars using functional markers[J]. Theoretical and Applied Genetics，121（7）：1357-1367.

Hayashi N，Inoue H，Kato T，F(xiàn)unao T，Shirota M，Shimizu T，Kanamori H，Yamane H，Saito Y H，Matsumoto T，Yano M，Takatsuji H. 2010b. Durable panicle blast-resistance gene Pb1 encodes an atypical CC-NBS-LRR protein and was generated by acquiring a promoter through local genome duplication[J]. The Plant Journal，64（3）：498-510.

Hittalmani S，Parco A，Mew T V，Zeigler R S，Huang N. 2000. Fine mapping and DNA marker-assisted pyrami-ding of the three major genes for blast resistance in rice[J]. Theoretical and Applied Genetics，100（7），1121-1128.

Hua L X，Wu J Z，Chen C X，Wu W H，He X Y，Lin F，Wang L，Ashikawa I，Matsumoto T，Wang L，Pan Q H. 2012. The isolation of Pi1，an allele at the Pik locus which confers broad spectrum resistance to rice blast[J]. Theoretical and Applied Genetics，125（5）：1047-1055.

Jeon J S，Chen D，Yi G H，Wang G L，Ronald P C. 2003. Genetic and physical mapping of Pi5（t），a locus associated with broad-spectrum resistance to rice blast[J]. Molecular Genetics and Genomics，269（2）：280-289.

Jia Y，Wang Z，Singh P. 2002. Development of dominant rice blast Pi-ta resistance gene markers[J]. Crop Science，42（6）：2145-2149.

Khush G S，Jena K K. 2009. Current status and future prospects for research on blast resistance in rice（Oryza sative L.）[J]. Advances in Genetics，Genomics and Control of Rice Blast Disease. doi：10.1007/978-1-4020-9500-9_1.

Koide Y，Kobayashi N，Xu D，F(xiàn)ukuta Y. 2009. Resistance genes and selection DNA markers for blast disease in rice（Oryza sativa L.）[J]. Japan Agricultural Research Quarterly，43（4）：255-280.

Lin F，Chen S，Que Z，Wang L，Liu X，Pan Q. 2007. The blast resistance gene Pi37 encodes a nucleotide binding site-leucine-rich repeat protein and is a member of a resistance gene cluster on rice chromosome 1[J]. Genetics，177（3）：1871-1880.

Liu Y，Liu B，Zhu X，Yang J，Bordeos A，Wang G，Leach J E，Leung H，Liu Y. 2013. Fine-mapping and molecular marker development for Pi56（t），a NBS-LRR gene conferring broad-spectrum resistance to Magnaporthe oryzae in rice[J]. Theoretical and Applied Genetics，126（4）：985-998.

Mackill D J，Bonman J M. 1992. Inheritance of blast resistance in near-isogenic lines of rice[J]. Phytopathology，82（7）：746-749.

Miah G，Rafii M Y，Ismail M R，Peteh A B，Rahim H A，Aafa-liza R，Latif M A. 2013. Blast resistance in rice：a review of conventional breeding to molecular approaches[J]. Molecular Biology Reports，40（3）：2369-2388.

Okuyama Y，Kanzaki H，Abe A，Yoshida K，Tamiru M，Saitoh H，F(xiàn)ujibe T，Matsumura H，Shenton M，Galam D C，Undan J，Ito A，Sone T，Terauchi R. 2011. A multifaceted genomics approach allows the isolation of the rice Pia-blast resistance gene consisting of two adjacent NBS-LRR protein genes[J]. The Plant Journal，66（3）：467-479.

Qu S，Liu G，Zhou B，Bellizzi M，Zeng L，Dai L，Han B，Wang G L. 2006. The broad-spectrum blast resistance gene Pi9 encodes a nucleotide-binding site-leucine-rich repeat protein and is a member of a multi-gene family in rice [J]. Genetics，172（3）：1901-1914.

Ramkumar G，Srinivasarao K，Mohan K M，Sudarshan I，Si-varanjani A K P，Gopalakrishna K，Neeraja C N，Balachandran S M，Sundaram R M，Prasad M S，Rani N S，Rama Prasad A M，Viraktamath B C，Madhav M S，Ramkumar G. 2011. Development and validation of functional marker targeting an InDel in the major rice blast disease resistance gene Pi54（Pikh）[J]. Molecular Bree-ding，27（1）：129-135.

Shang J，Tao Y，Chen X，Zou Y，Lei C，Wang J，Li X，Zhao X，Zhang M，Lu Z，Xu J，Cheng Z，Wan J，Zhu L. 2009. Identification of a new rice blast resistance gene，Pid3，by genomewide comparison of paired nucleotide-binding site–leucine-rich repeat genes and their pseudogene alleles between the two sequenced rice genomes[J]. Gene-tics，182（4）：1303-1311.

Skamnioti P，Gurr S J，2009，Against the grain：safeguarding rice from rice blast disease[J]. Trends in Biotechnology，27（3）：141-150.

Takahashi A，Hayashi N，Miyao A，Hirochika H. 2010. Unique features of the rice blast resistance Pish locus revealed by large scale retrotransposon-tagging[J]. BMC Plant Bio-logy，10：175.

Wang Z X，Yano M，Yamanouchi U，Iwamoto M，Monna L，Hayasaka H，Katayose Y，Sasaki T. 1999. The Pib gene for rice blast resistance belongs to the nucleotide binding and leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes[J]. The Plant Journal，19（1）：55-64.

Xu X，Hayashi N，Wang C T，F(xiàn)ukuoka S，Kawasaki S，Takatsuji H，Jiang C J. 2014. Rice blast resistance gene Pikahei-1（t），a member of a resistance gene cluster on chromosome 4，encodes a nucleotide-binding site and leucine-rich repeat protein[J]. Molecular Breeding，34（2）：691-700.

Yuan B，Zhai C，Wang W J，Zeng X S，Xu X K，Hu H Q，Lin F，Wang L，Pan Q H. 2011. The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NBS-LRR genes[J]. Theoretical and Applied Genetics，122（5）：1017-1028.

Zhai C，Lin F，Dong Z Q，He X Y，Yuan B，Zeng X S，Wang L，Pan Q H. 2011. The isolation and characterization of Pik，a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication[J]. New Phytologist，189（1）：321-334.

Zhou B，Qu S，Liu G F，Dolan M，Sakai H，Lu G D，Bellizzi M，Wang G L. 2006. The eight amino-acid differences within three leucine-rich repeats between Pi2 and Piz-t resistance proteins determine the resistance specificity to Magnaporthe grisea[J]. Molecular Plant Microbe Interactions，19（11）：1216-1228.

（責任編輯 陳 燕）