唐麗華　黃嬋　陳教云　楊麗濤　邢永秀　農(nóng)友業(yè)　李楊瑞

摘要：【目的】研究低溫脅迫對轉(zhuǎn)α-微管蛋白（TUA）基因甘蔗生理生化特性的影響，對甘蔗TUA基因（SoTUA）進(jìn)行功能鑒定，為甘蔗抗寒品種選育提供參考依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^對pCAMBIA3300載體上的標(biāo)記基因GFP進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序，鑒定轉(zhuǎn)SoTUA基因陽性甘蔗品系。從中選擇4個轉(zhuǎn)基因品系（L1、L2、L3和L4），以野生型ROC22植株為對照（CK），對各處理進(jìn)行低溫（4 ℃）脅迫處理，在脅迫第0、4、7和12 d時分別測定不同處理甘蔗的生理生化指標(biāo)。【結(jié)果】運用PCR篩選得到轉(zhuǎn)SoTUA基因T1代甘蔗植株，對其中4個品系及CK的低溫脅迫試驗結(jié)果表明，在低溫下各品系可溶性糖含量以不同模式變化，轉(zhuǎn)基因各品系普遍高于CK;各品系中的可溶性蛋白在冷馴化前期強(qiáng)烈誘導(dǎo)，總體變化趨勢為先升高后降低，轉(zhuǎn)基因各品系普遍高于CK;各品系中丙二醛（MDA）含量增加，其中CK的增幅最大;過氧化物酶（POD）活性下降，除L2外，POD活性變化總體上呈先升高后降低的變化趨勢;脯氨酸含量在低溫脅迫過程中的變化趨勢無明顯規(guī)律。利用改進(jìn)的極點排序法對各品系抗寒性進(jìn)行評價，可知各品系抗寒性強(qiáng)弱排序為：L3>L1>L2>L4>CK。【結(jié)論】低溫脅迫下4個轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗品系在生理生化指標(biāo)上的表現(xiàn)均優(yōu)于CK，即SoTUA基因在甘蔗體內(nèi)的過量表達(dá)有利于甘蔗抗寒性能的提高。

關(guān)鍵詞： 甘蔗;SoTUA基因;生理生化;抗寒性

中圖分類號： S566.101 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）05-0950-07

Abstract：【Objective】This study was conducted to investigate the effects of low temperature stress on physiological and biochemical characteristics of α-tubulin（TUA） transgenic sugarcane，and to identify the function of sugarcane TUA gene（SoTUA）. It provided reference for sugarcane cold-resistant variety breeding. 【Method】SoTU Atransgenic sugarcane lines were identified by PCR amplification and sequencing of GFP marker gene on vector pCAMBIA3300. Four transge-nic lines（L1，L2，L3 and L4） were chosen for a low temperature（4 ℃）stress assay when the wild type of sugarcane variety ROC22 was used as control（CK）. The changes of physiological and biochemical indexes were measured at 0，4，7，12 d after treatment. 【Result】The SoTUA transgenic T1 sugarcane plants were screened by PCR， and the results of low temperature stress assay on four lines and the control showed that the soluble sugar content of each line varied in different patterns at low temperature， and the transgenic lines were generally higher than the CK. Soluble protein of all lines was strongly induced in the early stage of cold treatment， the overall change trend was first increased and then decreased， and the transgenic lines were generally higher than the CK. Malonaldehyde（MDA） content in each line increased， especially in the control. Peroxidase（POD） activity decreased， except for L2， POD activity generally increased and then decreased. The proline content change had no obvious regulations during the low temperature stress. The improved pole ordination me-thod was used for the comprehensive evaluation of cold resistance. The results showed that the cold resistance of all the lines was ranked as L3>L1>L2>L4>CK. 【Conclusion】The physiological and biochemical performances of the four SoTUA transgenic sugarcane lines were better than the CK under low temperature stress. Therefore，it can be concluded that the overexpression of SoTUA gene in sugarcane is conducive to the improvement of cold resistance.

Key words： sugarcane; SoTUA gene; physiology and biochemistry; cold resistance

0 引言

【研究意義】甘蔗是熱帶和亞熱帶作物，屬喜溫、喜光作物（李楊瑞，2010）。寒害不僅影響甘蔗的地理分布，同時降低甘蔗的蔗糖分和產(chǎn)量，是甘蔗產(chǎn)區(qū)的主要氣候災(zāi)害之一（歐釗榮等，2008）。利用傳統(tǒng)育種方法提高作物耐寒性收效甚微（Sanghera et al.，2011），而轉(zhuǎn)基因等分子生物技術(shù)可為提高甘蔗抗寒性提供有效方法。微管是細(xì)胞骨架的重要組成成分，在細(xì)胞生長及維持細(xì)胞形態(tài)中發(fā)揮重要作用，此外微管與質(zhì)膜密切相連，被認(rèn)為是信號感知與轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要場所及下游通路的主要靶標(biāo)（Gilroy and Trewavas，2001;Wasteneys and Galway，2003）。已有研究報道了微管對作物抗寒性的直接作用（Pihakaski-Maunsbach and Puhakainen，1995）。α-微管蛋白（TUA）是微管的主要成分之一（Farajalla and Gulick，2007）。因此，對轉(zhuǎn)TUA基因甘蔗不同品系進(jìn)行低溫脅迫，通過測定其生理生化指標(biāo)的變化而評價各品系的抗寒性，并對甘蔗TUA基因（SoTUA）進(jìn)行功能鑒定，可為甘蔗抗寒品種選育提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在低溫脅迫下，微管在調(diào)節(jié)及傳導(dǎo)信號中扮演重要角色，微管瞬時解聚可觸發(fā)植物冷馴化，增強(qiáng)植物抗寒性（Abdrakhamanova et al.，2003）。Kerr和Carter（1990）研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下，微管穩(wěn)定劑處理可使黑麥抗寒性降低，說明微管瞬時解聚有利于增強(qiáng)植株抗寒性。Abdrakhamanova等（2003）選取3種不同抗寒性的小麥品種進(jìn)行低溫脅迫，發(fā)現(xiàn)在抗性品種中微管發(fā)生瞬時快速解聚并形成冷穩(wěn)定性微管;敏感性品種未觀察到微管瞬時解聚，當(dāng)使用除草劑脈沖處理使微管解聚后，則可誘導(dǎo)抗寒性。Farajalla和Gulick（2007）在小麥中鑒定出15個TUA家族基因，且發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)量在低溫下以不同的模式變化。張云（2015）在華南忍冬中克隆得到TUA3基因，將其轉(zhuǎn)入擬南芥中，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)TUA3擬南芥在高鈣脅迫下可維持較高的細(xì)胞質(zhì)濃度?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期從甘蔗品種GT28葉片中克隆得到SoTUA基因，基因全長1558 bp，編碼450個氨基酸，其編碼蛋白分子質(zhì)量為49.6 kD，理論等電點為4.8（張保青，2013）;并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將SoTUA基因轉(zhuǎn)入甘蔗品種ROC22中，通過PCR檢測獲得轉(zhuǎn)SoTUA基因陽性T0代植株（孫波，2016）。對于已獲得的轉(zhuǎn)SoTUA基因陽性甘蔗植株，其后代在抗寒方面的功能還有待進(jìn)一步驗證。【擬解決的關(guān)鍵問題】對已獲得的轉(zhuǎn)SoTUA基因陽性甘蔗植株后代進(jìn)行低溫脅迫，測定轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗品系的生理生化指標(biāo)變化，對轉(zhuǎn)SoTUA基因進(jìn)行功能驗證，為SoTUA基因功能研究及甘蔗抗寒品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗材料為本課題組獲得的T1代轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗中的4個品系（L1、 L2、L3和L4），對照為野生型ROC22植株（CK）。

1. 2 試驗方法

試驗于2017年8月在廣西大學(xué)甘蔗研究所溫室大棚內(nèi)進(jìn)行。甘蔗長至8葉時，選取長勢一致的植株，轉(zhuǎn)入人工氣候培養(yǎng)室進(jìn)行4 ℃低溫處理，光強(qiáng)為200～300 μmol/m2·s，光周期為12 h，相對濕度為60%～70%。低溫處理時長為12 d，每個品系每處理重復(fù)4次，分別在0、4、7和12 d采集植株+1葉，經(jīng)液氮冷凍后，保存于-80 ℃冰箱中以備檢測，采樣時間為早上8：00—9：00。低溫脅迫天數(shù)結(jié)合甘蔗植株外部形態(tài)變化進(jìn)行設(shè)計，在低溫脅迫4和7 d時，觀察到對照組甘蔗植株葉片發(fā)生不同程度的卷曲，其比例分別為50%和75%（發(fā)生卷曲株數(shù)/總株數(shù)），在12 d時觀察到葉脈發(fā)生水漬化。

1. 3 轉(zhuǎn)基因甘蔗鑒定

1. 3. 1 轉(zhuǎn)基因甘蔗DNA提取 在甘蔗移栽存活后，采集植株+1葉，去掉葉脈，采用改進(jìn)的SDS方法提取葉片DNA（邵敏，2015）。

1. 3. 2 PCR檢測 根據(jù)pCAMBIA3300載體上的標(biāo)記基因GFP設(shè)計1對引物，引物序列為GFPF（5'-GATGGCCCTGTCCTTTTACCA-3'）和GFPR（5'-TT TTCGTTGGGATCTTTCGAA-3'），擴(kuò)增產(chǎn)物長度為700 bp。以提取的轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片DNA為模板，進(jìn)行PCR檢測。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：2×Taq MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，RNase-Free H2O 8.5 μL。以pCAMBIA3300-SoTUA-GFP重組質(zhì)粒作為陽性對照，甘蔗品種ROC22野生型植株為陰性對照，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。切膠后使用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列比對。

1. 4 測定項目及方法

可溶性糖含量采用硫酸蒽酮法測定（李合生，2000）;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定（李合生，2000）;丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定（高俊鳳，2006）;過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定（郝再彬和蒼晶，2004）;脯氨酸含量采用磺基水楊酸法測定（湯章城，1999）。

1. 5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2007和SPSS 15.0進(jìn)行處理與分析。采用改進(jìn)的極點排序法對各甘蔗品系及對照組進(jìn)行抗寒性評價，其中各指標(biāo)采用低溫脅迫處理12 d時測定值與常溫時測定值的相對值來表示：相對值（%）=（低溫脅迫處理下某指標(biāo)測定值/常溫下某指標(biāo)測定值）[×]100（唐仕云等，2012）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 轉(zhuǎn)基因甘蔗DNA提取結(jié)果

如圖1所示，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶，條帶清晰明亮，說明DNA質(zhì)量較好，可用于下一步檢測。

2. 2 轉(zhuǎn)基因甘蔗PCR檢測結(jié)果

如圖2所示，陽性對照及部分甘蔗樣品在700 bp處出現(xiàn)明亮單一的條帶，出現(xiàn)雙條帶可能是由于引物不特異所致，陰性對照與H2O均無條帶。將700 bp處條帶進(jìn)行切割，使用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物后測序，測序結(jié)果表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為GFP基因，出現(xiàn)條帶的部分甘蔗植株即為轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗植株。

2. 3 低溫脅迫下轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗的生理生化變化

2. 3. 1 可溶性糖含量變化 如圖3所示，隨著低溫脅迫時間的推進(jìn)，L1和L2品系的可溶性糖含量在低溫脅迫第12 d內(nèi)略有降低;L3品系的可溶性糖含量呈雙峰變化趨勢，在第12 d時達(dá)最高值;L4品系的可溶性糖含量呈緩慢降低趨勢;CK的可溶性糖含量在第4～7 d時激降，第7 d達(dá)最低值。在低溫脅迫第7和12 d時，L1、L3和L4品系的可溶性糖含量分別較CK高39.9%、45.5%、54.8%和26.1%、50.6%、30.4%，均達(dá)顯著差異水平（P<0.05，下同）。

2. 3. 2 可溶性蛋白含量變化 如圖4所示，4個轉(zhuǎn)基因品系與CK甘蔗葉片的可溶性蛋白含量總體變化趨勢一致，表現(xiàn)為低溫處理4 d內(nèi)緩慢上升或下降，均在第7 d時升至最高值，隨后又有所下降。在0 d時，CK的可溶性蛋白含量顯著高于L1和L4品系;第4 d時，L1、L2和L3品系的可溶性蛋白含量分別比CK高30.7%、32.4%和61.6%;第7和12 d時，L2和L3品系分別比CK高53.0%、64.2%和88.3%、84.8%，差異均達(dá)顯著水平。

2. 3. 3 MDA含量變化 如圖5所示，4個轉(zhuǎn)基因品系與CK甘蔗葉片的MDA含量均呈先降低后升高再降低的變化趨勢，均在第7 d時達(dá)最高值。低溫脅迫7～12 d，除L2品系外，其余3個轉(zhuǎn)基因品系葉片的MDA含量均低于CK，且L4品系在第7和12 d時比CK低23.3%和36.3%，差異達(dá)顯著水平;L1、L2和L3與CK差異不顯著（P>0.05，下同）。

2. 3. 4 POD活性變化 如圖6所示，L1和L3品系與CK甘蔗葉片中POD活性呈先升高后降低的變化趨勢，L2和L4品系的POD活性則整體呈降低趨勢。在低溫脅迫過程中，L1、L3和L4品系的POD活性與CK無顯著差異，而L2品系的POD活性在第0和12 d時分別比CK高86.8%和68.4%，差異達(dá)顯著水平。

2. 3. 5 脯氨酸含量變化 如圖7所示，4個轉(zhuǎn)基因品系與CK葉片的脯氨酸含量在低溫脅迫過程中的變化趨勢存在差異，但均在脅迫第4 d時較0 d出現(xiàn)降低趨勢，此時各處理間差異不顯著;脅迫至第7 d時，L1、L2和L3品系的脯氨酸含量大幅回升，高于CK，而L4品系和CK的脯氨酸含量仍保持較低水平;脅迫延長至第12 d時，除L3品系的脯氨酸含量有所上升外，其余品系均較第7 d時有所下降。在0 d時L3品系的脯氨酸含量比CK高34.8%，第7 d時L1和L2品系的脯氨酸含量分別比CK高160.3%和182.2%，第12 d時L1和L3品系的脯氨酸含量分別比CK高154.6%和270.8%，差異均達(dá)顯著水平。

2. 4 不同轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗品系的抗寒性評價

植物抗寒性是一種復(fù)雜的遺傳特性，受多種環(huán)境因素的影響，為更全面評估各品系的抗寒性，采用改進(jìn)的極點排序法進(jìn)行評分，結(jié)果如表1和表2所示?？扇苄蕴呛?、可溶性蛋白含量、MDA含量、POD活性和脯氨酸含量的權(quán)重系數(shù)分別為：0.21、0.23、0.06、0.08和0.42。各品系各指標(biāo)的對應(yīng)得分如表1所示，該得分與各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)的乘積詳見表2。綜合得分越高，說明該品系的抗寒性越好。由表2綜合評價值排名可看出，低溫脅迫下各品系抗寒性強(qiáng)弱排序為：L3>L1>L2>L4>CK。

3 討論

甘蔗在經(jīng)歷一段非冰凍低溫后可增強(qiáng)其植株抗凍性，即冷馴化（Selvarajan et al.，2018）。為有效激活冷馴化，植株必須感知低溫并進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。低溫下，抗性品種微管快速瞬時解聚并形成冷穩(wěn)定性微管，其低溫敏感性被認(rèn)為是決定植株抗寒性的因素之一，在信號感知及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用（Wang and Nick，2017）。微管在冷馴化中的作用已有相關(guān)研究報道（Abdrakhamanova et al.，2003;Wang and Nick，2017）。在此基礎(chǔ)上，本研究通過測定轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗在低溫脅迫過程中生理生化指標(biāo)的變化，探究其在提高抗寒性方面的功能，為甘蔗抗寒品種選育提供依據(jù)。

冷馴化過程中，甘蔗體內(nèi)發(fā)生一系列生理生化變化來提高植株抗寒性，以適應(yīng)低溫環(huán)境（Selvarajan et al.，2018）?？扇苄蕴?、可溶性蛋白及脯氨酸等物質(zhì)的合成可使植株免受冰凍損傷。可溶性糖能去除羥自由基，間接誘導(dǎo)蛋白合成;可溶性蛋白是細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì);脯氨酸不僅可降低細(xì)胞的水電位，還可促進(jìn)蛋白的水合作用，從而在細(xì)胞保護(hù)中發(fā)揮一定作用（Liu et al.，2003;Kaplan et al.，2010;Perea-Resa et al.，2017;Selvarajan et al.，2018）。有研究表明，低溫脅迫下可溶性糖合成的相關(guān)基因發(fā)生上調(diào)（Selvarajan et al.，2018;Wang et al.，2018），同時多種蛋白質(zhì)富集，如防御蛋白、保護(hù)蛋白（Kazemi-Shahandashti and Maali-Amiri，2018）。嚴(yán)寒靜和談鋒（2005）研究表明，可溶性糖、可溶性蛋白含量與植物抗寒能力呈正相關(guān);楊德光等（2018）研究表明，在非生物脅迫下，脯氨酸含量在一定程度上反映植物的抗逆性強(qiáng)弱。本研究中，在低溫脅迫下，各轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗品系的可溶性糖和可溶性蛋白含量普遍高于對照，說明轉(zhuǎn)基因甘蔗品系的抗寒性相對較強(qiáng)。各甘蔗品系的可溶性糖含量以不同規(guī)律變化，可能與其對低溫的敏感度及應(yīng)激能力差異有關(guān);可溶性蛋白含量在冷馴化前中期強(qiáng)烈誘導(dǎo)以響應(yīng)低溫，總體變化趨勢為先升高后降低，脯氨酸含量的變化趨勢無明顯規(guī)律，與鄒凱茜等（2018）對低溫脅迫下苦瓜幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化趨勢不完全一致，可能與低溫處理時間及溫度高低等脅迫條件有關(guān)。

在低溫脅迫下，植物體內(nèi)的活性氧（ROS）會產(chǎn)生積累，膜脂是ROS的主要靶物質(zhì)，產(chǎn)生氧化反應(yīng)產(chǎn)物，其中包括MDA，MDA與蛋白結(jié)合使膜蛋白變性，降低膜流動性（Peng et al.，2007;Kazemi-Shahandashti et al.，2013;Wang and Nick，2017）。因此，MDA含量可作為膜脂損傷程度的判斷指標(biāo)。羅明珠等（2005）報道，低溫脅迫后MDA含量的增幅與甘蔗植株抗寒能力呈負(fù)相關(guān)。本研究中，在低溫脅迫第4 d時，各甘蔗品系的MDA含量有所下降，可能是因為MDA與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合，使細(xì)胞膜受到損傷，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生滲透，致使MDA含量降低。但低溫脅迫后各甘蔗品系的MDA含量均有所上升，其中對照的增幅最大，說明對照對低溫相對較敏感，與吳佳溶等（2018）報道的不同品種烤煙在低溫脅迫后MDA含量均增加的結(jié)果一致。

ROS是有毒化合物，對蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)和其他細(xì)胞成分造成氧化損傷，而POD等保護(hù)酶活性增加有利于ROS的清除，減輕植株寒害損傷（Apel and Hirt，2004;Wang et al.，2018）。本研究中，除L2品系外，POD活性總體上呈先升高后下降的變化趨勢，與孫波等（2016）報道的POD活性先升高后下降的變化趨勢一致，活性下降可能是因為在低溫脅迫7 d時，ROS大量累積，而POD不足以將其清除，導(dǎo)致POD活性下降。低溫還誘導(dǎo)了脯氨酸的積累，增幅的大小與植株抗寒性呈正相關(guān)（丁燦等，2006）。

本研究采用極點排序法對甘蔗抗寒性進(jìn)行全面評價，該分析方法目前已運用于披堿草（賈亞雄等，2008）、辣椒（劉雪梅等，2010）、高羊茅（張遠(yuǎn)兵等，2010）和甘蔗（唐仕云等，2012）等作物的抗逆性評價，具有綜合性和可靠性。但本研究僅從生理生化角度鑒定各甘蔗品系抗寒性的強(qiáng)弱，今后還應(yīng)結(jié)合大田表現(xiàn)對各品系進(jìn)行綜合評價。此外，低溫脅迫后植株移至常溫下的恢復(fù)能力也有待進(jìn)一步檢測。

4 結(jié)論

低溫脅迫下4個轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗品系在生理生化指標(biāo)上的表現(xiàn)均優(yōu)于對照，即SoTUA基因在甘蔗體內(nèi)的過量表達(dá)有利于甘蔗抗寒性能的提高。

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（責(zé)任編輯 王 暉）