劉芳 高登慧 歐德淵 萬文華

關(guān)鍵詞：PKRS;組胺;肺臟病毒核酸拷貝數(shù)測定

豬藍(lán)耳?。≒RSS），又稱豬流行性流產(chǎn)呼吸綜合癥，主要表現(xiàn)在仔豬呼吸困難和母豬繁殖障礙兩個(gè)典型癥狀，PRRSV主要侵害豬的呼吸系統(tǒng)，肺臟發(fā)生典型的間質(zhì)性肺炎?，F(xiàn)今，用于檢測PRRSV的方法較多，其中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法能測定病毒含量和區(qū)分因污染引起的假陽性，且較普通PCR方法靈敏度高，具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，操作方法簡便，同時(shí)，也減少了核酸對環(huán)境的污染，適用于樣品的大批量檢測，便于客觀分析各實(shí)驗(yàn)組病毒含量的差異性，減少了由于實(shí)驗(yàn)操作或環(huán)境條件變化等導(dǎo)致的誤差，使HP-PRRS患豬的肺臟病毒含量檢測簡便易行，且敏感度和穩(wěn)定性高。

組胺是機(jī)體不可忽略的炎性因子之一，現(xiàn)已證實(shí)肺臟組胺受體主要是H1R和H2R，組胺能通過H1R和H2R間的相互作用，使肺微血管的通透性增加，導(dǎo)致肺臟微循環(huán)紊亂和病理損傷。本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR法檢測各組仔豬肺部病毒核酸拷貝數(shù)，進(jìn)一步探討兩種組胺受體拮抗劑對HP-PRRS患豬肺炎的影響，為防治該病奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

一、材料

高致病性藍(lán)耳病病毒為貴州分離株GZKB株，由貴州省動(dòng)物疫病研究室惠贈(zèng);熒光定量試劑盒，購自大連寶生物公司;Line-Gene熒光PCR儀（BYQ6009-107B），杭州博日科技有限公司;酶標(biāo)儀（AC100-120），澳大利亞。

二、方法

（一）分組處理

30日齡三元雜交公仔豬20頭購自貴州省貴陽市某養(yǎng)豬場，仔豬均未注射藍(lán)耳病疫苗，體重為8.9～11kg，隨機(jī)分為陰性對照組、陽性對照組、撲爾敏組和西咪替丁組，每組5頭。其中，撲爾敏組、西咪替丁組、陽性組仔豬同一天肌肉注射PRRSV（10CIDso）2mL/頭，并于感染病毒前1天開始，每組每天分別肌肉注射撲爾敏1.5mL/d頭、西咪替丁1.5mL/頭、生理鹽水2mL/頭，陰性對照組仔豬為每日早晚肌肉注射生理鹽水2mL/頭。

（二）樣本處理

頸靜脈放血處死人工感染病毒第10d的各組仔豬，取新鮮肺樣立即放于液氮中，定量稱取肺樣，經(jīng)定量DEPC水研磨，冷凍離心，棄沉淀留上清，用于病毒核酸拷貝數(shù)的測定。

（三）熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

1、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備。用紫外分光光度計(jì)分別檢測貴州省動(dòng)物疫病研究室惠贈(zèng)的PRRSV N基因克隆標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒OD和0D，計(jì)算質(zhì)粒DNA溶液的濃度，同時(shí)，按照10逐級梯度稀釋，梯度濃度，作為已知含量的標(biāo)準(zhǔn)模板，用于優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)中熒光定量PCR的反應(yīng)體系和條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測樣品核酸拷貝數(shù)。

2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化。首先進(jìn)行引物合成。以制備的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行SYBR Green-I實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，優(yōu)化反應(yīng)體系中的引物濃度、退火溫度等條件，最終確定該方法的最佳反應(yīng)體系和條件。PCR反應(yīng)體系為（需在冰上加樣，總量：25μL）：

3、特異性、重復(fù)性檢測及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。待熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化好，以PRRSV N基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，進(jìn)行敏感性、重復(fù)性檢測，以CSF、PPV、JEV、SIV為對照，進(jìn)行特異性檢測，特異性條件成立后建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（四）肺臟病毒核酸拷貝數(shù)測定

肺樣病毒核酸反轉(zhuǎn)錄：與實(shí)驗(yàn)一的反轉(zhuǎn)錄方法相同，取制備好的肺樣上清，以P1、P2為引物，反轉(zhuǎn)錄各肺樣病毒RNA為cDNA。

拷貝數(shù)測定：以cDNA為模板，設(shè)立對照組，采用與建立標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的反應(yīng)條件和體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品PRRSV拷貝數(shù)。

三、結(jié)果

（一）實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

l、PRRSV N基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化。取由貴州省動(dòng)物疫病研究室惠贈(zèng)的含PRRSV N基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化的循環(huán)體系為：95℃預(yù)變性30s;95℃變性5s，5CC退火40s，72℃延伸50s，85℃解鏈引物二聚體10s，40個(gè)循環(huán);最后72℃再延伸10rain，臺階溫度為0.5℃;95℃15s，溶解曲線。

2、PRRSV N基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR重復(fù)性、特異性檢測。選擇標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為1.0x106/μL、1.0x107/μL、1.0x10s/μL、1.0x10/μL為模板，每個(gè)濃度重復(fù)設(shè)5個(gè)樣品，結(jié)果表明，相同濃度的S型擴(kuò)增曲線峰值相似度高，說明N基因引物重復(fù)性好。采用相同方法檢測PRRSV N基因的特異性，除PRRSV N基因能擴(kuò)增出S型曲線外，對照組均未擴(kuò)增出S型曲線，說明本實(shí)驗(yàn)建立的PRRSV N基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR方法具有良好的特異性。

3、PRRSV N基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。將含PRRSV N基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒倍比稀釋，采用每微升含拷貝數(shù)為1.0x10～1.0x10的模板量制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系較好，且相關(guān)系數(shù)為-0.997，試驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差小，結(jié)果見圖1。

（二）仔豬肺臟PRRSV拷貝數(shù)的測定

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法測定肺臟PRRSV拷貝數(shù)，其中陽性組含量最高，撲爾敏組、西咪替丁組顯著低于陽性組（P<0.05），撲爾敏組含量最低，西咪替丁組與撲爾敏組差異不顯著，結(jié)果見表1。

四、討論

（一）關(guān)于PRRSV N基因熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

實(shí)時(shí)熒光定量PCR中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和擴(kuò)增曲線與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)選用了與樣品結(jié)構(gòu)相似的含PRRSV N基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，使樣品擴(kuò)增效率與標(biāo)準(zhǔn)品較為接近，且本實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)值為0.997，較接近1，定量較準(zhǔn)確。實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的擴(kuò)增曲線呈s型，由于反應(yīng)體系中各種物質(zhì)的消耗等原因，擴(kuò)增曲線最終進(jìn)入平臺期，本實(shí)驗(yàn)中各組仔豬肺臟PRRSV N基因的擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期的區(qū)域重復(fù)性較好，且經(jīng)優(yōu)化的PRRSV N基因的熒光定量PCR方法特異性、重復(fù)性、對照性等均成立，表明使用該方法所檢測的結(jié)果較準(zhǔn)確、誤差小。

（二）組胺拮抗劑對HP-PRRS患豬病毒核酸拷貝數(shù)的影響

PRRSV在豬體內(nèi)分布較廣，增殖速度較快，人工感染PRRSV仔豬的第2天，能在血液中檢測到PRRSV，在攻毒后第10天左右增殖量最大。采用熒光定量RT-PCR法研究得出，PRRSV分布于豬的多種臟器中，其中，扁桃體、淋巴結(jié)、心臟、腎臟中含量較高，肝、脾臟、肺次之，腦組織中也能檢測到病毒;人工感染PRRSV在體內(nèi)的分布量與檢測時(shí)間、攻毒量、豬體抵抗力等相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)檢測人工感染PRRSV第10天仔豬肺臟病毒核酸拷貝數(shù)，陽性組肺臟PRRSV核酸拷貝數(shù)范圍與孟韓冰（2009）、方桂友（2009）等的檢測結(jié)果較相似，但實(shí)驗(yàn)組中的撲爾敏組、西咪替丁組顯著較低。

組胺通過與相應(yīng)的受體結(jié)合，介導(dǎo)不同的病理生理作用。血管組胺受體主要為H1R和H2R，肺臟組胺受體主要也是H1R和H2R，而組胺H1R具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用。本實(shí)驗(yàn)每日注射組胺H1R和H2R拮抗劑撲爾敏和西咪替丁后，發(fā)現(xiàn)陽性組仔豬肺臟病毒含量較實(shí)驗(yàn)組顯著最高，撲爾敏組含量最低，且撲爾敏組肺臟損傷最輕，病理學(xué)評分均較西咪替丁、陽性組低，說明組胺H1R受體拮抗劑能拮抗炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，減輕肺臟損傷，緩解仔豬病情，可能具有抗病毒能力。