李志奇 陳海霞

摘 要：【目的】鋁脅迫是酸性土壤中限制植物生長的重要元素，八仙花是一種富集鋁的園林觀賞植物;本研究對八仙花NRAT1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析及表達(dá)分析，以期揭示NRAT1基因在耐鋁生理中的作用。【方法】以八仙花品種Hydrangea macrophyllacv laybla為材料，提取RNA進(jìn)行RT-PCR，檢測實時表達(dá)情況，克隆NRAT1基因全長并進(jìn)行生物信息學(xué)分析?！窘Y(jié)果】試驗克隆得到了巨噬基因家族的NRAT1基因全長，該基因有1個1 881 bp的開放閱讀框，編碼548個氨基酸。多重序列分析表明其具有相當(dāng)高的保守性，該蛋白有12個跨膜結(jié)構(gòu)，預(yù)測位于質(zhì)膜或液泡膜上，預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白是一個疏水性蛋白，試驗還分析得到了蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)。 RT-PCR試驗表明，NRAT1基因在八仙花的根、莖、葉中均有表達(dá)，3個組織中NRAT1基因隨著處理時間的增加表達(dá)量先升后降，在處理2 h表達(dá)量達(dá)到頂峰，之后維持低水平表達(dá)，在12 h之后基因表達(dá)被抑制，在根中的平均表達(dá)量最高且表達(dá)量變化幅度最大?！窘Y(jié)論】NRAT1基因在八仙花感受鋁脅迫時，表達(dá)量立即上調(diào)，NRAT1基因參與了八仙花鋁離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，在八仙花鋁富集作用中扮演了重要角色。

關(guān)鍵詞：八仙花;NRAT1基因;鋁脅迫;表達(dá)分析

中圖分類號：S 682.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1008-0384（2019）06-646-06

Abstract： 【Objective】Bioinformatics and expression of NRAT1 gene of the ornamental Hydrangea macrophylla plants that tend to accumulate aluminum （Al）， a growth-limiting heavy metal in acidic soil， were studied to understand the physiology of the plant on Al-tolerance.【Method】The RNA of H. medalensis cv. Laybla was extracted for RT-PCR to detect the real-time expression and cloned for bioinformatic analysis to determine the molecular structure of NRAT1. 【Result】 The cloned macrophage gene obtained in the lab revealed that the gene had a 1 881 bp open reading frame and encoded 548 amino acids. A multiple sequence analysis showed it to be highly conservative with 12 transmembrane structures located on the plasma or vacuole membrane. The secondary and tertiary structures of the hydrophobic protein were obtained. RT-PCR indicated that NRAT1 was expressed in the roots， stems and leaves of H. macrophylla， and the expressions increased initially to peak in 2h followed by a decline with time to a levered low level. After 12h under Al-stress， the expression was completely inhibited. Among the three issues， the roots had the highest expression and were affected the most by the stress. 【Conclusion】 The NRAT1 gene expression was up-regulated in Hydrangea macrophylla immediately upon the exposure to Al. The gene was positively confirmed to participate in the absorption and transport of Al ions playing an important role in the heavy metal accumulation in the plants.

Key words： Hydrangea macrophylla; NRAT1 gene; Aluminum stress; expression analysis

0 引言

【研究意義】鋁是地殼中分布最廣、含量最多的金屬元素，在酸性土壤中鋁脅迫是限制植物生長及作物產(chǎn)量的一個重要因子。我國酸性土壤約占國土總面積的21%[1]。針對酸性土壤中的鋁脅迫問題，過去多采用石灰對表層土壤進(jìn)行改良，但用量大，且要長期使用，費(fèi)用高，容易導(dǎo)致土壤板結(jié)[2]?，F(xiàn)代社會發(fā)展迅速，隨著酸性氣體排放的增加，酸雨越來越多，酸性土壤的面積也在逐漸擴(kuò)大，因此對植物耐鋁機(jī)制的研究已經(jīng)廣泛開展，對已知的耐鋁植物進(jìn)行開發(fā)，顯得尤為重要。

【前人研究進(jìn)展】八仙花Hydrangea macrophylla又名繡球，是虎耳草科八仙花屬的落葉灌木，花序大且密集，花色豐富，主要分布于中國、日本，近年來在歐洲也常用做庭院植物，常用于鮮切花、園林綠化，是一種重要的觀賞植物。同時八仙花是一種富集鋁的植物，幾個月內(nèi)葉片中的鋁積累量可達(dá)5 mg·g-1[3，14-15]，具有非常重要的科研價值。NRAT1基因?qū)儆贜RAMP基因家族，在鋁脅迫下該基因在八仙花的根和葉中均有上調(diào)表達(dá)[4]。

【本研究切入點(diǎn)】 基于目前對八仙花抗鋁的生命活動及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究尚不成熟，抗性基因在植物抗逆活動中發(fā)揮著重要作用，本研究從NRAT1基因的表達(dá)分析及生物信息學(xué)分析出發(fā)，解析其在調(diào)控抗鋁活動中的功能?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為研究八仙花與抗鋁生命活動密切相關(guān)的NRAT1基因，本試驗以耐鋁品種八仙花Hydrangea macrophyllacv laybla為材料，采用不同濃度的鋁處理，并提取RNA進(jìn)行實時熒光定量PCR，解析鋁脅迫下八仙花NRAT1基因在吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存鋁離子過程中的作用，闡明NRAT1基因的時空特異性表達(dá)與八仙花耐鋁的關(guān)系，以期為園林植物和農(nóng)作物耐鋁遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以取自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉基地溫室苗圃的八仙花品種 Hydrangea macrophylla cv laybla為材料，在晴朗天氣的上午剪取當(dāng)年生的綠色枝條，在溫度為18℃，空氣濕度為60%的條件下以蛭石為基質(zhì)扦插培養(yǎng)。

1.2 提取RNA和cDNA第一鏈的合成

用50 mol·L-1的氯化鋁溶液處理扦插小苗，在不同的時間點(diǎn)（0、2、4、8、12、24 h）取八仙花的根、莖、葉。液氮研磨，采用植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取總RNA，采用微量分光光度計檢測各部位、各時間的RNA濃度和質(zhì)量，置于-80℃冰箱保存。將RNA通過逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒（購于CWBIO康為世紀(jì)生物科技有限公司）獲得cDNA第一鏈，置于-20℃冰箱備用。

1.3 NRAT1基因的克隆

參考八仙花NRAT1基因的cDNA序列，綜合NCBI網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫，設(shè)計特異性引物，以cDNA第一鏈為模板，在BIO-RAD PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，在PCR儀上進(jìn)行如下反應(yīng)：94℃，1 min→98℃，10 s;65℃，15 s;72℃，2 min;30個循環(huán)→72℃，10 min，將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后將PCR產(chǎn)物切膠回收，連接到載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，送交公司測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中下載NRAT1基因相對應(yīng)的其他物種的同源序列;利用ProtParam分析核酸及氨基酸序列的組成成分及理化性質(zhì);利用TMHMM 2.0、Tmpred、ProtScale、SignalP 4.1 和WoLF PSORT分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、親水性/疏水性;利用SOPMA分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu);蛋白磷酸化位點(diǎn)分析采用KinasePhos。利用SWISS-MODEL分析蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。

1.5 實時熒光定量PCR分析

從-80℃冰箱中取出0、2、4、8、12、24 h的根、莖、葉的RNA，使用primer premier 5設(shè)計引物QPCR-F、QPCR-R（表1）按照TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒（購于全式金生物技術(shù)有限公司）的說明書，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，以18S RNA為內(nèi)參基因，用RT-PCR儀（BIO-RAD CFX ConnectTM Optics Module）進(jìn)行實時熒光定量PCR，得到的數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 八仙花RNA的提取

通過微量分光光度計檢測RNA的純度和濃度，測定結(jié)果顯示在260～280 nm波長時，OD值介于1.8～2.0，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，得到圖1，條帶清晰，無拖尾等不良現(xiàn)象。說明提取的RNA完整度良好，可以進(jìn)行下一步試驗。

2.2 NRAT1 cDNA全長序列的克隆和分析

采用在線軟件ProParam分析得到NRAT1基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，本研究NRAT1基因的開放閱讀框長為1 881 bp，編碼548個氨基酸，編碼蛋白的化學(xué)方程式為C2769H4379N689O743S20，分子量為59 851.60 Da;理論等電點(diǎn)為7.13，為堿性氨基酸;分析該基因編碼的氨基酸組成，Leu、Ile、Ala、Gly、Val、Ser含量較多，不含Pyl和Sec;負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）有39個，正電荷殘基（Arg + Lys）有39個;不穩(wěn)定指數(shù)為33.84，表明該蛋白為穩(wěn)定性蛋白;脂肪系數(shù)為124.22，親水性平均值（GRAVY）為0.575。

2.3 NRAT1的同源性比較

通過NCBI Blast程序?qū)Φ鞍仔蛄羞M(jìn)行同源性比對，結(jié)果表明八仙花NRAT1氨基酸序列與栓皮櫟（Quercus suber XP_023908030.1）的同源性最高，達(dá)84%，與芝麻（Sesamum indicum XP_011102329.1）和蘋果（Malus domestica XP_008361001.1）的同源性為83%，與獼猴桃（Actinidia chinensis PSS31888.1）的同源性為82%，與向日葵（Helianthus annuus XP_022038566.1）的同源性為80%，與甜櫻桃（Prunus avium XP_021806639.1）和月季（Rosa chinensis XP_024166371.1）的同源性為79%，與玉米（Zea mays XP_008670085.1）的同源性為74%，與小米（Setaria italica XP_004959136.1）的同源性為73%，與高粱（Sorghum bicolor XP_002459640.1）的同源性為69%，與粳稻（Oryza sativa XP_015647626.1） 的同源性為55%。對上述NRAT1氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對，結(jié)果表明，不同植物NRAT1的結(jié)構(gòu)是高度保守的。

2.4 NRAT1蛋白功能預(yù)測分析

利用TMpred和TMHMM Server v.2.0在線軟件預(yù)測NRAT1氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果（圖2）表明，該基因編碼的蛋白含有12個跨膜結(jié)構(gòu)域，由19或22個疏水氨基酸殘基組成，分別位于48～67位氨基酸、87～109位氨基酸、130～152位氨基酸、156～178位氨基酸、187～209位氨基酸、229～251位氨基酸、272～294位氨基酸、332～354位氨基酸、374～396位氨基酸、400～422位氨基酸、435～457位氨基酸和472～494位氨基酸。通過在線軟件WoLF PSORT對NRAMP1進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白主要定位在質(zhì)膜和液泡。

通過在線軟件KinasePhos分析磷酸化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)八仙花NRAT1編碼蛋白磷酸化位點(diǎn)共有5個，絲氨酸位點(diǎn)數(shù)目有2個，分別位于第305和332位氨基酸處;酪氨酸有3個磷酸化位點(diǎn)，分別位于第34、55和208位氨基酸處。

利用ProtScale在線工具對NRAT1氨基酸序列的親水性和疏水性進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果（圖3）表明，NRAT1蛋白氨基酸殘基中以纈氨酸V193疏水性最強(qiáng) （3.678），以天冬氨酸D41親水性最強(qiáng) （-3.211），存在明顯的疏水區(qū)域，故NRAT1蛋白疏水性較強(qiáng)，為疏水性蛋白。

利用SOPMA預(yù)測方法對NRAT1編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果（圖4）表明，其二級結(jié)構(gòu)中ɑ螺旋（Alpha helix）、無規(guī)則卷曲（Random coil）、延伸鏈結(jié)構(gòu)（Extened strand）以及β轉(zhuǎn)角（Beta turn）分別占51.82%、31.93%、13.50%和2.74%，說明蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要類型是ɑ螺旋和無規(guī)則卷曲，其次是延伸鏈，β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)所占比例最小。

通過Swiss-Model數(shù)據(jù)庫采用同源建模的方法預(yù)測NRAMP蛋白的三級結(jié)構(gòu)，得到圖5，可以看出三級結(jié)構(gòu)主要由ɑ螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈以及β轉(zhuǎn)角等二級結(jié)構(gòu)元件組成，其空間結(jié)構(gòu)高度相似，具有高度保守的結(jié)構(gòu)特征，但在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)存在差異，表明NRAT1蛋白在不同植物中可能具有自己獨(dú)特的功能。

2.5 NRAT1基因的表達(dá)特性分析

以鋁處理后不同時間、不同部位的八仙花RNA為材料，以18S RNA為內(nèi)參基因，用實時熒光定量PCR的辦法檢測NRAT1基因在八仙花的根、莖、葉中的轉(zhuǎn)錄水平（圖6）。熒光定量PCR試驗結(jié)果顯示，NRAT1基因的擴(kuò)增曲線趨勢正常、基線平整、熔解曲線峰值單一，引物特異性較好，未產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。在沒有鋁脅迫的對照組中，NRAT1基因在八仙花的根、莖、葉中均有表達(dá)，其中莖>葉>根。NRAT1基因隨著處理時間的增加表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在鋁脅迫2 h后，各部位的表達(dá)量均達(dá)到最大值，隨后逐漸降低，在12 h之后其表達(dá)水平比對照組更低。NRAT1基因在不同組織中的表達(dá)也有較大差異，總平均表達(dá)量根>葉>莖。

3 討論與結(jié)論

天然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白（NRAMP）家族基因最早是在動物組織中被克隆，現(xiàn)在在植物、微生物中均有發(fā)現(xiàn)[5，14]，其作用是在鋁離子進(jìn)入細(xì)胞后，將鋁離子轉(zhuǎn)運(yùn)、儲存在植物的液泡中或其他亞細(xì)胞隔室內(nèi)，進(jìn)而降低因高濃度的金屬離子對細(xì)胞壁產(chǎn)生的毒害作用，在金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控和維持金屬離子平衡中發(fā)揮重要作用。Xia等[6，12-13，20]在水稻中發(fā)現(xiàn)一個鋁抗性相關(guān)的 NRAMP 家族基因NRAT1，敲除NRAT1基因會減弱水稻鋁離子的吸收，增加鋁離子與細(xì)胞壁的結(jié)合進(jìn)而增加水稻的鋁敏感性。預(yù)測其是位于根尖細(xì)胞的質(zhì)膜上的鋁離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

本研究結(jié)果表明，NRAT1基因翻譯的蛋白質(zhì)具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，而且有多達(dá)12個的跨膜結(jié)構(gòu)域，預(yù)測其位置是位于八仙花細(xì)胞膜或液泡膜上，楊猛等[7]在對水稻中的OsNRAMP5基因研究預(yù)測也是位于液泡膜上，OsNRAMP5基因在水稻中廣泛分布且參與了Mn離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，對該基因進(jìn)行基因沉默后，水稻長勢嚴(yán)重受阻。尹華等[8]及肖海華等[9]在衣藻和山荊子中的研究表明NRAMP1基因參與了金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)，并且結(jié)果得出該基因具有高度保守性，本試驗的同源性分析葉表明各物種之間的NRAT1基因具有相當(dāng)高的同源性，因此預(yù)測NRAT1基因是一個高度保守的基因。

本研究中八仙花NRAT1基因在植物的根、莖、葉中均有表達(dá)，其中根部表達(dá)量最多且變化幅度最大，與莖和葉相比有顯著性差異，由此推斷八仙花可能是從根部感受鋁脅迫，根部鋁脅迫最為嚴(yán)重，因此產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)之后，NRAT1基因在根中表達(dá)較多，焦芳嬋等[10]對煙草中NtNramp1-1基因的研究表明，與擬南芥[14，17]、棉花[19]、大豆[21]等克隆的 Nramp-1 基因具有較高的序列相似性，同時在根中NtNramp1-1基因有高水平的表達(dá)。劉曉敏等[11，18]在蒲公英中TaNRAMP基因的研究得出TaNRAMP基因參與了Cd離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，其表達(dá)量在2 h時表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后迅速降低，維持低水平的表達(dá)，本試驗中八仙花應(yīng)激機(jī)制反應(yīng)迅速，表達(dá)量在2 h的時候達(dá)到最大值，在鋁處理12 h之后，NRAT1基因表達(dá)受到抑制，表達(dá)量相較蒸餾水處理的對照組更少，推測長時間的鋁毒害會破壞八仙花的生理結(jié)構(gòu)，阻礙NRAT1基因的正常表達(dá)。

八仙花在感受鋁脅迫時，會采用許多內(nèi)部或外部的反應(yīng)機(jī)制應(yīng)激，從而產(chǎn)生一系列的生理活動， NRAT1基因在八仙花感受鋁脅迫時，表達(dá)量立即上調(diào)，參與鋁離子的消化、轉(zhuǎn)運(yùn)等生理活動，本研究闡明在八仙花富集鋁中NRAT1基因的作用，以期為園林植物抗鋁性的遺傳改良提供重要的理論基礎(chǔ)，為鋁污染的土壤改善綠化提供技術(shù)支持。

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（責(zé)任編輯：林海清）