李玉平 龔寧

摘 要：【目的】優(yōu)化組合培養(yǎng)基中大量、微量元素及附加激素等培養(yǎng)條件，篩選出大花金挖耳細胞培養(yǎng)黃酮的生產(chǎn)培養(yǎng)基?！痉椒ā恳訬T+1.0 mg·L-1 NAA + 0.2 mg·L-1 6-BA為基本培養(yǎng)基，先優(yōu)化組合其大量元素NH+4、NO-3、K+，再優(yōu)化組合微量元素MoO2-4、Zn2+、BO3-3、Co2+、Cu2+、I-、Mn2+，最后分別附加2，4-D、KT、GA3，測定大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細胞生長、黃酮含量及產(chǎn)量?！窘Y(jié)果】大量元素優(yōu)化、微量元素優(yōu)化及附加激素KT、GA3，大花金挖耳細胞培養(yǎng)物中黃酮產(chǎn)量均得到了顯著提升（P<0.05），添加2，4-D降低了黃酮產(chǎn)量。本研究篩選得到大花金挖耳細胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類化合物的最佳NT培養(yǎng)基為：大量元素NH+4、NO-3、K+分別為15.46? mmol·L-1、14.10? mmol·L-1、19.10? mmol·L-1，微量元素MoO2-4、Zn2+、BO3-3、Co2+、Cu2+ 、I-、Mn2+分別為3.0 μmol·L-1、0.06 mmol·L-1、0.4 mmol·L-1、0.2 μmol·L-1、0.4 μmol·L-1、10 μmol·L-1、0.2 mmol·L-1，附加KT 0.2 mg·L-1。在此培養(yǎng)條件下，大花金挖耳細胞培養(yǎng)物中黃酮含量達到2.05%，是基本培養(yǎng)基的1.68倍;黃酮產(chǎn)量為517.87 mg·L-1，是基本培養(yǎng)基的1.80倍?！窘Y(jié)論】在前期研究的基礎(chǔ)上，通過培養(yǎng)基主成分優(yōu)化，提高了大花金挖耳細胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮的產(chǎn)量，初步得到了黃酮生產(chǎn)培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞： 大量元素;微量元素;植物激素;黃酮;大花金挖耳

中圖分類號：Q 813.1文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）06-652-08

Abstract： 【Objective】 Formulation of the medium for Carpesium macrocephalum culture to produce flavonoids was optimized from the one obtained by a previous study.【Method】 Using NT+NAA 1.0 mg·L-1+0.2 mg·L-1? 6-BA as the base， the medium optimizations were firstly carried out on the macro-elements， NH+4， NO-3 and K+， then the micro-elements， MoO2-4， Zn2+， BO3-3， Co2+， Cu2+， I-， and Mn2+ and followed by the added 2，4-D， KT and GA3. The cellular growth as well as the flavonoids yield in the culture suspension were monitored for evaluation. 【Result】 With the optimized addition of the macro- and micro-elements plus KT or GA3， the flavonoids produced by C. macrocephalum culture significantly increased （P<0.05）， but reduced by the presence of 2，4-D. The finalized medium consisted of the base with added 15.46?? NH+4 mmol·L-1，? NO-3 14.10 mmol·L-1， K+ 19.10 mmol·L-1， MoO2-4 3.0 μmol·L-1，? Zn2+ 0.06 mmol·L-1，? BO3-3 0.4 mmol·L-1， Co2+ 0.2 μmol·L-1， Cu2+ 0.4 μmol·L-1， I- 10 μmol·L-1， Mn2+ 0.2 mmol·L-1， and?? KT 0.2 mg·L-1. The resulting flavonoids content in the culture suspension was 2.05%， which was 1.68-fold of control， and the flavonoids yield 517.87 mg·L-1， which was 1.80-fold of control. 【Conclusion】 By further modifying the previously obtained medium， the flavonoids produced from the C. macrocephalum culture significantly increased.

Key words：macroelements; microelements; phytohormone; flavonoids; Carpesium macrocephalum

0 引言

【研究意義】大花金挖耳Carpesium macrocephalum Franch.et Sav.系菊科天名精屬多年生草本植物，具有抗腫瘤、止血等醫(yī)用價值[1-2]和殺菌、殺蟲及除草等農(nóng)藥活性[3-5]。黃酮類化合物是其主要活性成分之一[6-7]，具有抗菌、抗病毒、抗癌等藥用價值和病蟲害防御、化感等植保作用[8-9]，具有極大的開發(fā)價值。【前人研究進展】利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類化合物是解決大花金挖耳野生植物資源短缺和黃酮類化合物人工合成困難等問題的有效手段[10-11]。培養(yǎng)基種類、大量元素、微量元素、植物激素、誘導(dǎo)子、細胞系、光照、pH等因素都會對植物細胞生物合成黃酮類化合物產(chǎn)生影響[12]。郭佳祺[13]通過優(yōu)化接種量、培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)速、pH值、無機鹽濃度、光照周期等培養(yǎng)條件，提高了蒺藜細胞生物合成黃酮的能力;趙德修等[14]開展了溫度、光照、激素、碳源等不同理化因子對雪蓮培養(yǎng)細胞生物合成黃酮的研究;陳紅賢等[15]研究發(fā)現(xiàn)碳源、氮源、磷源等大量元素的消耗與國槐槐角種胚細胞生長和黃酮的積累密切相關(guān)，黃酮的積累和細胞生長屬于部分生長偶聯(lián)型。李玉平等[11，16-17]研究了大花金挖耳愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖，建立了細胞懸浮系，并初步開展了培養(yǎng)基、大量元素、微量元素等理化因素對大花金挖耳細胞培養(yǎng)黃酮類化合物的研究?！颈狙芯壳腥朦c】在前期研究中，采取單因素試驗已篩選出了對大花金挖耳細胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類化合物有顯著影響的大量元素[17]和微量元素[18]中各元素的最適濃度，亟待進一步優(yōu)化組合相關(guān)理化因子及培養(yǎng)條件，提高大花金挖耳培養(yǎng)細胞的黃酮產(chǎn)量?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究遴選對大花金挖耳培養(yǎng)細胞生長和黃酮含量增加有貢獻的硝酸鉀（KNO3）、硝酸銨（NH4NO3）、鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）、硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）、硫酸銅（CuSO4·5H2O）硼酸（H3BO3）等大量、微量元素化合物進行組合優(yōu)化，并分別附加激素2，4-D、KT、GA3，旨在篩選黃酮生產(chǎn)培養(yǎng)基，提高細胞黃酮產(chǎn)量，為大花金挖耳工廠化細胞培養(yǎng)黃酮類化合物提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞懸浮系

大花金挖耳細胞懸浮系由西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心篩選獲得[16]，繼代培養(yǎng)于基本培養(yǎng)基NT0（NT+1.0 mg·L-1 NAA + 0.2 mg·L-1 6-BA+40 g·L-1蔗糖）。繼代培養(yǎng)時間為7～10 d（細胞生長的對數(shù)期），培養(yǎng)條件：pH 5.8、搖床120 r·min-1、（25±2）℃，光照強度1 500～2 000 lx、光照12 h·d-1，下同。

1.1.2 儀器和試劑

主要儀器：EBP-190S電子天平（Sartorius公司）;S-315Tomy High-pressure steam sterilizer（Tomy KOGYO CO.LTD.Nerima Tokyo.Japan）;UV1102紫外/可見分光光度計（上海天美科學(xué)儀器有限公司）;PHS-25型酸度計（上海雷磁儀器廠）; ZRD-5030全自動鼓風(fēng)干燥箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）; HZT2雙層振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）。

主要試劑：蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所）;萘乙酸（NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、二氯苯氧乙酸（2，4-D）、芐氨基腺嘌呤（KT）、赤霉酸（GA3）（美國Sigma 公司）;培養(yǎng)基中添加的蔗糖、肌醇及NT[19]培養(yǎng)基中添加的各種化合物均為分析純;丙酮為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 懸浮培養(yǎng)細胞生長及黃酮累積的優(yōu)化試驗

將基本培養(yǎng)基（NT0）中培養(yǎng)7～10 d的細胞接種40 g·L-1鮮重于試驗所設(shè)計的培養(yǎng)基中，試驗均采用250 mL三角瓶，每瓶100 mL液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件同上?？疾齑罅俊⑽⒘吭貎?yōu)化及附加激素2，4-D、KT、GA3對懸浮培養(yǎng)細胞生長及黃酮累積的影響。

向培養(yǎng)基NT0中添加KNO3和NH4NO3，對大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細胞生長和黃酮含量增加有顯著影響的大量元素NH+4、NO-3、K+進行優(yōu)化組合（表1），其他大量元素為NT培養(yǎng)基固有濃度[19]，以NT0為對照（CK），考察大量元素優(yōu)化組合對大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細胞生長和黃酮合成的影響，并得到生產(chǎn)培養(yǎng)基NT1; 在大量元素優(yōu)化組合的基礎(chǔ)上，選取前期試驗中對大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細胞生長和黃酮含量增加最為顯著的MoO2-4、Zn2+兩種微量元素進行優(yōu)化組合（表2），BO3-3、Co2+、Cu2+、I-、Mn2+等微量元素離子濃度依次為：0.4? mmol·L-1 、0.2 μmol·L-1、0.4 μmol·L-1、10 μmol·L-1、0.2? mmol·L-1，以NT1為對照（CK），考察微量元素優(yōu)化組合對大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細胞生長和黃酮合成的影響，并得到生產(chǎn)培養(yǎng)基NT2; 在大量元素和微量元素優(yōu)化組合培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以NT2為對照（CK），再分別添加2，4-D（0、0.1、0.2、0.5、1.0? mg·L-1）、KT（0、0.1、0.2、0.5、1.0? mg·L-1）和GA3（0、0.1、0.2、0.3、0.5? mg·L-1），進一步研究激素對細胞生長和黃酮產(chǎn)量的影響。

1.2.2 生物量的測定

將上述不同試驗處理培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)20 d左右的褐化細胞進行真空抽濾，所得細胞60℃烘干，細胞干重DW（g·L-1）為培養(yǎng)細胞的生長指標。細胞凈生長量=收獲時細胞干重-接種時細胞干重。

1.2.3 黃酮含量的測定和產(chǎn)量的計算

總黃酮含量測定參考文獻[18]。以蘆丁為標品，確定檢測波長為510 nm，以蘆丁質(zhì)量濃度L（mg·mL-1）對吸光值A(chǔ)進行線性回歸，得方程L=0.0768 A-0.0004（r=0.999 7）。將上述各試驗處理中懸浮培養(yǎng)20 d的細胞抽濾、烘干、粉碎，以丙酮為溶劑，取適量過60目篩的粉碎細胞干粉，振蕩提取3次，每次24 h，合并提取液，濃縮后用30%乙醇定容至0.50 g·mL-1，取適量供試液，測定總黃酮含量（X%），X% = V×Y/N×M×10-1，V為提取液體積（mL），Y為供試液總黃酮質(zhì)量濃度（mg·mL-1），N為細胞質(zhì)量（g），M為稀釋倍數(shù)?？傸S酮產(chǎn)量（mg·L-1） =黃酮含量（%）×細胞生長量（g·L-1）×1000。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上試驗重復(fù)3次，采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行Duncan分析（P=0.05）。2 結(jié)果與分析

2.1 大量元素優(yōu)化組合對懸浮培養(yǎng)細胞的生長和黃酮累積的影響

如圖1所示，大量元素優(yōu)化組合后的培養(yǎng)基對大花金挖耳培養(yǎng)細胞的生長和黃酮化合物的累積均有顯著的影響。從細胞生長量上看，處理Ⅱ和Ⅲ顯著高于對照，處理Ⅳ、Ⅴ顯著低于對照（P<0.05），以處理Ⅲ（15.46 mmol ·L-1NH+4+ 18.79 mmol ·L-1NO-3 +23.79 mmol ·L-1K+ ）所得細胞凈干重最高，為22.70 g·L-1，是對照的1.05倍;NT1中懸浮培養(yǎng)的細胞呈黃色，明顯深于NT0（圖2）。從黃酮含量和黃酮產(chǎn)量上看，所有處理均高于對照，其中處理Ⅱ和處理Ⅲ的黃酮含量和產(chǎn)量均顯著高于對照（P<0.05），黃酮含量是對照的1.20～1.21倍，黃酮產(chǎn)量是對照的1.26倍;處理Ⅱ（NH+4 15.46 mmol·L-+ NO-3 14.10? mmol·L-1+K+ 19.10? mmol·L-1）所得黃酮含量最高，為1.48%（P<0.05），產(chǎn)量也最高，為363.95 mg·L-1。因此，以處理Ⅱ試驗組為大量元素優(yōu)化組合提高培養(yǎng)細胞生物合成黃酮類化合物的最適培養(yǎng)基NT1。

2.2 微量元素優(yōu)化組合對懸浮培養(yǎng)細胞的生長和黃酮累積的影響

如圖3所示，在優(yōu)化大量元素培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，研究發(fā)現(xiàn)微量元素優(yōu)化組合后的培養(yǎng)基對大花金挖耳培養(yǎng)細胞黃酮化合物的累積有顯著的影響。從細胞生長量上看，4個處理均較對照有一定的增高，但差異不顯著;從黃酮含量上看，處理A、B、C顯著高于對照（P<0.05），以處理A最高，達1.89%，是對照的1.55倍;從黃酮產(chǎn)量上看，所有處理均高于對照，處理A、B差異顯著（P<0.05），以處理A（3.0 μmol·L-1 MoO2-4+ 0.06 mmol·L-1 Zn2+ +0.4 mmol·L-1 BO3-3+ 0.2 μmol·L-1 Co2+ + 0.4 μmol·L-1 Cu2+ + 10 μmol·L-1 I-+ 0.2 mmol·L-1Mn2+ ）最高（P<0.05），達476.97 mg·L-1，是對照的1.66倍。因此，認為處理A試驗組為微量元素優(yōu)化組合提高培養(yǎng)細胞生物合成黃酮類化合物的最適培養(yǎng)基NT2。

2.3 2，4-D對懸浮培養(yǎng)細胞的生長和黃酮類化合物累積的影響

如圖4所示，2，4-D在0.0～1.0 mg·L-1時，對大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細胞黃酮生物合成有顯著影響。培養(yǎng)基中添加2，4-D降低了培養(yǎng)細胞的干重收獲量和黃酮產(chǎn)量;低濃度2，4-D（0.1 mg·L-1）有助于黃酮生物合成，含量為2.08%，是對照的1.10倍（P<0.05），但此時黃酮產(chǎn)量僅為464.62 mg·L-1，與對照差異不顯著。

2.4 KT對懸浮培養(yǎng)細胞的生長和黃酮類化合物累積的影響

如圖5所示，KT在0.0～1.0 mg·L-1時，對懸浮培養(yǎng)細胞的生長影響顯著，黃酮含量顯著升高，黃酮產(chǎn)量差異不顯著。細胞生長量先增后降，KT質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1時，細胞干重收獲量最大，為25.56 g·L-1。隨培養(yǎng)基中KT濃度的增加，細胞黃酮含量隨之增加，黃酮含量達2.00%～2.07%，是對照的1.06～1.10（P<0.05）;KT在0.1～1.0 mg·L-1時，培養(yǎng)細胞黃酮產(chǎn)量先升后降，但變化不顯著，KT質(zhì)量濃度為0.2 mg·L-1時，黃酮產(chǎn)量最高，達517.87 mg·L-1。

2.5 GA3對懸浮培養(yǎng)細胞的生長和黃酮類化合物累積的影響

如圖6所示，GA3在0.0～0.5 mg·L-1時，對懸浮培養(yǎng)細胞的生長和黃酮生物合成產(chǎn)生了顯著的影響。細胞生長量先增后降，GA3質(zhì)量濃度為0.2 mg·L-1時，細胞干重收獲量最大，為25.29 g·L-1，比對照高了0.12 g·L-1，差異不顯著;低質(zhì)量濃度GA3（0.1 mg·L-1）有助于黃酮生物合成，含量高達2.05%，是對照的1.08倍（P<0.05），隨培養(yǎng)基中GA3質(zhì)量濃度的增加，細胞黃酮含量顯著降低;GA3為0.1 mg·L-1時，黃酮產(chǎn)量最高，達516.06 mg·L-1，是對照1.08倍（P<0.05），繼續(xù)增加GA3質(zhì)量濃度，培養(yǎng)細胞的黃酮產(chǎn)量顯著降低。

3 討論與結(jié)論

植物細胞培養(yǎng)黃酮化合物受培養(yǎng)基組分、激素、物理條件等多方面因素的影響，目前沒有統(tǒng)一的標準條件適于所有的植物細胞培養(yǎng)，這就需要研究者對不同植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮的最佳條件進行研究[12]。培養(yǎng)基組分是植物培養(yǎng)細胞生長和次生代謝物積累中最直接、最重要的影響因素[19]。本文主要圍繞提高大花金挖耳培養(yǎng)細胞黃酮產(chǎn)量的大量、微量元素及激素優(yōu)化組合進行討論分析。

相對于高鹽培養(yǎng)基MS和低鹽培養(yǎng)基White，NT屬于中等無機鹽培養(yǎng)基，其中的N、P、Ca、Mg、K等大量元素對大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細胞生長和黃酮合成均產(chǎn)生了影響。本研究選取前期試驗[17]中對大花金挖耳細胞培養(yǎng)有顯著貢獻的NH+4、NO-3、K等大量元素進行進一步優(yōu)化組合，發(fā)現(xiàn)當NT培養(yǎng)基中NH+4、NO-3、K+濃度依次為15.46、14.10、19.10 mmol·L-1時，顯著提高了黃酮含量和產(chǎn)量，分別為1.48%和363.95 mg·L-1，分別是對照的1.21和1.26倍?？梢?，調(diào)節(jié)NT中總氮濃度或銨態(tài)氮與硝態(tài)氮的比例可顯著促進培養(yǎng)細胞生長和黃酮生物的合成，這與水母雪蓮、銀杏、草莓等植物細胞培養(yǎng)黃酮的研究相似[12]。分析國槐槐角[15]、茶條槭[20]、玫瑰茄[21]細胞培養(yǎng)次生代謝物中氮源消耗的規(guī)律，不難推斷，氮源消耗的前期主要用于細胞蛋白質(zhì)、核酸等結(jié)構(gòu)性組分的合成，后期主要用于各種與次級代謝相關(guān)酶的合成[22];銨態(tài)氮與細胞生長密切相關(guān)，硝態(tài)氮與黃酮、紫杉醇、沒食子酸等次生代謝物的合成相關(guān)[15，20-23];鉀離子在細胞培養(yǎng)過程中發(fā)揮著“離子泵”的作用，對細胞滲透壓及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收具有調(diào)節(jié)作用[24]。

微量元素是植物細胞酶的組成分子或活化劑，具有重要的生理生化作用[18，25-26]。筆者前期系統(tǒng)研究了NT培養(yǎng)基中MoO2-4、Zn2+、BO3-3、Co2+、Cu2+、I-、Mn2+、Fe2+等8種微量元素單一因素對大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細胞生長和黃酮合成的影響，本研究選取前期試驗中對大花金挖耳細胞培養(yǎng)有顯著貢獻的MoO2-4、Zn2+等微量元素進行進一步的優(yōu)化組合，發(fā)現(xiàn)大量元素優(yōu)化后的NT培養(yǎng)基中MoO2-4、 Zn2+、BO3-3、Co2+、Cu2+ 、I-、Mn2+等微量元素濃度依次為3.0 μmol·L-1、 0.06 mmol·L-1、0.4 mmol·L-1、0.2 μmol·L-1、0.4 μmol·L-1、10 μmol·L-1、0.2 mmol·L-1時，培養(yǎng)細胞的黃酮含量和產(chǎn)量可分別達到1.89%和476.97 mg·L-1，較優(yōu)化大量元素的NT1培養(yǎng)基再次提高了黃酮的含量和產(chǎn)量?？梢?，微量元素含量雖少，但調(diào)節(jié)NT中微量元素濃度及其配比仍可顯著促進細胞生長和黃酮生物的合成，說明微量元素在細胞培養(yǎng)過程中，既獨立發(fā)揮各自生理生化作用，同時又與大量元素及其他微量元素相互作用協(xié)同促進了大花金挖耳懸浮細胞的光合、呼吸、氮代謝等初生代謝，并提升了培養(yǎng)細胞黃酮類等化合物的生物合成能力。

不同種類、不同濃度的植物生長素和細胞分裂素及其配比對植物細胞的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累有著顯著的影響[27]。本研究以NT+1.0 mg·L-1 NAA + 0.2 mg·L-1 6-BA為基本培養(yǎng)基，在大量元素和微量元素優(yōu)化組合的基礎(chǔ)上，再分別添加2，4-D、KT和GA3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度2，4-D（0.1 mg·L-1）有助于黃酮生物合成，2，4-D抑制黃酮的生物合成，添加2，4-D抑制了細胞的生長，總體降低了黃酮的產(chǎn)量，這與2，4-D在許多植物細胞培養(yǎng)中抑制次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生的研究結(jié)論相一致[27]。另外，低質(zhì)量濃度KT（0.1 mg·L-1）有助于細胞的生長，高質(zhì)量濃度（>0.1 mg·L-1）抑制了細胞的生長，附加KT（0.1～1.0 mg·L-1）黃酮含量增加顯著，0.2 mg·L-1 KT時，黃酮產(chǎn)量最高達517.87 mg·L-1，是對照1.09倍，可見附加不同濃度KT對細胞生長和黃酮合成效果不同，這與KT在紅花細胞生長及紅花色素合成中發(fā)揮的作用相似[28]。低濃度GA3促進了細胞生長和黃酮的生物合成，高濃度GA3抑制了細胞黃酮的合成，這可能與GA3抑制查爾酮合成酶有關(guān)[29-30]。

總之，在前期研究的基礎(chǔ)上，通過NT培養(yǎng)基中大量元素、微量元素逐步優(yōu)化及添加激素等試驗手段，大花金挖耳懸浮培養(yǎng)細胞黃酮含量和產(chǎn)量顯著高于對照，影響順序為：大量、微量元素優(yōu)化，并附加KT的NT培養(yǎng)基>大量、微量元素優(yōu)化的NT培養(yǎng)基>大量元素優(yōu)化的NT培養(yǎng)基，黃酮含量大小依次是：2.05%、1.89%、1.48%，黃酮產(chǎn)量大小依次為：517.87、476.97、363.95 mg·L-1。本研究系統(tǒng)優(yōu)化了NT培養(yǎng)基中對大花金挖耳細胞培養(yǎng)有促進作用的相關(guān)因子，初步篩選得到了黃酮生產(chǎn)培養(yǎng)基，為實現(xiàn)大花金挖耳細胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)黃酮提供了試驗依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：張 梅）