王卓+徐碧玉+賈彩紅+李健平

摘 要 抗壞血酸過(guò)氧化物酶（Ascorbate peroxidase， APX）是植物重要的過(guò)氧化氫（Hydrogen peroxide， H2O2）清除酶之一。通過(guò)RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）方法從香蕉根系cDNA均一化全長(zhǎng)文庫(kù)中獲得一個(gè)抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因，命名為MaAPX2基因。MaAPX2基因是香蕉APX基因編碼框全長(zhǎng)cDNA，包含一個(gè)750 bp的最大開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frame， ORF），編碼249個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)域比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在MaAPX2 N端具有典型的APX活性位點(diǎn)（APLMLPLAWHSA）和過(guò)氧化物酶近端血紅素配體序列（DIVALSGGHTL）的保守結(jié)構(gòu)域，屬于典型的APX蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)比對(duì)分析表明，MaAPX2與馬蹄蓮ZaAPX（AAC08576.1）的親緣關(guān)系較近。組織特異性研究表明，MaAPX2基因組成型表達(dá)于香蕉各個(gè)組織，在葉片中表達(dá)量最大。在耐病和感病品種中，MaAPX2基因均上調(diào)表達(dá)，但在耐病品種中MaAPX2基因在所有時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于對(duì)照增加的倍數(shù)均高于感病品種，表明該基因在香蕉的抗病性中起著重要作用。MaAPX2基因可以作為一個(gè)新的響應(yīng)枯萎病侵染的標(biāo)記基因。

關(guān)鍵詞 香蕉 ；抗壞血酸過(guò)氧化物酶 ；基因克隆 ；表達(dá)分析

分類(lèi)號(hào) S668.1

Molecular Cloning and Expression of Ascorbate Peroxidase Gene

from Banana（Musa acuminata L. AAA group，cv. Cavendish）

WANG Zhuo1） XU Biyu1） JIA Caihong1） LI Jianping1）

LIU Juhua1） ZHANG Jianbing1） MIAO Hongxia1） JIN Zhiqiang1，2）

（1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China；

2 Haikou Experimental Station， CATAS， Haikou， Hainan 570102 China）

Abstract Ascorbate peroxidase （APX） is one of the key enzymes of hydrogen peroxide scavenging in plants. In this study，we reported the molecular characteristics of APX gene cloned from banana （Musa acuminata L. AAA group，cv. Cavendish） using a RACE-PCR-based strategy. MaAPX2 contained an open reading frame （ORF） of 750 bp which encoded a polypeptide of 249 amino acids. Protein alignment showed that MaAPX2 contain the complete typical conserved APX active-site signature and proximal heme-ligand motif， which belongs to a typical APX protein. Phylogenetic analysis showed that the deduced amino acid sequences of MaAPX2 also have high similarity to ZaAPX （AAC08576.1） from Zantedeschia aethiopica. Tissue-specific studies showed that the expression of MaAPX2 was constitutively expressed in various tissues of banana seedling. In resistant and susceptible varieties of banana after inoculation Foc TR4， the expression of MaAPX2 was decreased. While in resistant varieties the time point of MaAPX2， compared to control， increased higher than that in susceptible varieties at time points，indicated that this gene played an important role in banana resistance. MaAPX2 could be a new marker gene in banana seedling under the infection of Foc TR4.

Keywords banana ； ascorbate peroxidase ； gene clone ； expression analysis

在正常生理活動(dòng)時(shí)，活性氧（Reactive oxygen species， ROS）含量處于一定的動(dòng)態(tài)平衡。低濃度的ROS可作為胞內(nèi)信號(hào)分子，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)；然而過(guò)量的ROS則會(huì)引起胞內(nèi)膜脂過(guò)氧化、膜蛋白聚合等反應(yīng)，損傷植物細(xì)胞膜[1]。過(guò)氧化氫（Hydrogen peroxide， H2O2）是ROS的一種[2]，參與植物對(duì)病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)[3]，是植物與病原菌互作時(shí)形成的產(chǎn)物[4-5]?？箟难徇^(guò)氧化物酶（Ascorbate peroxidase， APX）（EC 1.11.1.11）屬于Ⅲ類(lèi)過(guò)氧化物酶，以抗壞血酸（Ascorbic acid， AsA）為底物將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，進(jìn)而維持植物體內(nèi)H2O2含量處于正常水平[6]。在植物中，APX基因編碼的蛋白根據(jù)在細(xì)胞中分布的位置可分為細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線(xiàn)粒體和過(guò)氧化物酶體四種類(lèi)型[7]。在植物-病原菌互作中，如煙草和煙草花葉病毒[8]、水稻和稻瘟菌[9]、葡萄和白粉病菌[10]、甜瓜和白粉菌[11]，APX基因的表達(dá)均受病原菌侵染的誘導(dǎo)，表明APX基因在植物-病原菌互作中起著重要作用。到目前為止，MaAPX1基因參與香蕉果實(shí)采后成熟，受乙烯和ABA的調(diào)控[12]。在香蕉A基因組中預(yù)測(cè)出12個(gè)APX基因[13]，表明香蕉APX基因的克隆及功能分析還需進(jìn)一步完善。然而到目前為止，還沒(méi)有進(jìn)一步研究APX基因與枯萎病關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。

香蕉是熱帶、亞熱帶發(fā)展中國(guó)家重要的農(nóng)作物之一。其果實(shí)由于富含豐富的蛋白質(zhì)和碳水化合物，是部分熱區(qū)的主要糧食和國(guó)民收入的主要來(lái)源[14]。然而香蕉枯萎病嚴(yán)重威脅香蕉的正常生產(chǎn)[15]。抗病育種是克服香蕉枯萎病的方法之一[16]，目前生產(chǎn)上主栽的品種‘巴西蕉由于是三倍體且生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，雜交育種方法很難開(kāi)展抗病育種，因此篩選及鑒定基于射線(xiàn)誘變、化學(xué)誘變及自然突變體抗枯萎病株系是有效的途徑。目前在香蕉中參與香蕉抗病的重要的標(biāo)記基因報(bào)道較少。本研究從香蕉中分離并克隆一個(gè)MaAPX基因，利用生物信息學(xué)網(wǎng)站分析了該基因的結(jié)構(gòu)特性，采用熒光定量技術(shù)分析了該基因的表達(dá)模式，進(jìn)一步了解MaAPX基因參與香蕉抗枯萎病過(guò)程的調(diào)控機(jī)理，開(kāi)發(fā)可供進(jìn)一步使用的香蕉抗枯萎病種質(zhì)鑒定的標(biāo)記基因，具有重要的理論和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試香蕉品種為‘巴西蕉（cv. Cavendish）和‘農(nóng)科1號(hào)（cv. Nongke No.1），購(gòu)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院組培中心，苗齡為移栽大棚后約60 d的健康杯苗，其中‘巴西蕉為枯萎病菌感病品種，‘農(nóng)科1號(hào)為耐病品種。香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種[Fusarium Oxysporum f specialis （f. Sp） cubense Tropical Race 4， Foc TR4]，為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所張欣博士饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 MaAPX2基因克隆及分析

在香蕉根系cDNA全長(zhǎng)均一化文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序的克隆中[17]，獲得一條APX基因序列，設(shè)計(jì)5'RACE引物，按照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RACE反應(yīng)，獲得完整的ORF。將該基因序列在經(jīng)過(guò)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)B進(jìn)行同源檢索、分析其核酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；并利用MEGA4.0軟件分析該基因編碼的蛋白序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）和香蕉A基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//banana-genome.cirad.fr/tools.html）中相應(yīng)蛋白序列的進(jìn)化關(guān)系。

1.2.2 MaAPX2基因在香蕉不同器官的表達(dá)分析

選取生長(zhǎng)8個(gè)月的香蕉根、球莖、假莖、葉、花和果實(shí)，參照略作修改的Wan和Wilkins[18]報(bào)道的方法提取上述各組織總RNA。利用Invitrogen SuperScript TMⅢ Reverse Transcriptase試劑盒合成cDNA。在MaAPX2基因5′端非保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，引物為P1（5′-GAGAAGGGAGAACGGAGTC-3′）和P2（5′-TCCCACCTTGAAGTTGCT-3′）。MaActin1引物為NP1（5′-CGAGGCTCAATCAAAGA-3′）和NP2（5′-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3′）。以MaActin1基因片段為內(nèi)參，采用熒光定量PCR方法對(duì)其進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析，反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性7 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，循環(huán)40次。實(shí)時(shí)定量PCR采用SYBR Green染料，在吉泰生物科技公司Mx 3005P熒光定量PCR儀上進(jìn)行。

1.2.3 MaAPX2基因在香蕉接種Foc TR4后的表達(dá)分析

將Foc TR4孢子懸浮液，接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，28 ℃培養(yǎng)7 d，收集Foc TR4孢子。將‘巴西蕉（cv. Cavendish AAA）和‘農(nóng)科1號(hào)（cv. Nongke No.1）分為2組，每組60株幼苗。以蘸根接菌法接種Foc TR4，接種濃度為每毫升為1×106個(gè)孢子。接種后2、4、6 d取樣，以未接種的0 d為對(duì)照。以接種后不同時(shí)間點(diǎn)的香蕉根系cDNA第一鏈為模板，引物同“1.2.2”，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MaAPX2基因的表達(dá)，反應(yīng)程序同“1.2.2”。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均做3次生物重復(fù)，利用SAS軟件（SAS 9.0 for Windows）進(jìn)行顯著性分析，“**”、“*”分別表示差異達(dá)到極顯著（p<0.01）和顯著水平（p<0.05）。結(jié)果用KyPlot軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaAPX2基因克隆與序列分析

測(cè)序后經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列與其他植物APX基因序列具有較高的同源性，表明該序列是香蕉APX基因編碼框全長(zhǎng)cDNA，命名為MaAPX2。MaAPX2基因序列全長(zhǎng)為990 bp，其中5′非翻譯區(qū)48 bp，3′非翻譯區(qū)181 bp，含有一個(gè)750 bp的ORF，編碼249個(gè)氨基酸殘基（圖1）。MaAPX2基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量為27.37 ku，等電點(diǎn)為5.31。在推導(dǎo)的蛋白序列方面，MaAPX2與其他植物的APX的蛋白序列具有較高的相似性（圖2）。MaAPX2基因在香蕉A基因組[13]進(jìn)行比對(duì)，找到與其高度同源的GSMUA_Achr5P07280_001基因，二者僅有2個(gè)核苷酸存在差異，分別位于第455、521號(hào)位點(diǎn)；進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，二者氨基酸序列一致。在GenBank中對(duì)MaAPX2蛋白質(zhì)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域搜索和同源性分析，它的氨基酸序列在N端具有典型的APX活性位點(diǎn)（APLMLPLAWHSA）（圖2 A區(qū)域）和一個(gè)過(guò)氧化物酶近端血紅素配體序列（DIVALSGGHTL）（圖2 H區(qū)域），表明MaAPX2蛋白屬于APX家族成員。為了研究MaAPX2與其它各物種間的進(jìn)化關(guān)系，將MaAPX2的氨基酸序列和其它植物的APX氨基酸序列利用軟件MEGA4.0中的N-J的方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，由圖3可見(jiàn)，所有APX蛋白可以分為4個(gè)類(lèi)型。MaAPX2分屬于細(xì)胞質(zhì)型APX蛋白，它與馬蹄蓮（Zantedeschia aethiopica）的ZaAPX（AAC08576.1）同源關(guān)系最近（圖3）。

2.2 MaAPX2基因組織特異性表達(dá)分析

MaAPX2在根中表達(dá)量最低；葉中表達(dá)量最高，是根中的4.7倍；花、球莖和果實(shí)中表達(dá)量較高，其表達(dá)量是根系中相對(duì)表達(dá)量的3.2和2.1倍（圖4）。

2.3 MaAPX2基因在不同抗性的香蕉品種接種Foc TR4后的表達(dá)分析

在感病品種中，MaAPX2基因的相對(duì)表達(dá)量在接種Foc TR4后1和2 d變化不大，在接種后3 d，其相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的1.6倍（圖5）。在耐病品種中MaAPX2基因的相對(duì)表達(dá)量在接種Foc TR4后顯著增加，在1 d達(dá)到最大，是對(duì)照的6.6倍；雖然在接種2和3 d有所降，但其表達(dá)量還是高于對(duì)照，同樣其相對(duì)表達(dá)量也高于感病品種。因此，從相對(duì)表達(dá)量的變化上看，MaAPX2基因在感病品種中變化不顯著，而在耐病品種中被顯著激活，而且耐感品種中表達(dá)模式與抗性相關(guān)，表明該基因可能參與香蕉抗枯萎病的過(guò)程。

3 討論

活性氧物質(zhì)的生成是植物防御反應(yīng)重要步驟[1，19]，APX是與H2O2親和力最強(qiáng)的過(guò)氧化物酶，在植物響應(yīng)病原菌侵染過(guò)程中具有重要的作用[8]。本研究獲得一個(gè)全長(zhǎng)香蕉APX基因。在序列分析方面，該基因與其他植物的APX基因具有較高的同源性。MaAPX2基因編碼的蛋白質(zhì)在氨基酸的數(shù)目、分子量和等電點(diǎn)等方面，與已報(bào)道的MaAPX1相似[12]，同樣也與其它植物APX蛋白特征相似[9-11]。MaAPX2基因推導(dǎo)氨基酸序列中包含一個(gè)APX活性位點(diǎn)（AP-LMLPLAWHSA，圖2A區(qū)域）和一個(gè)過(guò)氧化物酶近端血紅素配體序列（DIVALSGGHTL）[20]。同時(shí)MaAPX2基因與香蕉A基因組中預(yù)測(cè)出的chr5T07280_001高度同源，表明栽培的巴西蕉品種（AAA group）與測(cè)序的DH-Pahang品種（AA group）親緣關(guān)系很近，同樣結(jié)果也表明，2個(gè)品種的APX基因是同源基因，其差異主要是序列間的SNP形成的（結(jié)果未列出），這些SNP可以作為潛在的分子標(biāo)記為后續(xù)的香蕉育種服務(wù)。植物APX基因家族由4個(gè)亞家族組成，分別為細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線(xiàn)粒體和過(guò)氧化物酶體基因亞家族[7]。在擬南芥中包含8個(gè)APX基因成員[21-23]，APX1、APX2和APX6基因編碼的蛋白位于細(xì)胞質(zhì)，sAPX基因編碼的蛋白存在于葉綠體基質(zhì)，結(jié)合在類(lèi)囊體膜上的tAPX基因編碼的蛋白位于葉綠體，APX3、APX4和APX5基因編碼的蛋白存在于過(guò)氧化物酶體。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，MaAPX2與其他植物的細(xì)胞質(zhì)型APX親緣關(guān)系相近，表明MaAPX2是一個(gè)典型的香蕉細(xì)胞質(zhì)型抗壞血酸過(guò)氧化物酶。

在多種植物如蝴蝶蘭[24]、茶樹(shù)[25]、黃芩[26]和甘蔗[27]中，APX基因在根、莖、葉和花等組織中均有表達(dá)，同樣在本研究中供試的根、球莖、假莖、葉、花和果實(shí)中均檢測(cè)到MaAPX2基因的表達(dá)，表明MaAPX2基因在香蕉組織中屬于組成型表達(dá)，推測(cè)MaAPX2基因可能在香蕉的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。APX基因與植物抗病密切相關(guān)[8-11]，APX對(duì)H2O2高度親和[6]，因此在植物和病原菌互作時(shí)，APX酶活性對(duì)H2O2的含量起著重要的調(diào)控作用，進(jìn)而影響植物的抗病性。在香蕉與枯萎病菌互作中APX酶活作為一個(gè)抗病指標(biāo)水平，參與香蕉抗枯萎病的過(guò)程[28]。MaAPX2基因在感病品種中的基因表達(dá)被抑制，而在耐病品種中被激活，MaAPX2基因表達(dá)與香蕉抗病性正相關(guān)，說(shuō)明該基因可能參與香蕉響應(yīng)Foc TR4侵染的過(guò)程。目前，香蕉抗病種質(zhì)的創(chuàng)制與篩選是解決香蕉枯萎病的有效方法之一，然而缺乏有效的抗病種質(zhì)的鑒定方法。MaAPX2基因在耐病品種中表達(dá)趨勢(shì)與感病品種相反且相對(duì)表達(dá)量的倍數(shù)高于感病品種，因此該基因可以當(dāng)作一個(gè)新的檢測(cè)枯萎病菌侵染的標(biāo)記基因。今后將深入研究MaAPX基因參與香蕉抗枯萎病的內(nèi)在機(jī)制，以期揭示APX在香蕉抗枯萎病中的生理作用。

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