叢漢卿+齊堯堯+朱文麗

摘要：為研究木薯中PHOR1基因如何被逆境信號調(diào)控，根據(jù)楊樹2個(gè)PHOR1同源基因搜索木薯基因組數(shù)據(jù)庫，得到2個(gè)高度同源的木薯PHOR1基因，即MePHOR1_1和MePHOR1_2。序列分析表明，它們都具有E3泛素連接酶家族成員特征：含有U-box和armadillo重復(fù)序列。此外其啟動(dòng)子區(qū)具有乙烯響應(yīng)元件和茉莉酸響應(yīng)元件。以木薯品種華南八號懸浮培養(yǎng)細(xì)胞為材料，利用qRT-PCR檢測MePHOR1_1和MePHOR1_2基因在乙烯利和茉莉酸甲酯處理后的表達(dá)特性。結(jié)果顯示：在乙烯和茉莉酸甲酯分別處理后的細(xì)胞懸浮液中，2個(gè)PHOR1基因的表達(dá)變化呈現(xiàn)相似趨勢，即乙烯處理后，2個(gè)基因的表達(dá)均出現(xiàn)先下降后緩慢上升的趨勢；而對茉莉酸信號則呈現(xiàn)先上升后下降又上升再下降的波動(dòng)性趨勢，故推測2個(gè)PHOR1基因可被乙烯和茉莉酸信號調(diào)控，并可在后續(xù)的根生長和淀粉積累等一系列生理生化過程中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：木薯；PHOR1基因；乙烯；茉莉酸；表達(dá)分析

中圖分類號：S533.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2016）11-0029-05

木薯（Manihot esculenta Crantz）屬于大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot P.Miller），原產(chǎn)于熱帶南美洲，是世界三大薯類作物之一，是第六大糧食作物，是重要的能源和淀粉作物。木薯的根作為其主要經(jīng)濟(jì)部位，研究其生長發(fā)育和淀粉積累具有重要意義。

Amador等在研究馬鈴薯（Solanum tuberosum）短日照條件下在上調(diào)表達(dá)的調(diào)控因子中首次獲得了PHOR1基因，并通過煙草轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證明PHOR1對GA信號途徑具有正調(diào)控作用[1]。PHOR1編碼1個(gè)Cys-Pro-Ile motif（CPI）結(jié)構(gòu)域和7個(gè)armadillo（ARM）重復(fù)序列的蛋白[2]。此CPI結(jié)構(gòu)域具有典型的U-box序列特征，U-box結(jié)構(gòu)一般存在于E3泛素連接酶中[3]，可促進(jìn)特異目標(biāo)蛋白的泛素化[4]，缺失試驗(yàn)表明，CPI是一種可被GA抑制的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滯留信號。而ARM重復(fù)序列是PHOR1的核定位信號，其核定位功能可為CPI所逆轉(zhuǎn)。目前，對PHOR1基因的研究已有一定基礎(chǔ)，但在木薯中的表達(dá)特性和基因功能還未被研究。

茉莉酸（jasmonic acid，簡稱JA）和乙烯（ethylene，簡稱ET）是植物逆境響應(yīng)的信號分子，在涉及植物對生物性和非生物性逆境脅迫和植物生長發(fā)育過程中的基因調(diào)控上發(fā)揮著重要作用。JA作為一種逆境脅迫轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，具有誘導(dǎo)植物防御基因的表達(dá)、調(diào)控植物對機(jī)械傷害、鹽害及紫外線照射等非生物脅迫的反應(yīng)的功能[5-6]。而ET是另外一種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，可影響植物多個(gè)生長發(fā)育過程，對植物自身來說，乙烯在種子萌發(fā)、開花、葉片伸展、根的生長、果實(shí)成熟及器官衰老等方面發(fā)揮著作用；對植物與外界環(huán)境的關(guān)系來說，乙烯主要參與植物面對外界生物與非生物脅迫的反應(yīng)過程。很多涉及上述相關(guān)過程的基因序列上都有乙烯響應(yīng)元件[7-8]。

楊樹中的PHOR1同源基因被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控芽和根生長、淀粉積累、木質(zhì)部形成的功能[9]。根據(jù)楊樹PHOR1同源基因PtPHOR1_1（POPTR_0007s03730）和PtPHOR1_2（POPTR_0005s05880）的序列在JGI的木薯基因組數(shù)據(jù)庫 v6.1[10]中搜索獲得2個(gè)高度同源序列：Manes.12G152200和Manes.13G071800，分別命名為MePHOR1_1和MePHOR1_2。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其具有典型的U-box結(jié)構(gòu)和ARM重復(fù)序列，且MePHOR1_1啟動(dòng)子區(qū)具有1個(gè)乙烯響應(yīng)元件和1個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件，MePHOR1_2具有2個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件。同時(shí)利用木薯懸浮培養(yǎng)細(xì)胞對其ET和JA甲酯誘導(dǎo)表達(dá)特性分析中也發(fā)現(xiàn)，PHOR1基因可受ET和JA信號調(diào)控，并呈現(xiàn)不同的表達(dá)趨勢。本研究旨在通過序列分析和表達(dá)分析，確定ET和JA信號是否能對PHOR1基因表達(dá)造成影響，并初步探索表達(dá)變化特性及其機(jī)制，為進(jìn)一步研究逆境信號通過PHOR1基因在木薯塊根發(fā)育和淀粉積累過程中所發(fā)揮的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木薯（Manihot esculenta Crantz）品種華南八號（SC8）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，該細(xì)胞通過葉片愈傷組織建立，保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所。Axygen總RNA小量制備試劑盒（Axygen）；PrimeScriptTM Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Pefect Real Time）實(shí)時(shí)定量試劑盒（TaKaRa）；引物由Invitrogen（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

吸取處于指數(shù)增長期的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞 1 mL 于離心管中并置于搖床25 ℃穩(wěn)定0.5 h，分為3組，其中2組分別以濃度為400 μL/L的乙烯利（ethephon）（Solarbio）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，簡稱MeJA）（Sigma-Aldrich）處理，另一組不進(jìn)行任何處理作為對照。選取處理后0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品，微離心后棄上清液氮速凍-80 ℃冰箱保存。此步驟重復(fù)3次，獲得3批生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 PHOR1基因及啟動(dòng)子區(qū)序列分析

使用JGI的木薯基因組數(shù)據(jù)庫（http：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias=Org_Mesculenta_er）獲得MePHOR1_1和MePHOR1_2的CDS序列（coding sequence）和DNA序列（genomic sequence）[10]。用NetGene2 V2.4（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/）分析基因結(jié)構(gòu)[11-12]。用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）分析內(nèi)含子相位[13]。用TSSP（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=tssp&group=programs&subgroup=promoter）分析轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)[14]，用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析啟動(dòng)子區(qū)序列，尋找順勢作用元件位點(diǎn)[15]。

1.2.3 PHOR1蛋白分析

使用Blast工具對預(yù)測的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，用PortParam（http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測其蛋白分子量和等電點(diǎn)[16]，使用InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）預(yù)測結(jié)構(gòu)域[17]。利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）[18]和MAST（http：//meme-suite.org/tools/mast）[19]分析木薯PHOR1蛋白的基序，基序數(shù)目設(shè)為10，E-values為默認(rèn)的1.0。用TMHMM Server在線工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測[20]，使用SubLoc在線工具（http：//www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/）進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測[21]。使用PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預(yù)測二級結(jié)構(gòu)[22]。利用Swiss-model（http：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測三維結(jié)構(gòu)[23]。使用PFP（http：//kiharalab.org/web/pfp.php）預(yù)測蛋白功能[24]。

1.2.4 序列比對和進(jìn)化樹分析

鑒于目前只有少數(shù)作物對PHOR1進(jìn)行了研究，目前我們只找到了除木薯外的已報(bào)道的6種植物中的PHOR1基因。來自木薯的2個(gè)PHOR1基因MePHOR1_1和MePHOR1_2、楊樹（Populus trichocarpa）的PHOR1基因PtPHOR1_1（POPTR_0007s03730）和PtPHOR1_2（POPTR_0005s05880）[9]、馬鈴薯（Solanum tuberosum）StPHOR1（AJ306423）[1]、番茄（Lycopersicon esculentum）的LePHOR1（Solyc04g071030）[25]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）HIM1/HIM2/HIM3[3]、龍眼（Dimocarpus longan L.）DlPHOR1[26]、白羽扇豆（Lupinus albus）中具有完整CDS的3條PHOR1同源contigs（LAGI01_34089、LAGI01_33328、LAGI01_27558）[27]。使用MEGA 6對其氨基酸進(jìn)行序列比對，并構(gòu)建鄰接（neighbor-joining，N-J）聚類進(jìn)化樹。使用bootstrap方法1 000次重復(fù)對進(jìn)化樹進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 PHOR1誘導(dǎo)表達(dá)的qRT-PCR檢測

提取RNA后進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，利用qRT-PCR檢測木薯PHOR1基因在懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中受乙烯利和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)表達(dá)情況，所有的qRT-PCR反應(yīng)均來自同一批反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物，18S rRNA為內(nèi)參。所用PHOR1基因及18S rRNA的引物為Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，MePHOR1_1和MePHOR1_2基因僅有1個(gè)外顯子，都沒有內(nèi)含子。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測顯示：MePHOR1_1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子上游 857 bp 處，而MePHOR1_2基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子上游1 282 bp處。順勢作用元件位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)：MePHOR1_1基因啟動(dòng)子區(qū)域包含典型啟動(dòng)子調(diào)控元件 CAAT-box 和 TATA-box及多個(gè)光響應(yīng)順式元件、1個(gè)乙烯響應(yīng)元件和1個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件；此外還包含真菌誘導(dǎo)子響應(yīng)元件、MYB結(jié)合位點(diǎn)以及參與細(xì)胞周期和胚乳表達(dá)響應(yīng)元件。而MePHOR1_2除具有典型啟動(dòng)子調(diào)控元件CAAT-box和 TATA-box外，也存在多個(gè)光響應(yīng)順式元件和2個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件，但不具有乙烯響應(yīng)元件；另外還包含厭氧誘導(dǎo)的響應(yīng)元件、真菌誘導(dǎo)子響應(yīng)元件、MYB結(jié)合位點(diǎn)以及生長素響應(yīng)元件（表2）。

2.2 蛋白分析

MePHOR1_1有418個(gè)氨基酸，分子量為46 610.3 u，理論等電點(diǎn)為8.28。MePHOR1_2有418個(gè)氨基酸，分子量為 46 795.6 u，理論等電點(diǎn)為7.47?？缒^(qū)分析顯示此蛋白可能無跨膜結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明，這2個(gè)蛋白有可能定位在核上。二者具有相同基序。符合E-value<1的基序有6個(gè)，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測MePHOR1_1和MePHOR1_2有22個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)，可參考其三維預(yù)測結(jié)構(gòu)（圖1）。PFP蛋白功能預(yù)測顯示：MePHOR1_1和MePHOR1_2基因最符合Gene Ontology（GO）中的GO：0005515條目，具有蛋白結(jié)合功能。

2.3 PHOR1基因進(jìn)化樹分析

從進(jìn)化樹可以看出，同一科植物的PHOR1基因基本聚為一類，木薯作為大戟科植物，2個(gè)PHOR1處于一個(gè)單獨(dú)分支上，且在親緣關(guān)系上較為接近楊樹和龍眼（圖2）；楊樹與龍眼作為木本植物處于同一分支，且龍眼的DlPHOR1與楊樹PtPHOR1_1的親緣關(guān)系要近于楊樹自身的PtPHOR1_2；此外擬南芥的3個(gè)基因也處于同一分支；馬鈴薯和番茄同為茄科植物，處于同一分支；與此親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的白羽扇豆位于一個(gè)距離較遠(yuǎn)的獨(dú)立分支上。

2.4 茉莉酸甲酯和乙烯誘導(dǎo)木薯PHOR1表達(dá)水平變化

為排除PHOR1基因本底變化造成的影響，將茉莉酸甲酯和乙烯誘導(dǎo)后的qRT-PCR表達(dá)量值除以相應(yīng)對照的表達(dá)量值，值1.0為本底表達(dá)水平。最終獲得其在2種處理下的表達(dá)趨勢，結(jié)果顯示兩者呈現(xiàn)不同趨勢：MePHOR1_1在茉莉酸甲酯的響應(yīng)整體呈現(xiàn)波浪狀，處理0.5 h后表達(dá)量提升至1.7左右，又在1 h快速下降至0.7水平，后在4 h時(shí)，逐漸恢復(fù)到初始水平，但又在8 h出現(xiàn)劇烈下降至最低水平。而乙烯信號對其的影響呈現(xiàn)先在1 h下降至最低點(diǎn)后又逐漸上升的趨勢（圖3-A）。茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，MePHOR1_2的趨勢與MePHOR1_1較為類似，也呈現(xiàn)波浪狀，但表達(dá)水平有較大差異，處理0.5 h后表達(dá)量提升至2.0以上，又在 1 h 快速下降至初始水平以下，但在4 h時(shí)提升到4.0，后又在8 h出現(xiàn)劇烈下降。而乙烯信號對其沒有非常明顯的影響，趨勢線較為平直得維持在略低于初始水平的狀態(tài)下（圖3-B）。

3 結(jié)論與討論

植物懸浮培養(yǎng)細(xì)胞是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中研究信號傳遞和基因響應(yīng)的常用方法。加入外源信號物質(zhì)刺激后，信號物質(zhì)可快速、均勻地分布在每個(gè)細(xì)胞周圍，操作簡易，為試驗(yàn)結(jié)果的一致性和重復(fù)性提供了保障。本研究選用的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞大小接近、生長迅速且生長周期基本一致。本試驗(yàn)中，PHOR1基因在逆境信號物質(zhì)施加后0.5 h內(nèi)即作出了響應(yīng)，并且在整個(gè)過程中表達(dá)量最高可達(dá)初始水平的4倍，表明本試驗(yàn)所選用的材料適用于基因表達(dá)分析研究。

如同楊樹PtPHOR1[9]，木薯PHOR1基因也是一類較為保守的基因，MePHOR1_1和MePHOR1_2兩者具有很高的序列相似性。在蛋白結(jié)構(gòu)上具有和已知的植物PHOR1基因類似的U-box結(jié)構(gòu)和ARM重復(fù)序列。進(jìn)化樹分析中，與楊樹的PtPHOR1和龍眼的DlPHOR1基因具有較近的親緣關(guān)系，可以推斷MePHOR1是一類典型的PHOR1基因。同時(shí)啟動(dòng)子區(qū)分析發(fā)現(xiàn)MePHOR1具有乙烯響應(yīng)因子ERE及茉莉酸響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif，初步解釋了乙烯和茉莉酸信號可影響PHOR1基因的表達(dá)。盡管MePHOR1_1有1個(gè)乙烯響應(yīng)元件，但乙烯響應(yīng)的變化趨勢卻是下調(diào)的，可能有其他調(diào)控機(jī)制抑制了乙烯信號的順勢調(diào)控，具體原因還須進(jìn)一步探索。MePHOR1_2沒有乙烯響應(yīng)元件，其ET處理后的變化曲線盡管略低于本底水平1.0，但趨勢較為平緩，從一個(gè)角度解釋了MePHOR1_2為何對乙烯信號不敏感。此外，MePHOR1_2在0.5 h和4.0 h對JA響應(yīng)的表達(dá)量要明顯高于MePHOR1_1，推測與其具有2個(gè)茉莉酸響應(yīng)元件有一定關(guān)系。

在乙烯和茉莉酸處理后0.5 h內(nèi)，PHOR1呈現(xiàn)出不同的響應(yīng)趨勢，ET導(dǎo)致下調(diào)而JA導(dǎo)致上調(diào)，表明雖同為逆境信號物質(zhì)，卻對PHOR1具有不同的調(diào)控作用。植物中茉莉酸和乙烯與其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的激素的交叉相互作用在整個(gè)生活周期內(nèi)、不同組織器官間、不同類型細(xì)胞中一直存在。不同激素信號的整合共同介導(dǎo)了植物的生長發(fā)育、對環(huán)境的反應(yīng)及衰老死亡。此外，2個(gè)PHOR1基因的啟動(dòng)子區(qū)還有各自獨(dú)有的調(diào)控元件，如生長素響應(yīng)、MYB結(jié)合位點(diǎn)等。故此推測，2種不同逆境信號施加后與其他不同激素的綜合作用，產(chǎn)生了迥異的調(diào)控模式，最終造成PHOR1基因不同的表達(dá)特性。

楊樹中PHOR1基因受到抑制后，其莖部和根部的淀粉積累出現(xiàn)了上升[9]，馬鈴薯中，PHOR1的下調(diào)可以促進(jìn)塊莖的生長[1]。PHOR1具有抑制根和芽生長的功能，眾所周知，當(dāng)不利環(huán)境來臨時(shí)，植物開始大量合成貯藏營養(yǎng)物質(zhì)，并伴隨著生長的停滯[28]。因此，PHOR1是一種當(dāng)不利環(huán)境來臨時(shí)植物將碳水化合物從用于生長轉(zhuǎn)為用于貯藏的調(diào)控機(jī)制的一部分。PHOR1調(diào)控淀粉代謝的方式可能與GA信號途徑有關(guān)[29]。PHOR1基因可能在根的發(fā)育過程中起一定的控制作用，楊樹PHOR1基因的過量表達(dá)會(huì)顯著減少生根[9]。有研究表明，GA會(huì)嚴(yán)重影響生長素的運(yùn)輸[30-32]。因此，PHOR1作為GA信號的一部分，可能會(huì)干擾生長素的運(yùn)輸和其感知定位生長素濃度信息的能力，這對根的形成至關(guān)重要?？傊?，PHOR1基因即可受光誘導(dǎo)，又可與GA信號互相影響，說明其是鏈接光信號途徑和GA途徑的一個(gè)橋梁[1]。由此推測：隨著季節(jié)更替，日照時(shí)間發(fā)生變化，這一光信號將影響到植物PHOR1基因的表達(dá)，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)GA影響植株芽和根的生長，并促進(jìn)淀粉積累，以迎接即將到來的秋冬季節(jié)的低溫不利環(huán)境。

木薯作為重要的糧食作物及工業(yè)乙醇和淀粉來源[33-34]，根作為其主要經(jīng)濟(jì)部位，其生長發(fā)育和淀粉的積累具有重要的科研意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，PHOR1基因作為可以調(diào)控此二者的重要基因，研究逆境信號如何對其造成影響并探索相關(guān)機(jī)制，可以進(jìn)一步為木薯產(chǎn)量的提高和質(zhì)量的提升奠定理論基礎(chǔ)。目前我們已知木薯的PHOR1基因可受到乙烯和茉莉酸信號影響，并初步確定其表達(dá)特性，但具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑及此蛋白的具體功能，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證和探索。

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