黃淑梅 張之 阿麗米熱·阿克木江 木拉提·克扎衣別克

〔摘要〕 目的 探討阿爾泰瑞香二氯甲烷提取物（Da-Dm）的體外抗炎及抗氧化活性。方法 以不同濃度（1、6、30 μg/mL）的Da-Dm作用于脂多糖（LPS，1 μg/mL）誘導(dǎo)的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞，采用CCK-8法測定Da-Dm對細(xì)胞增殖的影響;Griess法檢測細(xì)胞上清液中一氧化氮（NO）的釋放量;ELISA法檢測細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的分泌量。以維生素C為對照，采用FRAP法、DPPH法評價Da-Dm總抗氧化能力。結(jié)果 Da-Dm在濃度為30 μg/mL及以下時對RAW264.7細(xì)胞增殖沒有影響。與LPS組比較，1～30 μg/mL的Da-Dm可明顯降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的含量（P<0.05，P<0.01），并呈現(xiàn)濃度依賴性。Da-Dm對DPPH自由基有較好的清除能力，其清除率的IC50為318.1 μg/mL，在FRAP實驗中其對Fe2+離子具有較強(qiáng)的還原能力。結(jié)論 Da-Dm可以抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)，它的抗炎作用可能與抑制NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放有關(guān)。Da-Dm具有較好的抗氧化活性。

〔關(guān)鍵詞〕 阿爾泰瑞香;二氯甲烷提取物;RAW264.7細(xì)胞;炎癥介質(zhì);抗氧化作用

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.07.009

〔Abstract〕 Objective To explore the in vitro anti-inflammatory and antioxidant activities of the dichloromethane extracts from Daphne altaica Pall （Da-Dm）. Methods Mice RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharides （LPS， 1 μg/mL） were treated with different concentrations of Da-Dm （1， 6， 30 μg/mL） respectively. The proliferation of RAW264.7 cells was determined by CCK-8 method; the output of nitric oxide （NO） in the cell supernatant was evaluated by Griess reagent assay; the secretion volumes of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6） were detected by ELISA. The total antioxidant activity of the Da-Dm was evaluated by 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） assay and ferric reducing-antioxidant power （FRAP） assay， and vitamin C （Vc） was used as a positive control. Results Da-Dm with the concentration of 30 μg/mL and below had no influence on the the proliferation of RAW264.7 cells. Compared with the LPS group， 1-30 μg/mL of Da-Dm in the LPS-induced RAW264.7 cells greatly inhibited their release of inflammatory mediators， such as NO， IL-1β， IL-6 and TNF-α （P<0.05， P<0.01）， in a dose-dependent manner. The Da-Dm exhibited good DPPH radical cleaning power and good Fe2+ reducing power. The median inhibitory concentration （IC50） of scavenging DPPH radical was 318.1 μg/mL. Conclusion Da-Dm can inhibit LPS-induced inflammatory response in RAW264.7 cells， and its anti-inflammatory effect may be related to the reduction of the release of inflammatory cytokines， like NO， IL-1β， IL-6 and TNF-α. The antioxidant activity of Da-Dm is strong.

〔Keywords〕 Daphne altaica Pall; dichloromethane extracts; RAW264.7 cells; inflammatory cytokines; antioxidant

阿爾泰瑞香（Daphne altaica Pall.）為瑞香科瑞香屬植物阿爾泰瑞香的干燥莖皮，其主要分布于阿爾泰山脈[1]。其味辛、溫，有毒。具有發(fā)汗解表、止咳祛痰、溫中止痛的功效[2]，長期以來在哈薩克傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用于胃癌、氣管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[3-4]等疾病的治療。有研究表明，阿爾泰瑞香正己烷提取物能夠抑制人食管癌 ECA-109細(xì)胞的增殖[5]，其二氯甲烷提取物和甲醇提取物均對人急性早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞的體外增殖具有明顯的抑制活性[6]。但阿爾泰瑞香的體內(nèi)外抗炎抗氧化作用卻鮮見報道。故本實驗選取二氯甲烷提取物為實驗對象，利用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的體外炎癥模型來初步分析阿爾泰瑞香的抗炎效果，并對其體外抗氧化作用也進(jìn)行了分析，以期對阿爾泰瑞香的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥材

阿爾泰瑞香由伊犁州中醫(yī)醫(yī)院哈藥研究所于2018年1月提供，其原植物經(jīng)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)吾買爾夏提·塔漢教授鑒定為瑞香科屬植物阿爾泰瑞香Daphne altaica Pall。

1.2? 主要試劑

RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞株（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）;維生素C標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100425-201504，含量為100.0%）;DMEM高糖培養(yǎng)基（美國GIBCO公司，批號：8118174）;胎牛血清（依科賽生物科技有限公司，批號：11G145）;脂多糖（LPS，美國Sigma-Aldrich公司，批號：028M4021V）;CCK8試劑盒（北京全式金生物有限公司，批號：J30608）;地塞米松（上海麥克林生物生化科技有限公司，批號：C10187631）;NO試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20180725）;TNF-α試劑盒（批號：A28280643）、IL-1β試劑盒（批號：A201B80633）、IL-6ELISA試劑盒（批號：A20680724）均購自于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司;TPTZ（批號：111758-1701）、DPPH（批號：10257-1708）均購自于北京百靈威科技有限公司;其余試劑均為分析純。

1.3? 主要儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、生物安全柜（上海力康儀器有限公司）;臺式低速離心機(jī)（上海飛鴿儀器有限公司）;恒溫箱、恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）;熒光倒置顯微鏡（日本尼康公司）;酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）。

1.4? 體外抗炎實驗

1.4.1? 阿爾泰瑞香二氯甲烷提取物（Da-Dm）的制備 取阿爾泰瑞香干燥莖皮150g，以藥材與正己烷為1：10的比例回流1 h（提取2次），棄去正己烷提取液，繼續(xù)將藥材與二氯甲烷為1∶10的比例回流1 h（提取2次），將阿爾泰瑞香二氯甲烷提取液過濾，合并提取液，減壓濃縮，冷凍干燥得Da-Dm。

1.4.2? 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代? 用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)液（含100U/mL青霉素和鏈霉素）于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.4.3? 分組? 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞隨機(jī)分為6組?？瞻讓φ战M：加入等體積的培養(yǎng)液;炎癥模型組：只用1 μg/mL的LPS處理而不加藥物干預(yù);LPS+陽性對照組：10 μM的地塞米松（DM）預(yù)處理1 h后，再加1 μg/mL LPS干預(yù)24 h;LPS+藥物組：取不同濃度的Da-Dm（1、6、30 μg/mL），再加1 ug/mL的LPS干預(yù)24 h。

1.4.4? Da-Dm對LPS誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞增殖的影響? 取對數(shù)生長期RAW264.7的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL的單細(xì)胞懸液，以每孔100 μL接種至96孔板中，24 h后按1.4.3實驗分組進(jìn)行干預(yù)，每組5個重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入培養(yǎng)基總體積10 μL的CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育，1 h后用酶標(biāo)儀測定OD450 nm處的吸光度A，計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=（A樣品/A空白）×100%

1.4.5? Da-Dm對LPS誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞NO含量的影響? 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL的單細(xì)胞懸液，以每孔300 μL接種至48孔板中，24 h后按“1.4.3”實驗分組進(jìn)行干預(yù)，每組5個重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清，按NO試劑盒說明進(jìn)行檢測。

1.4.6? Da-Dm對LPS誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量的影響? 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL的單細(xì)胞懸液，以每孔300 μL接種至48孔板中，24 h后按“1.4.3”實驗分組進(jìn)行干預(yù)，每組5個重復(fù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清，按ELISA試劑盒說明進(jìn)行檢測。

1.5? 體外抗氧化實驗

1.5.1? FRAP法測定Da-Dm的抗氧化活性? 按照 Benzie等[7]的方法進(jìn)行進(jìn)一步修改，精確量取醋酸鈉緩沖液（0.3 mmol/L， pH 3.6） 、TPTZ 溶液（10 mmol/L）及FeCl3 （20 mmol/L）溶液，體積比為10∶1∶1的比例混勻，得FRAP工作液，配置FeSO4標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別取0.1 mL FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液加入3 mL FRAP工作液，在 37 ℃反應(yīng)30 min，以蒸餾水為空白，測定溶液在593 nm 處吸光度，建立濃度與吸光度的線性回歸方程（y=0.000 7x+0.062 9，r=0.999 6）;用乙醇為溶劑，將VC和Da-Dm配制成一系列待測溶液，將樣品代替FeSO4其余操作方法同上，上述實驗進(jìn)行3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算FRAP值。

1.5.2? DDPH法測定Da-Dm的抗氧化活性? 將DPPH配制成25 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，稀釋成不同濃度，以95%乙醇為空白，測定上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在517 nm處的吸光度，建立濃度與吸光度的線性回歸方程（y=0.031 6x+0.007 2， r=0.9996）。用乙醇為溶劑，將VC和Da-Dm配制成一系列待測溶液，取各濃度溶液0.2 mL加入3 mL 25 μg/mL的DPPH溶液，混勻，在37 ℃的水浴中避光反應(yīng)30 min，測定樣品吸光度為Ai，空白組為等體積的乙醇溶液代替DPPH溶液，測得吸光度為Aj，以乙醇代替樣品加入DPPH溶液測得吸光度為As，測定波長為517 nm，平行測定3次，根據(jù)公式計算清除率I。

I=[1-（Ai-Aj）/As]×100%

1.6? 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，實驗數(shù)據(jù)以“x±s”表示，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? Da-Dm對LPS誘導(dǎo)后RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示：當(dāng)Da-Dm實驗濃度為1、6、30 μg/mL時，RAW264.7細(xì)胞存活率為101.0%～114.9%，說明各濃度下的藥物對細(xì)胞無毒性。另外，與空白組比較，LPS作用后RAW264.7細(xì)胞活力下降，細(xì)胞增殖受到抑制（P<0.01）。與LPS組相比較，加入DM及Da-Dm 24 h后各實驗組能均能使細(xì)胞增殖抑制狀態(tài)有所恢復(fù)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），說明實驗濃度下的藥物對RAW264.7細(xì)胞有顯著的保護(hù)作用。見圖1。

2.2? Da-Dm對NO釋放量的影響

Griess法結(jié)果顯示，正常RAW264.7細(xì)胞上清液中只含有少量的NO，當(dāng)給與LPS刺激后，LPS組細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO含量較空白組顯著提高（P<0.01），體外炎癥模型建立成功。與LPS組相比，加入DM及1、6、30 μg/mL的Da-Dm 24 h后各實驗組均能顯著抑制NO產(chǎn)生（P<0.05），并呈量效關(guān)系。見圖2。

2.3? Da-Dm對炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的影響

LPS可激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌一系列炎癥因子，炎癥因子的分泌是評價炎癥嚴(yán)重程度的一個量化指標(biāo)，如圖3所示，空白組IL-1β、IL-6及TNF-α質(zhì)量濃度均較低，經(jīng)LPS刺激后三者釋放均顯著增加（P<0.01）。用10 μM的DM及1、6、30 μg/mL的Da-Dm處理RAW264.7細(xì)胞后，與LPS組相比，加入DM及Da-Dm 24 h后各實驗組釋放的炎癥因子含量均顯著降低（P<0.05，P<0.01）（除TNF-α實驗中1 μg/mLDa-Dm組），并呈量效關(guān)系。見圖3。

2.4? FRAP法測定Da-Dm的抗氧化活性

由于FRAP法不是針對某一種自由基清除能力，而是樣品總的還原能力，因此可用來反映樣品總的抗氧化活性[8]，實驗結(jié)果表明對鐵還原能力強(qiáng)弱順序為VC>Da-Dm，二者的總抗氧化值與濃度呈正比，雖然Da-Dm對鐵的還原能力不及VC，但其也表現(xiàn)出較好的還原能力，見圖4。

2.5? Da-Dm清除DPPH自由基的活性

為了更準(zhǔn)確地評價樣品間的抗氧化活性，常用清除50%自由基時的溶液質(zhì)量濃度IC50來比較，較低的IC50值說明具有較高的自由基清除能力[9]。在實驗濃度范圍內(nèi)，對DPPH自由基清除能力的強(qiáng)弱順序為Vc>Da-Dm，且其濃度與清除率呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系，Vc及Da-Dm的IC50分別為57.8 μg/mL和318.1 μg/mL。說明Da-Dm對自由基有較好的清除能力，能起到較好的抗氧化作用。見表1。

3 討論

炎癥反應(yīng)是由多種化學(xué)因子共同參與調(diào)節(jié)的，與其具有最密切聯(lián)系的炎癥介質(zhì)與炎癥因子是NO、TNF-α、IL-1β和IL-6[10]。NO在缺氧、炎癥和腫瘤等情況下被大量表達(dá)，過量表達(dá)的NO會與超氧陰離子O2-反應(yīng)，然后生成過氧化亞硝酸鹽，從而導(dǎo)致局部組織產(chǎn)生損傷，其進(jìn)一步介導(dǎo)了炎癥的發(fā)生發(fā)展，細(xì)胞內(nèi)NO的含量可作為反映炎癥損傷程度的一種指標(biāo)[11]。TNF-α是一種促炎因子，當(dāng)體內(nèi)的TNF-α處于低濃度時，可通過自分泌的方式調(diào)節(jié)白細(xì)胞功能，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生;而當(dāng)TNF-α處于高濃度時，可進(jìn)入血液循環(huán)中促進(jìn)機(jī)體的體溫升高，TNF-α也可促進(jìn)中性粒細(xì)胞的粘附及吞噬功能，促進(jìn)細(xì)胞的呼吸爆發(fā)，并協(xié)助其它細(xì)胞因子（IL-6、IL-1等）的表達(dá)[12]。IL-1β可以促進(jìn)組織的損傷，介導(dǎo)炎性細(xì)胞進(jìn)入病變組織部位，促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素等因子而引發(fā)全身反應(yīng)，IL-1β還可促進(jìn)巨噬細(xì)胞對抗原的識別，吸引中性粒細(xì)胞，并且促進(jìn)炎性介質(zhì)的釋放[13]。IL-6在炎癥反應(yīng)初期被大量的表達(dá)，它能使中性粒細(xì)胞活性降低，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的進(jìn)程被加速[14]。本實驗以炎性因子TNF-α、IL-6 和IL-1β及炎性介質(zhì)NO作為檢測指標(biāo)，來評價Da-Dm的抗炎效果，結(jié)果表明，Da-Dm能顯著抑制NO、IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)，并且呈劑量依懶性，說明Da-Dm抗炎作用的產(chǎn)生可能與抑制NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放有關(guān)。

自由基是一群具有一個或多個不成對電子且單獨(dú)存在極短暫的原子、分子、離子或者原子團(tuán)，正常情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除處于動態(tài)平衡中，但是當(dāng)自由基產(chǎn)生過多或消除過慢時，會造成機(jī)體在分子水平、細(xì)胞水平及組織水平的損傷而誘發(fā)疾病。在抗氧化實驗中Da-Dm表現(xiàn)出了較好的清除DPPH自由基能力及FRAP抗氧化能力。

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