席加喜 張華君 陳曉宇 楊玉芳

摘 要 目的：研究三七總皂苷（PNS）對順鉑致腎損傷模型大鼠腎組織纖維化的改善作用及對相關因子的影響。方法：將72只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥物組和PNS低、中、高劑量組，每組12只。除空白組外，其余各組大鼠采用順鉑尾靜脈注射（3 mg/kg×4次）建立腎損傷模型。從首次注射順鉑后第1天開始，陽性組大鼠腹腔注射安磷汀溶液（1.0 mg/kg），PNS各劑量組大鼠腹腔注射PNS溶液（15.63、31.35、62.70 mg/kg），空白組和模型組大鼠注射等體積生理鹽水，給藥體積均為0.2 mL，連續(xù)給藥60 d。收集大鼠24 h尿液，檢測β-N-乙酰胺基葡萄糖苷酶（NAG）、24 h尿蛋白（Upro/24 h）含量；檢測大鼠血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）含量；采用逆轉錄熒光聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和免疫組化法分別檢測大鼠腎組織中結締組織生長因子（CTGF）、轉化生長因子β1（TGF-β1）、Ⅰ型膠原（Col-1）、金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）、纖溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）的mRNA和蛋白表達水平。結果：與空白組比較，模型組大鼠尿液中NAG、Upro/24 h含量，血清中Scr、BUN含量，以及腎組織中CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，PNS各劑量組大鼠上述尿液和血清生化指標含量均顯著降低；PNS各劑量組大鼠腎組織中CTGF、TGF-β1的mRNA表達水平和CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1蛋白表達水平，PNS高劑量組Col-1的mRNA表達水平，PNS中、高劑量組TIMP-1的mRNA表達水平和PAI-1蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05）。與陽性組比較，PNS中、高劑量組大鼠尿液中NAG、Upro/24 h含量顯著降低（P<0.05）。結論：PNS能有效改善順鉑致腎損傷模型大鼠的腎功能，其可能通過下調腎組織中腎纖維化相關性因子CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1的表達，從而發(fā)揮減輕順鉑致腎纖維化的作用。

關鍵詞 三七總皂苷；順鉑；腎纖維化；結締組織生長因子；轉化生長因子β1；Ⅰ型膠原；金屬蛋白酶組織抑制因子1；纖溶酶原激活物抑制物1；大鼠

Improvement Effects of Panax Notoginsenosides on Renal Fibrosis in Cisplatin-induced Renal Injury Rats and Its Effects on the Expression of Renal Fibrosis Related Factors

XI Jiaxi1，ZHANG Huajun1，CHEN Xiaoyu1，YANG Yufang2（1. Dept. of Pharmacy， Guangxi Zhuang Autonomous Region People’s Hospital， Nanning 530021， China； 2. Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530021， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study improvement effects of Panax notoginsenoside（PNS） on cisplatin-induced renal injury model rats and its effects on related factors. METHODS： Totally 72 SD rats were randomly divided into blank group， model group， positive drug group and PNS low-dose， medium-dose， high-dose groups， with 12 rats in each group. Except for blank group， other groups were given cisplatin via tail vein （3 mg/kg×4 times） to establish renal injury model. Since the first day after the first injection of cisplatin， positive group was given anfostine solution intraperitoneally （1.0 mg/kg）； PNS groups were given PNS solution intraperitoneally （15.63， 31.35， 62.70 mg/kg）； blank group and model groups were given constant volume of normal saline 0.2 mL， for consecutive 60 d. The 24 h urine of rats was collected； the contents of β-N-acetylaminoglycosidase（NAG） and 24 h urine protein （Upro/24 h） were detected； the serum contents of Scr and BUN were detected. mRNA and protein expression of CTGF， TGF-β1， Col-1， TIMP-1 and PAI-1 in renal tissue were determined by RT-PCR and immunohistochemistry respectively. RESULTS： Compared with blank group， the contents of NAG and Upro/24 h in urine， serum contents of Scr and BUN， mRNA and protein expression levels of CTGF， TGF-β1， Col-1， TIMP-1 and PAI-1 in renal tissue were increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the contents of above urine and serum biochemical indicators were decreased significantly in PNS groups； mRNA expression of CTGF and TGF-β1 and protein expression of CTGF， TGF-β1， Col-1 and TIMP-1 in renal tissue of rats in PNS groups， mRNA expression of Col-1 in PNS high-dose group， and mRNA expression of TIMP-1 and protein expression of PAI-1 in PNS medium-dose and high-dose groups were decreased significantly （P<0.05）. Compared with positive group， the contents of NAG and Upro/24 h in urine were decreased significantly in PNS medium-dose and high-dose groups （P<0.05）. CONCLUSIONS： PNS can effectively improve the renal function of cisplatin-induced renal injury model rats， and relieve cisplatin-induced renal fibrosis by decreasing the expression of renal fibrosis related factors as CTGF， TGF-β1， Col-1， TIMP-1 and PAI-1 in renal tissue.

KEYWORDS Panax notoginsenosides； Cisplatin； Renal fibrosis； Connective tissue growth factor； Transforming growth factor β1； Type Ⅰ collagen； Tissue inhibitor of metalloproteinase 1； Plasminogen activator inhibitor 1； Rat

順鉑是臨床常用的廣譜化療藥物，也是聯(lián)合化療方案的重要組成，對各種實體瘤具有良好的療效，是治療肺癌、胰腺癌、頭頸部腫瘤的一線選擇[1-2]，是乳腺癌等腫瘤多線治療的主要藥物[3]。順鉑作為第一代鉑類藥物，臨床不良反應明顯，常見有腎功能損傷、胃腸道反應、骨髓抑制等[4]。其中腎毒性是順鉑的劑量限制性毒性，與劑量成正比，病理表現(xiàn)為腎小管上皮細胞壞死、變性和腎間質水腫等[5]，但其機制目前尚不明確。三七總皂苷（PNS）是中藥三七的提取物，含有人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1等多種單體皂苷成分，具有抗炎、抗心血管、改善微循環(huán)、抗腫瘤以及抗氧化等藥理活性[6-8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PNS能有效降低順鉑致腎損傷大鼠尿液中β-N-乙酰胺基葡萄糖苷酶（NAG）、尿蛋白水平，降低血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平，并能升高腎組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）水平，降低丙二醛（MAD）水平，提示其能通過抗氧化作用改善順鉑致腎損傷[9]。在上述研究過程中發(fā)現(xiàn)，大鼠腎組織出現(xiàn)輕微纖維化，而以往未見順鉑致腎損傷大鼠出現(xiàn)腎纖維化改變的文獻報道?；诖?，本研究通過延長大鼠造模時間和藥物處理時間，并檢測腎纖維化相關因子如重組結締組織生長因子（CTGF）、轉化生長因子β1（TGF-β1）、Ⅰ型膠原（Col-1）、金屬蛋白酶組織抑制物1（TIMP-1）、纖溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）的變化，以考察順鉑長期給藥可否導致大鼠腎纖維化和PNS對這一病理變化的改善作用及機制。

1 材料

1.1 儀器

DS-88型電子秤（武漢自動化儀表廠）；KD-BM型包埋機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；RM2016型切片機（上海徠卡儀器有限公司）；聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Life Technologies公司）；Thermo Forma 725型超低溫冰箱（美國Forma公司）；WH-1型微型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠）；5810R型高速冷凍多用途離心機（德國 Eppendorf公司）。

1.2 藥品與試劑

PNS粉末（中恒集團梧州制藥有限公司，批號：20110115）；注射用順鉑（齊魯制藥有限公司，批號：1020032DB，規(guī)格：20 mg）；注射用安磷?。ù筮B美羅大藥廠，批號：53110301，規(guī)格：0.4 g）；NAG檢測試劑盒、尿蛋白檢測試劑盒、Scr檢測試劑盒、BUN檢測試劑盒（南京建成生物有限公司）；cDNA 逆轉錄試劑盒（美國Fermentas公司）；兔抗大鼠CTGF多克隆抗體、兔抗大鼠Col-1多克隆抗體、兔抗大鼠PAI-1多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體、兔抗大鼠TIMP-1多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；PCR Marker100-600（廣州東盛生物科技有限公司）；PCR擴增引物、5×TBE電泳緩沖液[生工生物工程（上海）有限公司]；瓊脂糖（西班牙Biowest 公司）；氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，規(guī)格：500 mL ∶ 4.5 g；可作生理鹽水使用）；其余試劑為分析純或實驗室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 動物

成年健康雄性SD大鼠，體質量160～180 g，購自廣西醫(yī)科大學醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（桂）2014-0002。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將72只大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性組和PNS低、中、高劑量組，每組12只?？瞻捉M大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水；其余各組大鼠尾靜脈注射順鉑溶液（3 mg/kg，臨用前以生理鹽水溶解制備，劑量根據(jù)成人單個療程總劑量換算并結合預實驗結果制定）0.2 mL，每2周（14 d）注射1次，連續(xù)4次，以建立順鉑致腎損傷大鼠模型。從首次注射順鉑后第1天開始，陽性組大鼠腹腔注射安磷汀溶液（1.0 mg/kg，臨用前以生理鹽水溶解制備，劑量按藥品說明書的成人劑量換算制定），PNS各劑量組大鼠腹腔注射PNS溶液（15.63、31.35、62.70 mg/kg，臨用前以生理鹽水溶解制備，劑量按前期研究結合預實驗結果制定），給藥體積均為0.2 mL，連續(xù)給藥60 d；空白組和模型組大鼠同法注射等體積生理鹽水。

2.2 大鼠尿液中NAG、24 h尿蛋白含量的檢測

末次給藥后，收集大鼠24 h尿液，3 500 r/min離心10 min，取上清液，嚴格按照相應試劑盒說明書要求操作，采用硝基酚比色法檢測NAG含量，采用考馬斯亮藍法檢測24 h尿蛋白（Upro/24 h）含量。

2.3 大鼠血清中Scr、BUN含量的檢測

在收集完大鼠24 h尿液后，以20%烏拉坦麻醉大鼠，于其腹主動脈取血，3 500 r/min離心10 min，取上層血清，嚴格按照相應試劑盒說明書要求操作，以苦味酸法檢測Scr含量，以二乙酰一肟法檢測BUN含量。

2.4 大鼠腎組織中CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1的mRNA表達檢測

2.4.1 腎組織總RNA的提取和測定 大鼠腹主動脈取血后，在腎動脈分支以下行腹主動脈插管，夾閉腎動脈分支以上的近心段，剪開左腎靜脈，以2～4 ℃的生理鹽水原位灌洗腎臟。待腎臟顏色由紅變白后，剪下右側腎臟，并沿中線切開，一半立即液氮罐保存，用于提取RNA和PCR檢測，另一半置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于石蠟切片和免疫組化檢測。

取液氮罐中腎組織解凍，按下列步驟提取總RNA：腎組織（20～30 mg）加 Trizol試劑冰浴勻漿，加氯仿震蕩，2～4 ℃低溫靜置，并在低溫下12 000 r/min離心15 min。取上層無色水相，加入-20 ℃預冷的異丙醇0.5 mL混勻，靜置30 min，在低溫下12 000 r/min離心10 min。取附壁沉淀加75%乙醇沖洗溶解，溶解液7 500 r/min離心5 min，低溫靜置后除殘留液，加DEPC處理水溶解，得總RNA溶液。取總RNA溶液5 μL加溴酚藍1 μL混勻，90 V條件下以0.1%瓊脂糖凝膠電泳15 min，核酸染料顯色，采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析結果。

2.4.2 RT-PCR檢測 PCR反應體系：cDNA模板，2 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，2×PCR Taq Mix 12.5 μL，以水補充至終體積25 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取上述反應液加樣，100 V條件下以0.1%瓊脂糖凝膠電泳23 min，核酸染料顯色，采用凝膠成像分析系統(tǒng)測定光密度（OD），以目的基因和β-actin條帶OD之比表示目的基因的mRNA表達水平。各引物序列見表1。

2.5 大鼠腎組織中TGF-β1、CTGF、Col-1、TIMP-1、PAI-1的蛋白表達檢測

采用免疫組化法檢測。取“2.4.1”項下固定的腎組織標本，乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋后制作石蠟切片；嚴格按照免疫組化檢測試劑盒說明書操作，于顯微鏡下觀察組織細胞染色情況，以棕褐色染色判斷為陽性染色。采用PTPS-2011彩色病理圖文分析系統(tǒng)計算積分光密度（IOD），作為樣本的免疫組化指數(shù)，用以表示TGF-β1、CTGF、Col-1、TIMP-1、PAI-1的蛋白表達水平。IOD=OD×陽性染色面積。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠尿液和血清生化指標的檢測結果

與空白組比較，模型組大鼠尿中NAG和Upro/24 h、血清Scr和BUN含量均顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組比較，陽性組和PNS各劑量組大鼠尿中NAG和Upro/24 h、血清Scr和BUN含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與陽性組比較，PNS中、高劑量組大鼠尿中NAG和Upro/24 h含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其余指標含量差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠NAG、Upro/24 h、Scr、BUN含量檢測結果見表2。

3.2 各組大鼠腎組織中CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1的mRNA表達水平檢測結果

3.2.1 大鼠總RNA的純度和完整性 提取的總RNA標本經(jīng)測定，OD260/OD280比值在1.8～2.0范圍之內，提示無明顯蛋白質或DNA干擾，符合純度要求。凝膠電泳結果清晰呈現(xiàn)18 S條帶和28 S條帶，提示RNA完整、無降解，符合完整性要求。大鼠總RNA樣本凝膠電泳圖見圖1。

3.2.2 RT-PCR檢測結果 與空白組比較，模型組大鼠腎組織中CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1的mRNA表達水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組比較，陽性組大鼠腎組織中CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1，PNS各劑量組CTGF、TGF-β1，PNS高劑量組Col-1，PNS中、高劑量組TIMP-1的mRNA表達水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其余指標的mRNA表達水平差異均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。陽性組與PNS各劑量組比較，上述指標的mRNA表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠腎組織CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1的mRNA表達水平檢測結果見表3。

3.3 各組大鼠腎組織中CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1蛋白表達水平檢測結果

3.3.1 免疫組化染色現(xiàn)象 顯微鏡下可見，CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1蛋白僅在空白組大鼠的腎小管中呈現(xiàn)微量陽性染色或無染色；上述蛋白在模型組大鼠的腎間質（主要是損傷的腎小管上皮細胞）中陽性染色增多，部分呈強染色；上述蛋白在陽性組和PNS各劑量組大鼠的腎間質（主要是損傷的腎小管上皮細胞）中呈少量陽性染色，且強度減輕。PAI-1在空白組大鼠的少數(shù)血管壁和腎小管呈微量陽性染色或無染色；在模型組大鼠的血管壁和腎小管中的陽性染色增多，且部分呈強染色；在陽性組和PNS各劑量組大鼠的血管壁和腎小管中少量表達，且強度減弱。各組大鼠腎組織中CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1蛋白免疫組化顯微圖見圖2～圖6。

3.3.2 蛋白表達水平 與空白組比較，模型組大鼠CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1的蛋白表達水平均顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與模型組比較，陽性組和PNS各劑量組大鼠腎組織中CTGF、TGF- β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1的蛋白表達水平均顯著降低，除PNS低劑量組的PAI-1外，其余指標差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。陽性組與PNS各劑量組間比較，上述各指標的蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠腎組織中CTGF、TGF-β1、PAI-1、Col-1、TIMP-1 的蛋白表達水平檢測結果見表4。

4 討論

腎纖維化是各類腎臟疾病發(fā)展至終末期的病理學變化之一，病理切片表現(xiàn)為細胞外基質過度沉積于腎間質，并伴有腎小管周圍毛細血管減少、腎小球萎縮、腎單位進行性破壞等[10-11]。目前學術界普遍認為細胞外基質過度沉積是腎纖維化的原因。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，順鉑致腎損傷模型大鼠的病理觀察結果顯示出細胞外基質少量沉積于腎間質，并伴有少量的腎小球萎縮，提示大鼠發(fā)生輕微腎纖維化。為此，后期本課題組設計了驗證實驗，以正常成人患者每周期75 mg/m2、6個周期為1個療程（總劑量為450 mg/m2）進行劑量換算，以順鉑3 mg/kg對大鼠尾靜脈注射，每2周注射1次，結果6周后即可觀察到大鼠發(fā)生腎纖維化。

研究發(fā)現(xiàn)，腎組織細胞外基質的降解主要依賴兩大纖溶酶系統(tǒng)，即基質金屬蛋白酶（MMP）系統(tǒng)和纖溶酶原激活物（PA）系統(tǒng)。MMP能降解大部分基質，但其可被TIMP所抑制而導致活性降低[12]。TIMP有多種，其中TIMP-1和TIMP-2是基質降解平衡中的關鍵[13]。PA可激活纖溶酶原轉化為纖溶酶而起到降解細胞外基質的作用，但可被生理性抑制物PAI-1所抑制而導致其活性降低、降解作用減弱[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，CTGF和TGF-β1對腎小管和腎小球上皮細胞均具有促進和抑制細胞有絲分裂、增殖的雙重作用，且對細胞外基質的合成和沉積也有較強的刺激作用，在調節(jié)細胞外基質代謝及腎間質纖維化方面起到重要作用[15-16]。

近年來，中藥在腎纖維化的保護作用的相關研究報道眾多，多種中藥有效成分對各種原因導致的腎纖維化均顯示出良好療效[17]，中藥制劑等也顯示出對腎纖維化的治療作用[18]。PNS為中藥三七的提取物，具有廣泛的藥理作用，其對單側輸尿管梗阻、阿霉素導致的腎纖維化[19-20]等具有保護作用。

尿液NAG、Upro/24 h和血清Scr、BUN是常用的腎功能判定指標。本研究結果顯示，造模后大鼠尿液中NAG、Upro/24 h和血清Scr、BUN的含量均顯著增高，提示順鉑導致了大鼠腎損傷；給予PNS干預后，大鼠上述指標含量均顯著降低，表明PNS能減輕大鼠腎損傷。結合前期研究結果，考慮這一作用可能與降低體內氧化應激反應有關。

腎小管上皮細胞轉分化并誘發(fā)肌成纖維細胞的形成是腎小管病理改變和腎纖維化發(fā)生的主要機制[21]，而細胞因子在腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中也起到了重要推動作用[22]。本研究采用免疫組化法和RT-PCR法證實，造模后大鼠腎組織中CTGF、TGF-β1的mRNA表達水平和CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1的蛋白表達水平均顯著降低，提示其可能通過下調Col-1、TIMP-1、PAI-1的表達來減少細胞外基質的降解，并通過下調CTGF、TGF-β1來抑制腎小管上皮細胞的增殖，從而導致腎纖維化。給予PNS干預后，大鼠腎組織中CTGF、TGF-β1的mRNA表達水平和CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1的蛋白表達水平均明顯升高，提示其可能通過上調CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1的表達，來減少細胞外基質的沉積并促進腎小管上皮細胞增殖，從而減輕腎纖維化。

本研究結果還顯示，高劑量PNS在改善腎功能方面（NAG、Upro/24 h）優(yōu)于陽性對照藥物，但對CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1的蛋白表達的影響差異均無統(tǒng)計學意義。氨磷汀是臨床推薦使用的順鉑腎毒性保護劑，其通過抗氧化作用降低機體氧化應激反應而減少腎損傷；而PNS具有廣泛的藥理作用，除了抗氧化作用，還能改善微循環(huán)等，提示其改善順鉑致大鼠腎纖維化是多種藥理作用的共同結果。

綜上所述，PNS能有效改善順鉑致腎損傷模型大鼠的腎功能，其可能通過下調腎組織中腎纖維化相關性因子CTGF、TGF-β1、Col-1、TIMP-1、PAI-1的表達，從而發(fā)揮減輕順鉑致腎纖維化的作用。

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（收稿日期：2018-10-06 修回日期：2019-03-04）

（編輯：段思怡）