高欽 丁紅光 孫福生 楊志宏 王井 丁慧婷 高華 鞠傳霞

摘 要 目的：觀察低分子量硫酸軟骨素（CS）對(duì)1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）致帕金森?。≒D）模型小鼠多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用。方法：將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、MPTP損傷組以及低分子量CS低、高劑量組（100、400 mg/kg）。對(duì)照組和MPTP損傷組小鼠均灌胃等容生理鹽水，各給藥組小鼠均灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)17 d。自給藥后第11天開始，除對(duì)照組外，其余各組小鼠均于給藥后腹腔注射MPTP溶液（20 mg/kg），每天1次，連續(xù)5 d，以復(fù)制PD模型。末次給藥后，采用轉(zhuǎn)棒式疲勞儀評(píng)價(jià)小鼠（每組10只）行為學(xué)的改變情況，采用免疫組織化學(xué)法和免疫熒光法檢測(cè)小鼠（每組3只）中腦黑質(zhì)中多巴胺神經(jīng)元的損傷情況[酪氨酸羥化酶（TH）陽(yáng)性細(xì)胞百分比、熒光強(qiáng)度百分比]，采用高效液相色譜法檢測(cè)小鼠（每組6只）腦紋狀體中多巴胺的含量，采用化學(xué)比色法檢測(cè)小鼠（每組6只）中腦黑質(zhì)中氧化應(yīng)激指標(biāo)[超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）]水平。結(jié)果：與對(duì)照組比較，MPTP損傷組小鼠在轉(zhuǎn)棒上的滯留時(shí)間顯著縮短，中腦黑質(zhì)中TH陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少、熒光強(qiáng)度明顯減弱，其陽(yáng)性細(xì)胞百分比和熒光強(qiáng)度百分比，腦紋狀體中多巴胺的含量以及中腦黑質(zhì)中SOD、GSH-Px的活性均顯著降低，MDA的含量顯著升高（P<0.01）。與MPTP損傷組比較，低分子量CS各劑量組小鼠在轉(zhuǎn)棒上的滯留時(shí)間顯著延長(zhǎng)，中腦黑質(zhì)中TH陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加、熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，其陽(yáng)性細(xì)胞百分比、熒光強(qiáng)度百分比以及腦紋狀體中多巴胺的含量均顯著升高，且高劑量組上述指標(biāo)均顯著長(zhǎng)于或高于低劑量組（P<0.05或P<0.01）；低分子量CS各劑量組小鼠中腦黑質(zhì)中SOD、GSH-Px的活性均顯著升高，低分子量CS高劑量組小鼠中腦黑質(zhì)中MDA的含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：預(yù)防性給予低分子量CS可劑量依賴性地減輕MPTP致PD模型小鼠中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的損傷，增加其腦紋狀體中多巴胺的分泌。這種作用可能與抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、提高組織的抗氧化能力相關(guān)。

關(guān)鍵詞 低分子量硫酸軟骨素；中腦黑質(zhì)；腦紋狀體；多巴胺能神經(jīng)元；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶；酪氨酸羥化酶；氧化應(yīng)激；帕金森??；小鼠

Neuroprotective Effects of Low-molecular-weight Chondroitin Sulfate on Dopaminergic Neurons in MPTP-induced Parkinson’s Disease Model Mice

GAO Qin1，DING Hongguang2，SUN Fusheng3，YANG Zhihong1，WANG Jing1，DING Huiting1，GAO Hua1，JU Chuanxia1（1. School of Pharmacy， Qingdao University， Shandong Qingdao 266012， China； 2. Dept. of General Surgery， Qingdao Municipal Hospital， Shandong Qingdao 266011， China； 3. Dept. of Pharmacy， Qingdao Municipal Hospital， Shandong Qingdao 266011， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To observe neuroprotective effects of low-molecular-weight chondroitin sulfate （CS） on dopaminergic neurons in Parkinson’s disease （PD） mice model induced by 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine （MPTP）. METHODS： C57BL/6 mice were randomly divided into control group， MPTP injury group， low-molecular-weight CS low-dose and high-dose groups （100， 400 mg/kg）. Control group and MPTP injury group were given constant volume of normal saline intragstrically， administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 17 d. Since 11th day after medication， except for control group， other groups were given MPTP solution （20 mg/kg） intraperitoneally to induce PD model， once a day， consecutive 5 d. After last medication， behavioral changes of mice （10 mice in each group） were evaluated by rotary rod fatigue tester. The damage of dopamine neurons （the percentage of TH positive cell and the percentage of fluorescence intensity） in substantia nigra of mice （3 mice in each group） was detected by immunohistochemistry and immunofluorescence. The content of dopamine in striatum was determined by HPLC （6 mice in each group）. The changes of oxidant stress indexes （SOD， GSH-Px， MDA） in substantia nigra of mice were determined by chemical colorimetry （6 mice in each group）. RESULTS： Compared with control group， retention time of mice on rotating rods was shortened significantly in MPTP injury group； TH positive cells of substantia nigra were decreased significantly， fluorescence intensity was obviously weakened； the percentage of positive cells and fluorescence intensity， the content of dopamine in striatum， the activities of SOD and GSH-Px in substantia nigra were decreased significantly， while the content of MDA was increased significantly （P<0.01）. Compared with MPTP injury group， retention time of mice on the rotating rods was prolonged significantly in low-molecular-weight CS groups， the number of TH positive cells was increased significantly in substantia nigra and fluorescence intensity was increased significantly； the percentage of positive cells， the percentage of fluorescence intensity and the content of dopamine in striatum were increased significantly， while above indexes of high-dose group were significantly longer or higher than those of low-dose group （P<0.05 or P<0.01）. The activities of SOD and GSH-Px in substantia nigra were increased significantly in low-molecular-weight CS groups， while the content of MDA in substantia nigra was decreased significantly in low-molecular-weight CS high-dose group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Prophylactic administration of low-molecular-weight CS can relieve the damage of dopaminergic neurons in substantia nigra of PD model mice induced by MPTP in a dose-dependent manner， and increase the secretion of dopamine in striatum. The effect may be related to the inhibition of lipid peroxidation and the enhancement of antioxidant capacity of tissues.

KEYWORDS Low-molecular-weight chondroitin sulfate； Substantia nigra； Striatum； Dopaminergic neurons； 1-methyl-4-phenyl- 1，2，3，6-tetrahydropyridine； Tyrosine hydroxylase； Oxidant stress； Parkinson’s disease； Mice

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為肌肉強(qiáng)直、靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩等，其主要病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元丟失，從而導(dǎo)致紋狀體軸突末梢多巴胺耗竭[1]。隨著全球人口老齡化進(jìn)程的加快，PD的發(fā)病率逐年上升[2]，且目前尚無(wú)足夠成熟的有效藥物能夠阻止或逆轉(zhuǎn)PD病情的進(jìn)展。雖然PD的病因和發(fā)病機(jī)制并未闡明，但氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等機(jī)制共同參與了PD發(fā)病過(guò)程中多巴胺能神經(jīng)元的損傷[3-4]。因此，具有抗炎、抑制細(xì)胞凋亡等藥理活性的物質(zhì)均可作為PD治療的潛在候選藥物。

硫酸軟骨素（Chondroitin sulfate，CS）是廣泛分布于動(dòng)物組織細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞表面的一類糖胺聚糖，由N-乙酰氨基半乳糖和葡糖醛酸組成，具有抗氧化、抗炎、清除自由基、改善線粒體功能障礙等多種藥理活性，可用于防治冠心病、心絞痛、心肌梗死、關(guān)節(jié)炎、角膜炎、耳聾耳鳴、神經(jīng)痛等疾病[5-6]。此外，CS還具有神經(jīng)保護(hù)作用，能促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)[7]；能延遲興奮性氨基酸誘導(dǎo)的皮層和海馬神經(jīng)元死亡[8]；能拮抗慢性氟中毒所致的神經(jīng)損害[9]；能有效抑制β-淀粉樣蛋白25-35對(duì)PC12細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用，并明顯改善β-淀粉樣蛋白1-40所致老年癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙[10]；能改善慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激所致小鼠的抑郁癥狀[11]。本課題組及其他研究團(tuán)隊(duì)分別利用6-羥基多巴胺、過(guò)氧化氫及過(guò)表達(dá)α-突觸核蛋白損傷SH-SY5Y細(xì)胞多巴胺能神經(jīng)元，建立PD細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)CS在體外可明顯減輕SH-SY5Y細(xì)胞的損傷，并可提高其生存率，且這種作用主要是通過(guò)抗氧化應(yīng)激和抗線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的[12-14]。由此推測(cè)，CS可能對(duì)中腦黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用。

高分子量CS由于黏度高、結(jié)構(gòu)復(fù)雜以及細(xì)胞膜選擇通透性等因素，使得其生物利用度低、口服吸收差及療效不穩(wěn)定，而低分子量CS具有生物利用度高和活性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[15]。因此，本研究以1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的PD模型小鼠為對(duì)象，初步評(píng)價(jià)預(yù)防性應(yīng)用低分子量CS對(duì)小鼠體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用，以期為挖掘CS防治PD的藥理活性提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Ti型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；Fluoview FV500型激光共聚焦掃描顯微鏡（日本Olympus公司）；600-717-2465型高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)Waters公司）；RM2255型自動(dòng)石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZWY-240型恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司）；5424型低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；X1R型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；03061836型渦旋混合器（美國(guó)Labnet公司）；754型紫外-可見分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；ZS-YLS-4C型轉(zhuǎn)棒式疲勞儀（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）。

1.2 藥品與試劑

低分子量CS（青島貝爾特生物科技有限公司，批號(hào)：20140912，純度：95%，分子量：4 296 Da）；MPTP、多巴胺、Triton X-100溶液（美國(guó)Sigma公司）；兔抗小鼠酪氨酸羥化酶（TH）抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；生物素標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（欣博盛生物科技有限公司）；親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）試劑盒（上海新睿生物科技有限公司）；Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（美國(guó)Invitrogen公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；山羊血清、DAB染色液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；蘇木精染色液（北京索萊寶科技有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）、磷酸鹽聚山梨酯緩沖溶液（PBST，pH 7.5）均由本實(shí)驗(yàn)室自制；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，8周齡，體質(zhì)量20～22 g，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2011-0003]。所有動(dòng)物均于（22±2）℃、12 h光照/黑暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)，并自由進(jìn)食、飲水。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

所有小鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組、MPTP損傷組以及低分子量CS低、高劑量組（100、400 mg/kg，劑量設(shè)置參考本研究前期研究結(jié)果[11]）。對(duì)照組和MPTP損傷組小鼠均灌胃等容生理鹽水，各給藥組小鼠均灌胃相應(yīng)藥物（以生理鹽水為溶劑），每天1次，連續(xù)17 d。自給藥后第11天開始，除對(duì)照組外，其余各組小鼠均于給藥后腹腔注射MPTP溶液（20 mg/kg，以生理鹽水為溶劑），每天1次，連續(xù)5 d，以復(fù)制PD模型。

2.2 旋轉(zhuǎn)法測(cè)試各組小鼠行為學(xué)改變情況

按“2.1”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，每組10只。末次給藥后，采用轉(zhuǎn)棒式疲勞儀測(cè)試各組小鼠行為學(xué)的改變情況。設(shè)置轉(zhuǎn)棒式疲勞儀的轉(zhuǎn)速為40 r/min，每只小鼠連續(xù)測(cè)試5次，每次測(cè)試間隔1 min，記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒式疲勞儀上的停留時(shí)間，取5次測(cè)試結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果。正式測(cè)試之前，所有小鼠應(yīng)均適應(yīng)性測(cè)試5次。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元損傷情況

按“2.1”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，每組3只。末次給藥后，以10%水合氯醛（2.5 mL/kg）進(jìn)行麻醉，于左心室依次灌注生理鹽水15 mL和4 ℃的4%多聚甲醛溶液15 mL后，斷頭取腦。腦組織置于4 ℃的4%多聚甲醛溶液中固定過(guò)夜，隨后依次轉(zhuǎn)移至10%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液中，直至下沉。腦組織經(jīng)石蠟包埋后，于中腦黑質(zhì)部位行冠狀連續(xù)切片（厚度約為20 μm），切片于室溫下用3%過(guò)氧化氫處理10 min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，隨后用PBS清洗5 min×3次，再置于封閉液（含0.2%Triton X-100溶液和10%山羊血清，以PBS為溶劑）中封閉1 h后，加入TH抗體（1 ∶ 4 000），于4 ℃孵育過(guò)夜；用PBS清洗后，加入生物素標(biāo)記二抗（1 ∶ 1 000），于室溫下孵育30 min，用ABC試劑盒按其說(shuō)明書進(jìn)行染色，以DAB顯色、蘇木精復(fù)染；經(jīng)乙醇梯度脫水后，以中性樹脂封片，置于倒置熒光顯微鏡下觀察。每只小鼠隨機(jī)選取5張切片、每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)（染色后顯紫紅色的即為TH陽(yáng)性細(xì)胞），每個(gè)視野計(jì)數(shù)2次，取其平均值為TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；同時(shí)，計(jì)算TH陽(yáng)性細(xì)胞百分比，即各試驗(yàn)組與對(duì)照組TH陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。

2.4 免疫熒光法檢測(cè)各組小鼠中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元損傷情況

按“2.1”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，每組3只。末次給藥后，按“2.3”項(xiàng)下方法取腦。腦組織于中腦黑質(zhì)部位行冠狀連續(xù)冰凍切片（厚度約為20 μm），將切片放至含有PBS的24孔培養(yǎng)板中，置于恒溫?fù)u床（室溫，轉(zhuǎn)速60 r/min，下同）上，用PBST清洗5 min×3次，加入TH抗體（1 ∶ 2 000）后，于4 ℃孵育過(guò)夜；用PBS清洗5 min×3次，加入Alexa Fluor 488標(biāo)記二抗（1 ∶ 2 000），置于恒溫?fù)u床上于室溫下孵育2 h；用PBST清洗5 min×3次。以70%甘油封片后，用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察并記錄熒光強(qiáng)度（染色后顯紅色的即為TH陽(yáng)性細(xì)胞，其熒光強(qiáng)度越高，表明多巴胺能神經(jīng)元損傷越輕），并計(jì)算熒光強(qiáng)度百分比（即各試驗(yàn)組與對(duì)照組熒光強(qiáng)度的百分比）。

2.5 HPLC法檢測(cè)各組小鼠腦紋狀體中多巴胺含量

按“2.1”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，每組6只。末次給藥后，按“2.3”項(xiàng)下方法取腦。取腦組織適量，于冰上分離紋狀體，置于液氮中冷凍，于-80 ℃保存，備用。取紋狀體組織適量，加入0.4 mol/L高氯酸溶液300 μL預(yù)處理后，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）勻漿10 s，在冰浴條件下靜置1 h，于4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，取上清液240 μL，加入樣品預(yù)處理液（含20 mmol/L檸檬酸鉀、300 mmol/L磷酸氫二鉀、2 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，以水為溶劑）120 μL，渦旋混勻，12 000 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：色譜柱為SymmetryshieldTM RP18（250 mm×4.60 mm，5 μm），檢測(cè)器為電子俘獲檢測(cè)器（ECD），檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。參考文獻(xiàn)[16]行方法學(xué)考察，多巴胺檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為1.78～156.50 mg/mL（r=0.945 7），定量下限為1.78 mg/mL，精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等均符合2015年版《中國(guó)藥典》（四部）[17]的相關(guān)要求。

2.6 化學(xué)比色法檢測(cè)各組小鼠中腦黑質(zhì)中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平

按“2.1”項(xiàng)下方法分組、造模與給藥，每組6只。末次給藥后，按“2.3”項(xiàng)下方法取腦。取腦組織適量，于冰上分離中腦黑質(zhì)并以PBS制成10%組織勻漿，于4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，收集上清液，于-80 ℃保存，備用。采用化學(xué)比色法、以紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)中腦黑質(zhì)中SOD、GSH-Px活性以及MDA含量，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書操作。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 低分子量CS對(duì)PD模型小鼠行為學(xué)的影響

與對(duì)照組比較，MPTP損傷組小鼠在轉(zhuǎn)棒式疲勞儀上的停留時(shí)間顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與MPTP損傷組比較，低分子量CS各劑量組小鼠停留時(shí)間均顯著延長(zhǎng)，且高劑量組顯著長(zhǎng)于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見表1。

3.2 低分子量CS對(duì)PD模型小鼠中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元損傷的影響

與對(duì)照組比較，MPTP損傷組小鼠中腦黑質(zhì)中TH陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)均明顯減弱，其TH陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與MPTP損傷組比較，低分子量CS各劑量組小鼠中腦黑質(zhì)中TH陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)均有所增強(qiáng)，其TH陽(yáng)性細(xì)胞百分比均顯著升高，且高劑量組顯著高于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖1、表1。

對(duì)照組小鼠中腦黑質(zhì)中TH陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)清晰，排列密集有序，熒光強(qiáng)度高；MPTP損傷組小鼠中腦黑質(zhì)中TH陽(yáng)性細(xì)胞稀疏、零散，熒光強(qiáng)度明顯降低，其熒光強(qiáng)度百分比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；低分子量CS各劑量組小鼠中腦黑質(zhì)中TH陽(yáng)性細(xì)胞均有所增多，熒光強(qiáng)度均有所升高，其熒光強(qiáng)度百分比均顯著升高，且高劑量組顯著高于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表1。

3.3 低分子量CS對(duì)PD模型小鼠腦紋狀體中多巴胺含量的影響

與對(duì)照組比較，MPTP損傷組小鼠腦紋狀體中多巴胺的含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與MPTP損傷組比較，低分子量CS各劑量組小鼠腦紋狀體中多巴胺的含量均顯著升高，且高劑量組顯著高于低劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.4 低分子量CS對(duì)PD模型小鼠中腦黑質(zhì)中氧化應(yīng)激指標(biāo)水平的影響

與對(duì)照組比較，MPTP損傷組小鼠中腦黑質(zhì)中SOD、GSH-Px活性均顯著降低，MDA含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與MPTP損傷組比較，低分子量CS各劑量組小鼠腦黑質(zhì)中SOD、GSH-Px活性均顯著升高，低分子量CS高劑量組小鼠腦黑質(zhì)中MDA含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

4 討論

MPTP是一種神經(jīng)毒素，可透過(guò)血腦屏障，在腦內(nèi)經(jīng)單胺氧化酶B催化轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚?-甲基-4-苯基-吡啶離子（MPP+），后者可選擇性地通過(guò)高通量多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體積累，從而誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)元凋亡或死亡，最終誘導(dǎo)人和動(dòng)物產(chǎn)生PD癥狀，是PD基礎(chǔ)研究的常用誘導(dǎo)劑[18]。鑒于此，本研究以MPTP致PD模型小鼠為對(duì)象，在前期研究的基礎(chǔ)上，初步探討了低分子量CS對(duì)其體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用，以及對(duì)相關(guān)指標(biāo)的影響。

PD的主要臨床特征包括運(yùn)動(dòng)平衡和協(xié)調(diào)能力受損，其主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失，而多巴胺合成的減少則可進(jìn)一步導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺含量的降低[1，19]。TH是多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)記酶，可通過(guò)觀察中腦黑質(zhì)中TH陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量來(lái)評(píng)估多巴胺能神經(jīng)元的損傷情況[20]。為此，本研究采用免疫組織化學(xué)法和免疫熒光法從不同角度對(duì)各組小鼠中腦黑質(zhì)中TH陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。其中，前者利用生物素標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)顯色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定位、定性、定量；后者則采用熒光素標(biāo)記的已知抗體（或抗原）作為探針，當(dāng)其與待測(cè)組織/細(xì)胞中的靶抗原（或抗體）發(fā)生反應(yīng)后，形成的抗原抗體復(fù)合物可發(fā)射熒光，進(jìn)一步借助熒光定量技術(shù)來(lái)檢測(cè)靶抗原（或抗體）的含量[21]。本研究結(jié)果顯示，MPTP損傷組小鼠在轉(zhuǎn)棒式疲勞儀上的停留時(shí)間較對(duì)照組顯著縮短，中腦黑質(zhì)中的TH陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少，其TH陽(yáng)性細(xì)胞百分比、熒光強(qiáng)度百分比以及腦紋狀體中多巴胺的含量均顯著降低。這表明小鼠出現(xiàn)了明顯的運(yùn)動(dòng)障礙，其中腦黑質(zhì)中的多巴胺神經(jīng)元受到了明顯的損傷，其腦紋狀體中多巴胺的分泌受到了明顯的抑制，提示PD模型復(fù)制成功。經(jīng)低分子量CS預(yù)處理后，各劑量組小鼠在轉(zhuǎn)棒式疲勞儀上停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)，其中腦黑質(zhì)中的TH陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，其TH陽(yáng)性細(xì)胞百分比、熒光強(qiáng)度百分比以及腦紋狀體中多巴胺的含量均顯著升高，且高劑量組顯著長(zhǎng)于或高于低劑量組。這提示低分子量CS可劑量依賴性地對(duì)抗MPTP的神經(jīng)毒性，改善PD模型小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙，減輕其中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的損傷，增加其腦紋狀體中多巴胺的分泌，對(duì)其多巴胺能神經(jīng)元損傷具有一定的保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是PD核心致病因素之一[22]，因此對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷是PD治療的一個(gè)重要方向。已有研究證實(shí)，抗氧化劑（如益智藥等）可改善PD模型動(dòng)物的行為異常[23]。本課題組前期的體外研究結(jié)果顯示，CS可通過(guò)抑制活性氧釋放、增加核內(nèi)核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）蛋白水平、增強(qiáng)抗氧化酶活性等機(jī)制來(lái)保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元[13-14]。由此筆者推測(cè)，CS對(duì)動(dòng)物多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用可能也與上述機(jī)制有關(guān)。為此，本研究檢測(cè)了小鼠中腦黑質(zhì)中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)（SOD、GSH-Px、MDA）水平。其中，SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，可清除自由基，其活性的高低可間接反映機(jī)體清除自由基的能力；GSH-Px在機(jī)體內(nèi)廣泛存在，其可催化谷胱甘肽（GSH）對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，并具有特異性，是一種重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶，可消除過(guò)氧化物對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的干擾和損害；MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其含量的多少可反映組織或細(xì)胞氧化損傷的程度[24-25]。本研究結(jié)果還顯示，MPTP損傷組小鼠中腦黑質(zhì)中SOD、GSH-Px的活性均較對(duì)照組顯著降低，MDA的含量較對(duì)照組顯著升高。這提示小鼠中腦黑質(zhì)受到氧化應(yīng)激損傷。預(yù)防性給予低分子量CS后，各劑量組小鼠中腦黑質(zhì)中SOD、GSH-Px的活性均顯著升高，高劑量組小鼠中腦黑質(zhì)中MDA的含量均顯著降低。這提示低分子量CS對(duì)上述氧化應(yīng)激損傷具有一定的抑制作用。

綜上所述，預(yù)防性給予低分子量CS可劑量依賴性地減輕MPTP致PD模型小鼠中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的損傷，增加其腦紋狀體中多巴胺的分泌。這種作用可能與抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、提高組織抗氧化能力相關(guān)。但本研究只從氧化應(yīng)激的角度探討了低分子量CS抗PD的可能機(jī)制，而其余作用及確切機(jī)制有待后續(xù)研究進(jìn)一步探索。

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（收稿日期：2018-11-10 修回日期：2019-02-01）

（編輯：張?jiān)拢?/p>