張迪 王宏雨 肖冬來(lái) 林衍銓

摘要：[目的]分析繡球菌水溶性多糖的結(jié)構(gòu)與免疫活性。[方法]采用熱水提取法從廣葉繡球菌Sparassislatifolla的真空冷凍干燥品中提取得到繡球菌水溶性多糖SCG-D，然后通過(guò)DEAE Sepharose FastFlow離子交換層析對(duì)其進(jìn)行分離，獲得SCG-N和SCG-A兩個(gè)多糖組分，并對(duì)SCG-A組分進(jìn)行HPSEC、單糖組成分析、紅外光譜、H-NMR和C-NMR核磁共振的結(jié)構(gòu)分析。通過(guò)大鼠脾淋巴細(xì)胞體外刺激活性測(cè)試比較了SCG-D及其組分SCG-A、SCG-N的體外免疫活性差異。[結(jié)果]繡球菌水溶性多糖SCG-D具有促進(jìn)鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的活性，其酸性多糖組分SCG-A促進(jìn)作用最強(qiáng)，其100ug.mL72h處理組的增殖率為32.7%，而SCG-N多糖組分的活性較SCG-A低，其100ug·mL72h處理組增殖率為11.66%。結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明SCG-A的重均分子量為4.30×10Da，其主鏈結(jié)構(gòu)為α-1，4-D-葡聚糖，主要由葡萄糖和半乳糖構(gòu)成，并且還含有一定量的1-6分支結(jié)構(gòu)。[結(jié)論]繡球菌凍干品的水溶性多糖及其組分具有促進(jìn)大鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖的免疫活性，其中活性最強(qiáng)的酸性多糖組分SCG-A是一種具有1-6分支結(jié)構(gòu)的α-l，4-葡聚糖。

關(guān)鍵詞：廣葉繡球菌;多糖;脾淋巴細(xì)胞;免疫

中圖分類(lèi)號(hào)：S646.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0384（2019）09-1093-07

0引言

（研究意義）廣葉繡球菌Sparassis latifolia，屬擔(dān)子菌亞門(mén)Basidiomycotina、異隔擔(dān)子菌綱Heteroba-sidiomycetes、無(wú)（非）褶菌目ApHyllopHorales、繡球菌科Sparassidacea、繡球菌屬Jparassis Fr.。繡球菌具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，繡球菌中含有大量的活性多糖，能夠提高人體免疫力及機(jī)體造血功能，對(duì)某些腫瘤也有一定的預(yù)防和抑制作用。（前人研究進(jìn)展）白辰等的試驗(yàn)結(jié)果表明繡球菌子實(shí)體凍干品的可溶性多糖保留率顯著高于熱風(fēng)干燥品。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)繡球菌子實(shí)體凍干品提取的可溶性多糖和子實(shí)體烘干品中提取的可溶性多糖分子量構(gòu)成也有顯著不同，烘干品可溶性多糖的主要成分在20KDa左右，而凍干品可溶性多糖的分子量主要分布在400KDa左右。脾臟是人體最大的免疫器官，是淋巴細(xì)胞匯集的部位，而淋巴細(xì)胞是機(jī)體的免疫活性細(xì)胞，其激活、分化、增殖在免疫應(yīng)答過(guò)程中起著重要的作用，現(xiàn)有研究結(jié)果表明多糖可以與淋巴細(xì)胞表面多糖受體相結(jié)合，從而影響淋巴細(xì)胞的功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，測(cè)定藥物對(duì)脾淋巴細(xì)胞的影響是快速篩選免疫功能成分的有效手段。（本研究切入點(diǎn)）在之前的研究中所述的具有免疫調(diào)節(jié)活性的繡球菌B-葡聚糖是一種由強(qiáng)堿溶液提取的大分子量葡聚糖，其分子量在200萬(wàn)Da以上，主要結(jié)構(gòu)是帶有6分支結(jié)構(gòu)的β-1，3-葡聚糖，難溶于水，低濃度溶液呈凝膠狀。而對(duì)于繡球菌子實(shí)體中的水溶性多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)活性尚缺乏系統(tǒng)的研究。因此，本研究以前期發(fā)現(xiàn)的分子量為400KDa左右的繡球菌可溶性多糖組分為研究對(duì)象，通過(guò)色譜和波普對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析，并通過(guò)大鼠初代脾淋巴細(xì)胞體外刺激實(shí)驗(yàn)對(duì)其免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行檢測(cè)。（擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題）通過(guò)研究明確繡球菌可溶性多糖的主要結(jié)構(gòu)及其體外免疫調(diào)節(jié)活性，以期探明繡球菌可溶性多糖的生物學(xué)活性基礎(chǔ)，填補(bǔ)相關(guān)研究工作的空白。

1材料與方法

1.1供試材料

繡球菌凍干粉購(gòu)于福建天益菌業(yè)有限公司。

1.2試劑與儀器設(shè)備

試劑：Dextran系列葡聚糖（Pharmcia公司）;細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國(guó)FALCON）;RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO）;FBS（美國(guó)ExCellBiologyFBS500）;24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Coming Incorporated）;96孔板（美國(guó)Coming Incorporated）;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純、色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

儀器：UM 5000蒸發(fā)光檢測(cè)儀（北京通微分析儀器有限公司）;SP8800色譜泵（美國(guó)物理光譜公司）;TSKgel GMPxL凝膠色譜柱（7.8mm×300mm，日本東曹）;Waters 2695液相色譜儀（美國(guó)WATERS）;Waters2998PDA檢測(cè)器（美國(guó)WATERS）;ODS-SP色譜柱（150×4.6mm，5um，日本島津）;IX51倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）;超凈工作臺(tái)（蘇州凈化）;C0培養(yǎng)箱（日本SANYO）;Nicolet-6700紅外光譜儀（美國(guó)Thermo）;AVANCE400核磁共振波譜儀（德國(guó)BRUKER）;Centrifuge 5804-R離心機(jī)（德國(guó)艾本德）;EPOCH2TC酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek）;真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1繡球菌多糖提取與分離多糖提取：采用熱水提取法，準(zhǔn)確稱(chēng)取繡球菌凍干品粉末50g，料液比1：15，100℃熱水水浴攪拌提取2h，提取液4000r·min離心15min取上清，上清液濃縮至原體積的1/2，加入4倍體積95%的乙醇醇沉過(guò)夜，8000r·min離心10min取沉淀置于真空干燥箱中去除殘余乙醇，即得繡球菌粗多糖。

采用三氯乙酸法脫蛋白：繡球菌粗多糖用蒸餾水復(fù)溶后，8000r·min離心10min取上清液，用蒸餾水溶解配制成質(zhì)量濃度為15mg·mL的溶液，加入樣品體積的1/10的40%TCA溶液，混勻后靜置30min，8000r·min離心10min，取上清。重復(fù)3次后，取上清液加入4倍體積乙醇進(jìn)行醇沉，過(guò)夜后4500r·min離心5min取沉淀，用丙酮洗滌沉淀2次，真空干燥后，得到繡球菌凍干品多糖SCG-D。

繡球菌多糖的DEAE Sepharose Fast Flow柱分離：繡球菌凍干品多糖SCG-D溶液（20mg·mL）10mL上樣于DEAESepharoseFastFlow柱（2.6cm×25cm）進(jìn)行分離，流速：1mL·min，先用純水洗脫，而后用0.25mol·L的NaCl溶液洗脫。以無(wú)水乙醇在680nm檢測(cè)混濁度跟蹤多糖，純水洗脫部分凍干獲得多糖組分SCG-N，NaCl溶液洗脫部分用透析袋流水透析48h脫鹽后凍干獲得多糖組分SCN-A。

1.3.2繡球菌多糖樣品的分子量分布測(cè)定 多糖分子量分布測(cè)定采用高效凝膠滲透色譜法。

色譜條件：流動(dòng)相為0.05mol·L乙酸銨;流速0.6mL·min;柱溫35℃;進(jìn)樣量10uL;色譜柱TSKgel GMPxL（7.5mm×300mm）。ELSD檢測(cè)器：載氣為空氣;載氣壓力4.5bar;漂移管溫度60℃;數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)為Chrommanger5.8GPC專(zhuān)用版。

標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品的制備：多糖樣品和葡聚糖對(duì)照品用0.05mol·L乙酸銨溶液溶解為2mg·mL，用于HPSEC分析。

以重均分子量為2000000、1000000、500000、70000、40000、20000Da的葡聚糖樣品為標(biāo)準(zhǔn)品，以保留時(shí)間對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作線性回歸。

1.3.3繡球菌SCG-A多糖組分的單糖組成分析 采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）結(jié)合單糖PMP衍生檢測(cè)繡球菌SCG-A多糖中的單糖組成及摩爾比。

1.3.4繡球菌SCG-A多糖組分的紅外光譜分析 分別稱(chēng)取2mg多糖樣品與適量的KBr粉末在白熾燈下干燥研磨均勻，壓片機(jī)壓片，紅外光譜儀在400-4000cm區(qū)間內(nèi)掃描透射光譜進(jìn)行紅外分析。

1.3.5繡球菌SCG-A多糖組分的核磁共振分析 20mg多糖樣品溶于重水0.5mL，在400Mz核磁共振儀測(cè)定，氫譜（300K）時(shí)以HDOδ4.69為內(nèi)標(biāo)。

1.3.6多糖樣品的體外鼠脾淋巴細(xì)胞刺激試驗(yàn) 通過(guò)MTT法檢測(cè)SCG-D、SCG-A、SCG-N對(duì)大鼠初代脾淋巴細(xì)胞體外增值刺激活性。

脾臟淋巴細(xì)胞制備：取大鼠無(wú)菌操作取出脾臟，用冷PBS漂洗后將脾臟組織剪碎，冷PBS漂洗后加入0.125%胰酶+0.05%Ⅱ型膠原酶進(jìn)行消化;消化完成后過(guò)濾，濾液通過(guò)梯度離心收集淋巴細(xì)胞，收集的細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后于RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清培養(yǎng)。

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將脾淋巴細(xì)胞消化、調(diào)整濃度為5×10個(gè)·mL的細(xì)胞懸液備用，在96孔板中每孔加入100uL細(xì)胞懸液;然后置于37℃、5%CO環(huán)境中培養(yǎng);24h后每孔加入100uL相應(yīng)含藥培養(yǎng)基，再于37℃、5%CO環(huán)境中培養(yǎng)72h;然后進(jìn)行MTT染色，測(cè)定490mm的OD值，計(jì)算各組別增殖率，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，并設(shè)陰性對(duì)照組。

細(xì)胞增殖率=（處理組OD-對(duì)照組OD）/對(duì)照組OD×100%

2結(jié)果與分析

2.1繡球菌多糖的分離與分子量分布測(cè)定

繡球菌水溶性多糖SCG-D通過(guò)離子交換樹(shù)脂分離為不被凝膠柱吸附的SCG-N和被陰離子凝膠柱吸附的酸性多糖SCG-A兩部分（圖1），分別對(duì)其進(jìn)行HPSEC檢測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Log（MW）=-0.4066tR+10.9773，MW為重均分子量，tR為保留時(shí)間（min），相關(guān)系數(shù)為r=0.9941。從圖2可以看出，SCG-A在色譜圖上呈現(xiàn)1個(gè)明顯色譜峰，該成分重均分子量

2.2繡球菌SCG-A多糖組分的單糖組成、紅外光譜與核磁共振分析

按文獻(xiàn)所述方法，在相同色譜條件下，得到混標(biāo)單糖PMP衍生物的液相色譜圖和SCG-A多糖水解產(chǎn)物PMP衍生物的色譜圖（圖3），結(jié)果顯示多糖SCG-A主要由葡萄糖和半乳糖構(gòu)成，并含有少量的甘露糖和半乳糖醛酸，其中葡萄糖與半乳糖物質(zhì)量比為22.13：1。

如圖4所示，SCG-A的吸收譜帶在3397.09cm處存在強(qiáng)且寬的-OH吸收峰;2927.73cm附近的肩峰為飽和C-H伸縮振動(dòng)的信號(hào)，中等強(qiáng)度;1647.47cm處為酰胺羰基吸收峰，表明樣品中可能有一定量的糖結(jié)合蛋白;1154.86cm，1080.86cm，1023.46cm等3個(gè)峰為吡喃糖環(huán)特征吸收峰;光譜在890cm附近無(wú)吸收峰、而在850cm有一吸收峰，表明其糖苷鍵構(gòu)型為α型。綜上，SCG-A的主要結(jié)構(gòu)可能為α-D-葡聚糖。

圖5和圖6分別為多糖組分SCG-A的H-NMR和C_N1VIR譜。在H譜中55.332處為異頭氫的共振峰，由于其化學(xué)位移大于5.0，因此這些葡萄糖殘基均為α型吡喃糖，這與紅外光譜分析結(jié)論一致。C-NMR譜在δ95-105區(qū)域觀察到3個(gè)端基碳信號(hào)，表明其糖鏈重復(fù)單位中應(yīng)至少有3種單糖，這與單糖分析數(shù)據(jù)相符，δ99.8處強(qiáng)信號(hào)（<100）表明其主鏈結(jié)構(gòu)苷鍵為α-D型;在76.89處為C-4發(fā)生取代的化學(xué)位移信號(hào)，δ60.54的強(qiáng)信號(hào)表明存在大量未發(fā)生取代的C-6，說(shuō)明糖鏈主要以（1-4）連接為主;同時(shí)，在δ68.34的化學(xué)位移信號(hào)表明存在有發(fā)生取代的C-6，可見(jiàn)糖鏈中可能還存在（1-6）分支結(jié)構(gòu)。結(jié)合單糖組成分析數(shù)據(jù)和紅外光譜數(shù)據(jù)可知SCG-A為一種以α型1，4糖苷鍵連接的吡喃型葡萄糖為主鏈的葡聚糖，同時(shí)其可能還含有一定量（1-6）分支結(jié)構(gòu)。

2.3繡球菌多糖組分對(duì)大鼠初代脾淋巴細(xì)胞的刺激作用

檢測(cè)結(jié)果顯示，分子量400KDa左右的SCG-A（圖7）、SCG-N（圖8）、SCG-D（圖9）均表現(xiàn)出不同程度的促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖的活性。SCG-A對(duì)大鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激作用較好，在最低質(zhì)量濃度50ug·mL下仍可以觀察到明顯的促進(jìn)作用，增殖率為21.78%（圖10），且在50-800ug·mL的范圍內(nèi)存在明顯劑量依賴(lài)關(guān)系，相比之下SCG-D、SCG-N的50ug·mL低質(zhì)量濃度處理組的刺激效果不顯著。

3討論與結(jié)論

在之前的研究中，繡球菌被發(fā)現(xiàn)是一種很好制備抗腫瘤葡聚糖的原料，其所述的活性多糖為采用堿溶液提取的難溶性或不溶性多糖，結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明這些多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)是6-支化的β-1，3-葡聚糖，大約每3個(gè)主鏈單元中有一個(gè)分支.本研究從繡球菌凍干品粉末中提取到了一種水溶性多糖，該多糖不同于之前所述的β-1，3-葡聚糖，而是一種α-1，4-葡聚糖，并具有1-6分支結(jié)構(gòu)。同時(shí)前期研究表明在烘干品熱水提取物中幾乎不含有SCG-A，可見(jiàn)SCG-A較容易被生物體降解，這可能與其類(lèi)似支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相關(guān)。

通過(guò)大鼠脾淋巴細(xì)胞的體外刺激試驗(yàn)對(duì)熱水提取的繡球菌水溶性多糖及其分離組分的免疫活性進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示凍干品提取的分子量在400kDa左右的多糖表現(xiàn)出了促進(jìn)大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的免疫活性，通過(guò)離子交換層析從凍干品多糖中進(jìn)一步分離得到了SCG-A和SCG-N兩個(gè)多糖組分，活性檢測(cè)結(jié)果顯示二者均有活性，其中酸性多糖SCG-A的活性最強(qiáng)，且劑量依賴(lài)關(guān)系明顯，其含量約占所提得凍干品多糖總量的1/3。

目前為止，我們知道SCG-A的主鏈結(jié)構(gòu)應(yīng)為α-1，4-葡聚糖，并含1-6分支結(jié)構(gòu)，但具體的糖鏈重復(fù)單元結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步通過(guò)甲基化分析和2D-NMR進(jìn)行確認(rèn)。同時(shí)，其生物學(xué)功能也有待進(jìn)一步的檢測(cè)和挖掘。