林江波 王偉英 鄒暉 戴藝民

摘要：[目的]分析鐵皮石斛Dendrobium officinale黃酮類化合物的生物合成途徑及相關(guān)基因，為鐵皮石斛黃酮類化合物代謝調(diào)控、藥用價值的開發(fā)研究提供參考。[方法]利用IlluminaHiSeq4000測序平臺對鐵皮石斛2個生長階段莖、葉進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，對組裝獲得的unigenes進行功能注釋和黃酮類化合物的生物合成相關(guān)基因解析。[結(jié)果]鐵皮石斛黃酮類化合物代謝相關(guān)Unigenes48個，涉及14個酶。5個CHS相關(guān)Unigenes具有CHS-like保守結(jié)構(gòu)域，活性位點氨基酸殘基（Cys-His-Asn）高度保守，丙二酰輔酶A結(jié)合位點和產(chǎn)物結(jié)合位點的部分氨基酸殘基發(fā)生變異。CHl（Unigene0013781）屬于類型I查爾酮異構(gòu)酶，異構(gòu)化6'-羥基查爾酮為5-羥基黃烷酮。表達分析表明，2個生長時期的莖和葉，CHS（Unigene0008250）、CHI（Unigene0013781）和F3H的表達量都高于CHS（Unigene0012884）和C3'H。[結(jié)論]通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，共獲得鐵皮石斛黃酮類化合物代謝相關(guān)Unigenes48個，涉及14個酶;5個CHS相關(guān)Unigenes中，2個編碼查爾酮合酶，3個編碼聯(lián)芐合酶;CHl（Unigene0013781）屬于類型I查爾酮異構(gòu)酶。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛;轉(zhuǎn)錄組;黃酮;功能注釋;表達;代謝

中圖分類號：S567.239文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1008-0384（2019）09-1019-07

0引言

（研究意義）黃酮類化合物是鐵皮石斛活性成分之一，通過分析鐵皮石斛高通量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，發(fā)掘黃酮類化合物代謝相關(guān)基因，分析代謝途徑，對鐵皮石斛黃酮類化合物的代謝調(diào)控和藥用價值的開發(fā)具有重要意義。（前人研究進展）黃酮類化合物屬于一類低分子多酚化合物，又稱黃酮體、黃堿素，是一類重要次生代謝產(chǎn)物，核心結(jié)構(gòu)是由15個碳原子組成的2-苯基色原酮，具有C6-C3-C6基本骨架，由2個苯環(huán)（A環(huán)和B環(huán)）通過中央3個碳原子相連。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并鑒定的黃酮類化合物有9000多種，可分為查爾酮類、黃酮和黃酮醇類、黃烷酮和黃烷醇類、異黃酮類等。黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、降脂降糖、抗心肌缺血等功能。鐵皮石斛Dendrobium officinale是中國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有抗氧化、增強機體免疫力、降血壓血脂、抗腫瘤等生理活性。黃酮類化合物是鐵皮石斛活性成分之一，不同部位、不同栽培方式和時間，總黃酮含量存在差異。徐麗紅等比較了不同栽培方式鐵皮石斛黃酮含量（以干基計），最高的是純野生栽培，為0.25%，最低的是大棚仿野生栽培，為0.09%。唐麗等比較了不同生長齡鐵皮石斛葉、莖的總黃酮含量，0.5年生長齡植株莖、葉的總黃酮分別為0.035%和0.104%，高于其他生長齡。黃秀紅等研究結(jié)果表明：鐵皮石斛盛花期、花苞期和微花期花的總黃酮含量分別為1.66%、1.52%和1.41%，差異顯著。鐵皮石斛花總黃酮對羥自由基、DPPH自由基和ABTS自由基都具有較強的清除能力，質(zhì)量濃度為10mg·mL時，對DPPH和羥基自由基的清除率分別為89.77%和80.01%，花總黃酮對DPPH自由基、ABTS自由基和超氧陰離子的清除率效果比莖黃酮佳。黃酮類化合物與糖形成苷或以游離苷元形式存在。已經(jīng)從鐵皮石斛中分離到的黃酮苷化合物有新西蘭牡荊苷Ⅱ、蘆丁、新西蘭牡荊苷Ⅰ、佛萊心苷、異佛萊心苷、夏佛塔苷和異夏佛塔苷等，新西蘭牡荊苷Ⅱ是不同道地種源鐵皮石斛共性黃酮苷，能有效抑制人肝癌HepG2細胞增殖，濃度50.35uml·L，給藥48h，細胞存活率為50.89%，可能通過調(diào)控MAPK信號通路和Bax/Bcl-2，Caspase途徑誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以全面分析轉(zhuǎn)錄本，有利于分析次生代謝產(chǎn)物合成途徑，挖掘關(guān)鍵酶基因。馬婧等對草麻黃高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，獲得類黃酮代謝相關(guān)基因70個。鄒毅輝等對半枝蓮進行了轉(zhuǎn)錄組測序，獲得注釋unigenes 74185個，與黃酮類生物合成途徑相關(guān)89個，其中差異表達36個。鄒福賢等對不同種植時期的金線蓮進行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得51370個unigenes，黃酮類生物合成代謝通路中，22個基因（6種酶）表達量差異顯著。（本研究切入點）利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，可以發(fā)掘鐵皮石斛黃酮類化合物代謝相關(guān)基因，了解代謝途徑，但目前尚未見到相關(guān)報道。（擬解決的關(guān)鍵問題）本研究通過分析鐵皮石斛2個生長階段莖、葉的高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)掘黃酮類化合物代謝相關(guān)基因，分析代謝途徑，解析CHS和CHI相關(guān)的unigenes，分析部分關(guān)鍵酶基因的表達，旨在為鐵皮石斛黃酮類化合物代謝調(diào)控、藥用價值的開發(fā)研究提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝

鐵皮石斛采自福建省龍巖市連城縣冠豸山，經(jīng)過莖段擴繁后，種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所資源圃，于生長期（2016年8月15日）和成熟期（2016年12月15日）隨機采集3株新鮮莖、葉樣品供轉(zhuǎn)錄組測序，分別標(biāo)記為T1（生長期莖）、T2（生長期葉）、T3（成熟期莖）、T4（成熟期葉）。轉(zhuǎn)錄組測序、數(shù)據(jù)的拼接、組裝和功能注釋由廣州基迪奧生物科技有限公司完成，測序平臺為Illumina HiSeq 4000。

1.2黃酮類相關(guān)Unigenes分析

為了獲得與黃酮類化合物代謝相關(guān)的基因信息，根據(jù)KEGG注釋信息進一步獲得Unigenes的Pathway注釋，分析黃酮類化合物代謝通路及相關(guān)unigenes。采用NCBI的BLAST X和BLAST P搜索序列相似性和氨基酸保守結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列的多重比對由軟件DNAMAN V6.0完成。采用MEGA6.0軟件NJ法進行分子進化樹分析。

1.3黃酮類合成關(guān)鍵酶基因表達分析

利用RPKM（Reads Per kb per Million reads）法計算Unigene表達量，分析關(guān)鍵酶基因的表達。RPKM法計算公式為：RPKM=（1000000×C）/（N×L/1000）。其中，設(shè)RPKM為Unigene A的表達量，C為比對到Unigene A的reads數(shù)，N為比對到所有Unigene的總reads數(shù)，L為UnigeneA的堿基數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1黃酮類化合物代謝途徑解析

4個樣品的原始數(shù)據(jù)（NCBI SRA號：SRPl81716）經(jīng)過拼接、組裝后共獲得43085條Unigenes，KEGG數(shù)據(jù)庫注釋的有8972條。通過KEGG代謝途徑分析，共獲得48個黃酮類化合物代謝相關(guān)Unigenes，涉及14個酶（表1），根據(jù)Pathway分析的代謝通路結(jié)合鐵皮石斛已經(jīng)報道的黃酮類成分，推測黃酮類化合物生物合成途徑見圖1。首先，通過苯丙烷代謝途徑，在PAL、4CL和C4H的連續(xù)催化下，把苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成黃酮類化合物代謝的起始底物對香豆酰輔酶A;PAL是苯丙烷代謝的第一個反應(yīng)酶、限速酶，與PAL相關(guān)的Unigenes 4個。對香豆酰輔酶A接下去的反應(yīng)有2條支路：一條是在HCT、C3'H和CCoAOM了等酶的催化下形成咖啡酰輔酶A和阿魏酰輔酶A，再經(jīng)過CHS的催化形成2'，3，4，4’，6'五羥基查爾酮和4，2'，4'，6'四羥基-3-甲氧基查爾酮;另一條是在CHS的催化下，形成柚皮素查爾酮，CHS是苯丙烷代謝流向黃酮類代謝的第一個關(guān)鍵酶，相關(guān)的Unigenes 5個。柚皮素查爾酮經(jīng)CHI異構(gòu)化形成黃烷酮類化合物柚皮素，CHI相關(guān)的Unigenes2個。柚皮素在F3H、F3'H、F3'5'H、FLS等酶催化下形成二氫黃酮醇和黃酮醇類物質(zhì)。二氫黃酮醇在DFR和LDOX等酶的催化，形成花色素。

2.2CHS相關(guān)Unigene生物信息學(xué)分析

KEGG代謝途徑分析與CHS相關(guān)的5個Unigene為Unigene0008250、Unigene0012884、Unigene0023486、Unigene0023487和Unigene0023488。利用DNAMANV6.0軟件預(yù)測Unigene的開放閱讀框（ORF）和比對氨基酸同源性，Unigene0008250、Unigene0012884、Unigene0023487和Unigene0023488含有完整的ORF，分別編碼395、390、390和390個氨基酸，同源性80.18%（圖2）;Unigene0023486含部分的ORF，編碼148個完成氨基酸。采用NCBI的BLAST P搜索氨基酸序列相似性和保守結(jié)構(gòu)域，Unigene0008250、Unigene0012884分別與金釵石斛（Dendrobium nobile）的查爾酮合酶（ABE77392.2）、海棗（Phoenixdactylifera）的查爾酮合酶（XP_008797107.1）同源性最高，為99%和88%。Unigene0023487和Unigene0023488與姬蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）的聯(lián)芐合酶（XP 020572026.1）分別具有87%和93%的同源性;Unigene0023486與蝴蝶蘭（Phalaenopsis Jp.）的聯(lián)芐合酶（P53416）具有96%的同源性。4個含有完整ORF的Unigenes都具有CHS-like保守結(jié)構(gòu)域，含有3個活性位點，5個丙二酰輔酶A結(jié)合位點和6個產(chǎn)物結(jié)合位點。從圖2可以看出，3個活性位點的氨基酸殘基是保守的，但是，位點ii的N端相鄰兩個氨基酸殘基發(fā)生變異，Unigene0008250和Unigene0012884是IA，Unigene0023487和Unigene0023488是VP。5個丙二酰輔酶A結(jié)合位點中，位點1和3的氨基酸殘基保守;位點2和5的氨基酸殘基，Unigene0008250和Unigene0012884為RM和GPA，而Unigene0023487和Unigene0023488為RJ和GRA;位點4的氨基酸殘基Unigene0008250和Unigene0012884為F、Unigene0023487為P、Unigene0023488為A。6個產(chǎn)物結(jié)合位點只有e和f位點保守，b、c、d位點的氨基酸殘基Unigene0008250和Unigene0012884為G、IDG、T，Unigene0023487和Unigene0023488則為A、IGG、L;a位點的氨基酸殘基Unigene0008250和Unigene0012884為EIT，Unigene0023487為ETS、Unigene0023488為ETT。

2.3CHI相關(guān)Unigene生物信息學(xué)分析

KEGG代謝途徑分析與CHI相關(guān)的2個Unigenes為Unigene0013780和Unigene0013781。Unigene0013780帶有部分ORF，編碼89個氨基酸，Unigene0013781帶有完整的ORF，編碼244個氨基酸，氨基酸同源性比對發(fā)現(xiàn)，Unigene0013780編碼的89個氨基酸與Unigene0013781編碼的一段氨基酸一致性100%。通過NCBI的BLAST P搜索氨基酸序列相似性和保守結(jié)構(gòu)域，Unigene0013781編碼的氨基酸屬于Chalcone_3superfamily，具有查爾酮.黃烷酮異構(gòu)酶保守結(jié)構(gòu)域，能夠異構(gòu)化查爾酮形成柚皮素（4'，5，7.三羥基黃酮），與姬蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）的查爾酮-黃烷酮異構(gòu)酶（XP 020583376）同源性為76%。采用MEGA6.0軟件將Unigene0013781編碼的氨基酸序列與來自其他物種的9個查爾酮-黃烷酮異構(gòu)酶進行NJ聚類分析（圖3），聚類結(jié)果把10個查爾酮-黃烷酮異構(gòu)酶分為2類，日本百脈根（Lotusjaponicus）的BAC53983和BAC54038聚為一類，Unigene0013781同其他7個聚為一類，與姬蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）的查爾酮-黃烷酮異構(gòu)酶（XP 020583376）親緣關(guān)系最近。

2.4黃酮類化合物代謝關(guān)鍵酶基因表達分析

劉CH3（Unigene0008250）、CHS（Unigene0012884）、CHI（Unigene0013781）、C3'H和F3H采用RPKM值分析他們在生長期和成熟期莖、葉中的表達量。從圖4可以看出，在同一個組織，CHS（Unigene0008250）、CHI（Unigene0013781）和F3H的表達量都高于CHS（Unigene0012884）和C3'H。CHS（Unigene0008250）在生長期葉的表達量高于莖，成熟期則莖高于葉;CHI（Unigene0013781）的表達量，生長期莖高于成熟期，葉則成熟期高于生長期，在相同生長時期，莖的表達量都比葉高;F3H的表達量成熟期莖和葉都高于生長期。

3討論與結(jié)論

黃酮類化合物是鐵皮石斛重要的次生代謝產(chǎn)物之一，本研究通過分析鐵皮石斛2個生育期的莖、葉轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的KEGG注釋結(jié)果，獲得涉及黃酮類化合物代謝的酶14個，相關(guān)Unigene48個，并推測鐵皮石斛黃酮類化合物生物合成途徑，為今后關(guān)鍵基因的克隆、鑒定及代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ).

CHS超基因家族包括查爾酮合成酶和一系列由于基因復(fù)制和功能分化衍生出的類CHS（CHS-like）蛋白。聯(lián)芐合酶是蘭科植物普遍含有的類CHS（CHS-like）蛋白，催化1分子間羥基苯丙酰輔酶A和3分子丙二酰輔酶A形成三羥基二苯甲酰。CHS超基因家族成員間序列同源性高，結(jié)構(gòu)和催化機制相似，活性位點都是由Cys-His-Asn 3個保守氨基酸構(gòu)成的三聯(lián)體活性中心，功能分化在于丙二酰輔酶A縮合次數(shù)，起始底物的偏好和活性位點附近少數(shù)氨基酸的替換從而改變產(chǎn)物的環(huán)化方式等。本實驗獲得的5個CHS相關(guān)Unigene，2個屬于查爾酮合酶，3個屬于聯(lián)芐合酶。4個含有完整ORF的Unigene都含有CHS-like保守結(jié)構(gòu)域，同源性80.18%，活性位點都是Cys-His-Asn。但是，活性位點His的N端相鄰2個氨基酸殘基發(fā)生變異，查爾酮合酶是IA，聯(lián)芐合酶是VP;5個丙二酰輔酶A結(jié)合位點中，2個位點的氨基酸殘基保守，3個位點的氨基酸殘基查爾酮合酶和聯(lián)芐基合酶之間發(fā)生變異，其中1個位點聯(lián)芐合酶之間也發(fā)生變異。6個產(chǎn)物結(jié)合位點中，2個位點的氨基酸殘基保守，4個位點的氨基酸殘基查爾酮合酶和聯(lián)芐合酶之間發(fā)生變異，其中1個位點聯(lián)芐合酶之間也發(fā)生變異。

CHI催化查爾酮形成二氫黃酮，植物CHI家族可分為兩大類：類型Ⅰ只能以6'-羥基查爾酮為底物，異構(gòu)化為5-羥基黃烷酮，類型Ⅱ除了具有類型Ⅰ的活性外，還能將6'-脫氧查爾酮異構(gòu)化為5-脫氧黃烷酮，Shimada等克隆了日本百脈根的3個查爾酮異構(gòu)酶，cCHll（BAC53983）和cCHl3（BAC54038）屬于類型Ⅱ，cCHl2（BAC53984）屬于類型Ⅰ。CHI（Unigene0013781）與cCHl2聚為一類，屬于類型I查爾酮異構(gòu)酶。

在黃酮類化合物代謝中，CHS是催化反應(yīng)的第一步，CHI是催化反應(yīng)的第二步，表達量高低直接影響黃酮類代謝產(chǎn)物的量。CHS的催化底物有對香豆酰輔酶A、肉桂酰輔酶A和咖啡酰輔酶A，在逆境條件下，更傾向于咖啡酰輔酶A。從表達量來看，2個生長時期的莖和葉，CHS（Unigene0008250）、CHI（Unigene0013781）和F3H的表達量都高于CHS（Unigene0012884）和C3'H，推測CHS（Unigene0008250）是以對香豆酰輔酶A為底物，形成柚皮素查爾酮，后經(jīng)CHI（Unigene0013781）異構(gòu)化形成柚皮素，而CHS（Unigene0012884）以咖啡酰輔酶A為底物，這需要通過酶活性實驗進一步驗證。