項(xiàng)展愷

摘? ?要：通過(guò)培養(yǎng)青花菜幼苗并提取DNA，以所得DNA為模板克隆青花菜MYB基因，并對(duì)該基因進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序后，利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行序列分析，包括尋找同源序列、同源序列蛋白質(zhì)翻譯比對(duì)、分析翻譯所得蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。從青花菜中克隆得到的BoMYB基因，其編碼263個(gè)氨基酸，蛋白序列中具有2個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域。對(duì)比在擬南芥中的研究推測(cè)，該基因可能在滲透脅迫響應(yīng)中起作用。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，BoMYB與歐洲油菜的MYB聚為一組，它們與擬南芥的MYB處于不同分支。對(duì)BoMYB基因的克隆與序列進(jìn)行分析，為探究青花菜MYB基因的表達(dá)、功能及抗逆機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：青花菜;MYB基因;克隆;序列分析

文章編號(hào)： 1005-2690（2019）01-0112-03? ? ? ?中圖分類號(hào)： S635.3? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

青花菜（Brassica oleracea var. italica），又名西蘭花、綠花菜，是市場(chǎng)上常見(jiàn)的蔬菜之一，浙江臺(tái)州是我國(guó)的青花菜主產(chǎn)地，建有全國(guó)最大的青花菜生產(chǎn)中心，是當(dāng)?shù)夭宿r(nóng)出口創(chuàng)匯的重要蔬菜作物。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)受到外界不良環(huán)境的影響，如干旱、水澇、病蟲害等，導(dǎo)致生長(zhǎng)受阻。青花菜也一樣，在整個(gè)生育期中受多種因子的脅迫，引起產(chǎn)量和品質(zhì)下降，最終影響菜農(nóng)的收入。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子之一，其不僅在調(diào)節(jié)植物次生代謝[1]、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期[2]以及葉片等器官形態(tài)建成中發(fā)揮作用，還在植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆境脅迫過(guò)程中起著極其重要的作用，如擬南芥AtMYB2受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，并與RdBPI蛋白相互作用協(xié)調(diào)Rd22的表達(dá)，從而提高植物的抗逆境能力[3]等。當(dāng)植物受到干旱、低溫等非生物因素脅迫時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，并通過(guò)結(jié)合相應(yīng)的順式作用元件，激活并調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而對(duì)植物的抗逆能力產(chǎn)生影響[4]。但在青花菜中，尚未有關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子存在的報(bào)道。

本研究嘗試在提取青花菜葉片DNA的基礎(chǔ)上克隆青花菜BoMYB基因，利用生物信息學(xué)手段分析其序列特征及與同源序列的差異，預(yù)測(cè)該基因的生物學(xué)功能，為探究青花菜MYB基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1? ?材料與方法

1.1? ?植物樣本與試劑

1.1.1? ?植物樣本

試驗(yàn)材料為青花菜“優(yōu)秀”品種，培育于人工氣候箱，2葉1心時(shí)從植株上采集葉片用于DNA的提取。

1.1.2? ?主要試劑

使用“新型植物基因組DNA快速提取試劑盒”，試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。dNTPs購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，Taq酶購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2? ?方法

1.2.1? ?DNA提取

提取青花菜DNA的步驟為：在1.5 mL離心管中加入450 μL溶液A，然后加入β-巰基乙醇至濃度為0.5%;取兩片同一株青花菜的葉子，設(shè)為A和B葉片;將A葉片撕成幾片，放入研缽A中;打開(kāi)液氮瓶，將適量液氮倒入研缽A中，并用研棒研磨葉片;待液氮完全消失后，觀察葉片是否已完全成粉末狀;將研磨好的粉末A加到以上預(yù)備好的離心管中;對(duì)于葉片B，重復(fù)以上步驟;粉末A分別放入標(biāo)記的離心管1和離心管2;粉末B分別放入標(biāo)記的離心管3和離心管4;將離心管1、2、3、4，65 ℃水浴30 min（期間每隔10 min輕輕顛倒混勻樣品一次）;水浴完成后，加入5 μL RNase，混勻，37 ℃水浴1 h;再加入400 μL溶液B，充分混勻，常溫下放置5 min，再用高速冷凍離心機(jī)于12 000 rpm離心5 min;用500 μL氯仿抽提一次;將上清液用移液槍轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入600 μL異丙醇，充分混勻，室溫放置10 min。12 000 rpm離心10 min，小心去除上層清液;加入600 μL去除溶液C，顛倒混勻兩次，用槍頭輕輕吹打沉淀，12 000 rpm離心5 min，棄廢液;于室溫敞蓋放置20 min（至無(wú)明顯乙醇味）;加入80 μL溶液D（相應(yīng)離心管中即為基因組DNA溶液）;取5 μL 于1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳鑒定。5 min后，棄廢液;于室溫敞蓋放置20 min（至無(wú)明顯乙醇味）;加入80 μL溶液D（離心管中即為基因組DNA溶液）。

1.2.2? ?PCR擴(kuò)增

采用上游引物（5'-ATGGCGGATCGTATTA-3'）、下游引物（5'-CTACTCGATTCTTCCAACT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系共20μL，2μL 10×buffer（含20 mmol/L? Mg2+），DNA模板0.8 μL，上/下游引物（20 μmol/L）各0.3μL，0.5μL dNTPs（10 mmol/L）（上海生工），0.4 μL Taq DNA聚合酶（2 U/μL）（北京鼎國(guó)），不足的部分加ddH2O補(bǔ)充。反應(yīng)在Bio-Rad S1000型PCR儀上進(jìn)行，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，32個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。將克隆的BoMYB基因送上海生工測(cè)序，獲得目的序列。

1.2.3? ?序列分析

對(duì)測(cè)得的青花菜MYB基因序列進(jìn)行序列分析，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的在線工具BLAST尋找同源序列;利用Clustal X進(jìn)行BoMYB及其同源序列的多序列比對(duì);進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用MEGA5.05;登陸http：//smart.embl-heidelbery.de/，預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)域;登陸https：//web.expasy.org/protparam/和https：//web.expasy.org/protscale/，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理化性質(zhì);登陸https：//www.predictprotein.org/，利用PSIPRED在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。

2? ?結(jié)果與討論

2.1? ?青花菜BoMYB基因的擴(kuò)增

利用PCR擴(kuò)增得到的青花菜BoMYB基因長(zhǎng)度約為950 bp，與預(yù)期結(jié)果大小基本一致，條帶單一、清晰、明亮，說(shuō)明PCR擴(kuò)增成功，可用于后續(xù)的測(cè)序和分析。

2.2? ?青花菜BoMYB基因序列分析

測(cè)序結(jié)果表明，BoMYB的基因組全長(zhǎng)為903 bp，具有一個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度為111 bp，兩個(gè)外顯子的長(zhǎng)度分別為369 bp和423 bp。BoMYB的編碼區(qū)全長(zhǎng)為792 bp，編碼263個(gè)氨基酸。

通過(guò)BLAST進(jìn)行同源序列比對(duì)，得到8條同源序列，利用Clustal X和GeneDoc，對(duì)BoMYB基因及其同源序列的編碼蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)。

同源序列比對(duì)結(jié)果表明， 1-110，166-171、175-185、252-273、284-305等位點(diǎn)高度保守，但序列中也存在一些殘基的不同，這些位點(diǎn)可能具有功能性價(jià)值;BoMYB與其同源序列相比，129-165位點(diǎn)缺失，63、118、221、231、233、285、286、293等位點(diǎn)有新的氨基酸出現(xiàn)。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明，該基因與BoMYB和歐洲油菜（B. napus）聚為一支，擬南芥（Arabidopsis thaliana）超級(jí)家族基因和小鹽芥（Eutrema salsugineum）聚為一支。BoMYB和歐洲油菜BnMYB親緣關(guān)系最近，推測(cè)可能有與該類蛋白具有相似的功能。

2.3? ?蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

利用ProtParam tool檢索蛋白質(zhì)序列的理化參數(shù)，分析結(jié)果表明，BoMYB所翻譯成的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為29 168.00 Da，分子式為C1263H1997N385O382S15，不穩(wěn)定系數(shù)為59.39，總平均疏水性-0.615，說(shuō)明該蛋白為親水蛋白。

2.4? ?蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)PSIPRED在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該蛋白有α-螺旋（H）79 個(gè)、β-折疊（E）2個(gè)，有無(wú)規(guī)則卷曲（C）182個(gè)，即α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分。

2.5? ?蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)

利用SMART在線軟件預(yù)測(cè)青花菜MYB基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。該蛋白含有兩個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域，分別位于序列的5-54和 57-105處，符合MYB家族蛋白的結(jié)構(gòu)特征。目前，對(duì)MYB家族SANT結(jié)構(gòu)域的研究報(bào)道較少。SANT可調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性，在調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[5]。如在擬南芥中，SANT可增加擬南芥對(duì)鹽和滲透脅迫的抗性，但BoMYB是否能影響青花菜對(duì)鹽和滲透脅迫的抗性還有待進(jìn)一步的研究。

3? ?討論與展望

轉(zhuǎn)錄因子是一類能與啟動(dòng)子結(jié)合，并調(diào)控下游基因表達(dá)的特殊蛋白，常見(jiàn)的有MYB、WRKY、bZIP、AP2和NAC等[6]。MYB以基因家族的形式存在，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝、形態(tài)建成、生物脅迫和非生物脅迫中起著重要作用[7]。

本研究以青花菜為材料，克隆到了一個(gè)MYB基因，命名為BoMYB。BoMYB的基因組DNA全長(zhǎng)為903 bp，具有一個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度為111 bp，以及兩個(gè)外顯子，長(zhǎng)度分別為369 bp和423 bp。編碼區(qū)全長(zhǎng)為792 bp，編碼263個(gè)氨基酸，含兩個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域。

序列比對(duì)結(jié)果表明，BoMYB與歐洲油菜BnMYB的差異最小，僅存在個(gè)別氨基酸殘基的差異，與8個(gè)擬南芥MYB的差異相對(duì)較大，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上處于不同的分支。在二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋的數(shù)量最多，β-折疊的數(shù)量最少，僅2個(gè)。推測(cè)該基因可能在滲透脅迫響應(yīng)中起作用，以適應(yīng)缺水等不良環(huán)境，但其在這類逆境中的生物學(xué)功能尚待進(jìn)一步研究。下一步將研究BoMYB基因在滲透脅迫下的表達(dá)模式，并明確其在該脅迫下的功能。

參考文獻(xiàn)：

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[ 3 ] Hiroshi A，Takeshi U，Takuya I，et al.Arabidopsis At MYC2 （b HLH）and At MYB2 （MYB） function as transcriptional activators in abscisic acid signaling[J]. The Plant Cell，2003，15（01）：63-78.

[ 4 ] 許玲，衛(wèi)培培，張大勇，等. 大豆轉(zhuǎn)錄因子基GmMYB111的克隆及功能分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（15）：3 079-3 089.

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[ 6 ] Abe H，Urao T，Ito T，et al. Arabidopsis AtMYC2（bHLH） and AtMYB2 （MYB） function as transcriptional activators in abscisic acid signaling[J]. Plant Cell，2003（15）：63-78.

[ 7 ] 牛義嶺，姜秀明，許向陽(yáng).植物轉(zhuǎn)錄因子MYB 基因家族的研究進(jìn)展[J]. 分子植物育種，2016，14（08）：2 050-2 059.

（收稿日期：2018-12-17）