孟文俊 張愛(ài)麗 蔣樂(lè)曉 朱文杰 段麗 錢子剛

摘?要：金鐵鎖是 “云南白藥”等多種中成藥的重要組成，其有效成分為三萜皂苷，MYC類轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物三萜類次生代謝積累中有重要作用。為研究ptMYC2 基因在金鐵鎖三萜皂苷合成代謝途徑的調(diào)控機(jī)制，該研究基于金鐵鎖轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，克隆得到ptMYC2轉(zhuǎn)錄因子的兩個(gè)全長(zhǎng)基因;通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)兩條轉(zhuǎn)錄因子的同源性、理化性質(zhì)、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域、靶基因結(jié)合位點(diǎn)等進(jìn)行初步預(yù)測(cè)分析。結(jié)果表明：兩條轉(zhuǎn)錄因子所編碼的蛋白屬于親水性蛋白，不存在跨膜區(qū)域，均是非分泌蛋白質(zhì)，且不存在信號(hào)肽;兩條轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核;結(jié)構(gòu)域分析顯示，兩個(gè)基因都含有bHLH家族結(jié)構(gòu)域;預(yù)測(cè)得到金鐵鎖三萜皂苷合成途徑中HMGR、FPS、SE、β-AS等基因的啟動(dòng)子可能存在與MYC2結(jié)合的E-box特異性結(jié)合位點(diǎn)。該研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究ptMYC2基因在金鐵鎖三萜皂苷合成代謝途徑的調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 金鐵鎖， 轉(zhuǎn)錄因子， MYC2， 三萜皂苷， 生物合成途徑， 生物信息學(xué)分析

MENG Wenjun， ZHANG Aili， JIANG Lexiao， ZHU Wenjie， DUAN Li ， QIAN Zigang*

（ Certer for Reproducing Fine Varieties of Chinese Medicinal Plants， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China ）

Abstract：Psammosilene tunicoides is an important component of various Chinese patent medicines such as “Yunnan Baiyao”， and its active ingredient is triterpenoid saponin. MYC2 is an important transcription factor， which plays an important role in regulating the secondary metabolic accumulation of triterpenoids in plants. In this study， we cloned two transcription factors（ ptMYC2-1 and ptMYC2-2 ） of Psammosilene tunicoides based on transcriptome sequencing. Meanwhile， the homology， physical and chemical parameters， hydrophobicity， transmembrane helices， subcellular location， domain， target gene binding site were predicted through bioinformatics software. The experimental results showed that the proteins encoded by the two transcription factors belonged to the hydrophilic protein and did not exist the transmembrane region， and both of them were non-secreted proteins， and without signal peptide. The subcellular of two transcription factors localizes to the nucleus. Domain analysis revealed that both genes contained the bHLH family domain. We predicted that the promoter of these genes（ HMGR， FPS， SE and β-AS）， which involved the triterpenoid saponin synthesis pathway of Psammosilene tunicoides， contained the E-box binding domain. This study provides the basic information for stu-dying the regulatory mechanisms of the ptMYC2 gene in the metabolic pathway of triterpenoid saponins.

Key words： Psammosilene tunicoides， transcription factor， MYC2， triterpenoid saponin， biosynthetic pathway， bioinformatics analysis

金鐵鎖（Psammosilene tunicoides）是云南道地的瀕危藥用植物，是“云南白藥”等多種中成藥的重要組成。其活性成分是齊墩果烷型三萜皂甙，具有顯著的鎮(zhèn)痛和抗炎等藥理活性（Zhang et al.，2012）。由于其顯著的藥理活性，該藥藥用資源已開始匱乏。因此，揭示相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在金鐵鎖三萜皂苷合成途徑的調(diào)控機(jī)制，定向增加金鐵鎖三萜皂苷的積累，顯得尤為重要。

茉莉酸（JAs）是植物中重要的植物激素（包括JA及其甲酯衍生物MeJA），它是植物響應(yīng)生物或非生物脅迫的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（Devoto & Turner，2010;王云鋒等，2019）。其通過(guò)在次生代謝過(guò)程中調(diào)節(jié)相關(guān)酶基因，可以合成次生代謝產(chǎn)物，如類黃酮和萜類化合物，從而提高植物的抗逆性。其中MYC2轉(zhuǎn)錄因子是茉莉酸（JAs）信號(hào)途徑中的重要轉(zhuǎn)錄因子，其可以通過(guò)和靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)（Nims et al.，2009）。當(dāng)植物處于正常狀態(tài)下，植物體內(nèi)的核蛋白JAZ（Jasmonate-ZIM Domain）及一些共同抑制物（如TOPLESS或TPL-related proteins TPLs）能夠抑制JA信號(hào)途徑中的轉(zhuǎn)錄因子，使其不能正常和靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄因子激活下游基因的表達(dá)（Chini et al.，2007）。相反，當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，JA可以與異亮氨酸共軛以形成茉莉酸異亮氨酸共軛物JA-Ile。 JA-Ile具有一定的生物活性，能使 JAZ蛋白與 Skp1/ Cullin1/ F-box protein COI1（ SCF COI1）形成共軛復(fù)合體，該復(fù)合物被26 S蛋白酶降解，其釋放轉(zhuǎn)錄因子并調(diào)節(jié)下游應(yīng)激基因的表達(dá)，促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的積累（Thines et al.，2007）。目前，已有一些關(guān)于MYC2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物合成的研究報(bào)道，如煙草中尼古丁的合成需要NtMYC2的參與，NtMYC2a和NtMYC2b可與抑制因子NtJAZ1形成核配合物，并調(diào)節(jié)茉莉酸誘導(dǎo)的尼古丁生物合成的多個(gè)步驟（Zhang et al.，2012）。 Hong et al.（2012）發(fā)現(xiàn)MYC2通過(guò)直接結(jié)合到倍半萜合酶TPS21和TPS11的啟動(dòng)子區(qū)激活表達(dá)，調(diào)節(jié)萜類合酶基因表達(dá)和揮發(fā)性倍半萜的合成。在長(zhǎng)春花中，CrMYC2作為早期茉莉酸甲酯響應(yīng)因子，通過(guò)調(diào)節(jié)ORCA基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)控一系列吲哚類生物堿（TIAs） 合成酶基因的表達(dá)（Zhang et al.，2011）。但是，對(duì)金鐵鎖轉(zhuǎn)錄因子的研究尚未見(jiàn)有報(bào)道。目前，課題組前期已經(jīng)克隆了金鐵鎖齊墩果烷型三萜皂苷生物合成途徑中多個(gè)關(guān)鍵酶基因，但轉(zhuǎn)錄因子對(duì)這些基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚不清楚。鑒于此，本研究克隆了金鐵鎖中相關(guān)的ptMYC2基因，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)可能與克隆的ptMYC2相互作用的靶基因。為揭示金鐵鎖三萜皂苷代謝途徑的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制奠定一定的基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1 植物材料

金鐵鎖采集于云南省麗江市，經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院錢子剛教授鑒定為石竹科金鐵鎖屬植物金鐵鎖（Psammosilene tunicoides）。

1.2 主要儀器

高速冷凍離心機(jī)（eppendorf）;電泳儀（BIO-RAD 公司）;DYC-33A 微型電泳槽（BIO-RAD 公司）;凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD 公司）; PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（BIO-RAD 公司）;移液槍（eppendorf）;常用耗材均購(gòu)自昆明鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑

TaKaRa Minibest Universal RNA Extraction Kit RNA提取試劑盒（TaKaRa生產(chǎn)批號(hào)為AK1602）;TaKaRa PrimeScriptTM11st cDNA Synthesis Kit（TaKaRa 生產(chǎn)批號(hào)為AK4501 ）反轉(zhuǎn)錄試劑盒;TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extracyion Kit Ver 4.0割膠回收試劑盒（TaKaRa 生產(chǎn)批號(hào)為AK1901）aKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 4.0 質(zhì)粒提取試劑盒;DL2000 DNA Marker（ TaKaRa 生產(chǎn)批號(hào)為A2101A）等。

1.4 方法

1.4.1 引物設(shè)計(jì)?依據(jù)金鐵鎖轉(zhuǎn)錄組中調(diào)控因子ptMYC2的兩條基因序列分別設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物（表1）。

1.4.2 轉(zhuǎn)錄因子ptMYC2的克隆?采用總RNA提取試劑盒提取金鐵鎖根中總RNA;采用Takara 的PrimeScriptTM11st cDNA Synthesis Kit試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)得到第一鏈cDNA，以該cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行兩條ptMYC2的全長(zhǎng)擴(kuò)增。其中PCR體系如表2和表3。

經(jīng)過(guò)多次篩選，確定的ptMYC2-1的體系：98 ℃、1 min，98 ℃、10 s，48 ℃、15 s，72 ℃、45 s共32個(gè)循環(huán);72 ℃、10 min，4 ℃終止。ptMYC2-2的體系：98 ℃、 1 min，98 ℃、10 s，55 ℃、15 s，72 ℃、45 s共32個(gè)循環(huán);72 ℃、10 min，4 ℃終止。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，使用試劑盒（TaKaRa）割膠回收并純化，經(jīng)過(guò)測(cè)序得到序列信息。

1.4.3 轉(zhuǎn)錄因子ptMYC2的T克隆載體構(gòu)建?將純化后的產(chǎn)物與1 μL PMDTM 18-T vector cloning Kit構(gòu)建10 μL連接體系，連接后轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB固體培養(yǎng)基（氨芐青霉素抗性）上，37 ℃溫育培養(yǎng)，后挑單克隆過(guò)夜培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒按說(shuō)明提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR驗(yàn)證后進(jìn)行測(cè)序。

1.4.4 轉(zhuǎn)錄因子ptMYC2的生物信息學(xué)分析?對(duì)金鐵鎖的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ptMYC2的兩個(gè)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。在NCBI（https： //www.ncbi.nlm.nih.gov/） 網(wǎng)站上通過(guò) BLAST程序進(jìn)行序列同源性比對(duì);使用ORF Finder（https： //www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/ ）尋找其開放閱讀框;通過(guò)ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。使用ProtScale（https： //web.expasy.org/protscale/）軟件進(jìn)行疏水性分析;在TMHMM（http： //www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白的跨膜區(qū)域;運(yùn)用在線工具SignalP3.0（http： //www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）服務(wù)器進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析;通過(guò)TargetP 1.1 Server（http： //www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）和Cell-PLoc 2.0（http： / /www. csbio. sjtu. edu. cn/bioinf/Cell-PLoc-2/） 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位情況;使用 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）軟件對(duì) ptMYC2-1和 ptMYC2-2的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè);應(yīng)用在線軟件CFSSP（http： //www.biogem.org/tool/chou-fasman/index.php）對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)SWISS-MODEL（https： //swissmodel.expasy.org/interactive）進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);應(yīng)用 MEGA 5. 0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;在NCBI中使用 Blast來(lái)搜索目標(biāo)基因的相似性，參照最高相似物種的序列搜索該序列的基因組序列，并下載目標(biāo)基因上游2 000 bp的區(qū)域作為該目標(biāo)基因的啟動(dòng)子序列，采用JASPAR2016 server預(yù)測(cè)可能與ptMYC2互作的靶基因及結(jié)合信息位點(diǎn)。

2?結(jié)果與分析

2.1 金鐵鎖轉(zhuǎn)錄因子ptMYC2的克隆

提取金鐵鎖根的總RNA進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到的RNA條帶清晰，表明提出金鐵鎖RNA。將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，PCR擴(kuò)增后經(jīng)過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并測(cè)序驗(yàn)證。將全長(zhǎng)構(gòu)建入T克隆載體，測(cè)序后結(jié)果表明擴(kuò)增序列與轉(zhuǎn)錄組序列基本一致。

2.2 金鐵鎖轉(zhuǎn)錄因子基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 轉(zhuǎn)錄因子基因同源性分析?通過(guò)NCBI Blast進(jìn)行同源性分析，由結(jié)果可知，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子ptMYC2與其他植物的MYC2轉(zhuǎn)錄因子具有同源性，根據(jù)結(jié)果推測(cè)擴(kuò)增出金鐵鎖ptMYC2-1和ptMYC2-2基因。

2.2.2 轉(zhuǎn)錄因子基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析?ptMYC2-1轉(zhuǎn)錄因子的蛋白理化性質(zhì)由Protparam在線工具預(yù)測(cè)后，分析結(jié)果顯示ptMYC2-1轉(zhuǎn)錄因子開放閱讀框1 713 bp，編碼了570個(gè)氨基酸;預(yù)測(cè)分子式為C2779H4407N787O885S23;分子量為6 374.68;理論等電點(diǎn)為6.06;在組成的氨基酸當(dāng)中，絲氨酸（Ser）占比達(dá)11.4%，相對(duì)較高;不穩(wěn)定參數(shù)為47.66，推測(cè)ptMYC2-1蛋白為不穩(wěn)定蛋白; 脂肪族指數(shù)為76.91。使用相同的方法來(lái)預(yù)測(cè)ptMYC2-2轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)，ptMYC2-2的開放閱讀框長(zhǎng)度為1 902 bp，轉(zhuǎn)錄因子編碼663個(gè)氨基酸;推測(cè)蛋白質(zhì)分子式為C3018H4763N863O972S20;分子量為69 330.42;理論等電點(diǎn)為5.33;在組成的氨基酸當(dāng)中，也是絲氨酸（Ser）占比最高，達(dá)到10.6%;不穩(wěn)定參數(shù)為52.4，推測(cè)ptMYC2-2 的蛋白為不穩(wěn)定的蛋白;脂肪指數(shù)為70.88。

2.2.3 轉(zhuǎn)錄因子基因編碼蛋白質(zhì)的疏水性分析?采用 ProtScale 對(duì)金鐵鎖轉(zhuǎn)錄因子ptMYC2-1和ptMYC2-2的氨基酸序列的疏水性/親水性進(jìn)行分析，從結(jié)果可知 （圖1，圖2）， 在379 bp左右位置ptMYC2-1蛋白有一個(gè)典型的親水性區(qū)域;在89 bp左右位置ptMYC2-2蛋白有一個(gè)典型的親水性區(qū)域。

2.2.4 轉(zhuǎn)錄因子基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)分析?通過(guò)TMHMM2.0對(duì)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，這兩個(gè)基因編碼的蛋白均不存在跨膜區(qū)域，都不屬于跨膜蛋白。

2.2.5 轉(zhuǎn)錄因子基因編碼蛋白質(zhì)的信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析?ptMYC2-1 和ptMYC2-2使用 SignalP 3. 0 軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，從神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型分析，可以判斷兩種蛋白質(zhì)都沒(méi)有信號(hào)肽。隱馬爾福模型進(jìn)一步證實(shí)，金鐵鎖ptMYC2-1和ptMYC2-2編碼的蛋白質(zhì)均是非分泌蛋白質(zhì)，并且不存在信號(hào)肽。由在線細(xì)胞定位分析工具TargetP1.1服務(wù)器分析ptMYC2-1和ptMYC2-2編碼的蛋白的定位情況，結(jié)果顯示都定位在其他細(xì)胞器，再由Cell-PLoc 2.0進(jìn)行具體定位分析，兩個(gè)因子均定位在細(xì)胞核。

2.2.6 轉(zhuǎn)錄因子基因結(jié)構(gòu)域分析?使用 SMART軟件對(duì) ptMYC2-1和 ptMYC2-2的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果得知ptMYC2-1從39到218位置之間存在一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)功能域 bHLH（圖3）。ptMYC2-2從 28到 208位置之間存在一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)功能域bHLH（圖4）。即 bHLH家族成員共有的典型結(jié)構(gòu)域。

2.2.7 轉(zhuǎn)錄因子基因編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)?通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)軟件CFSSP對(duì)ptMYC2-1和ptMYC2-2分別進(jìn)行分析，結(jié)果如下圖所示，ptMYC2-1編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋（H）占70%，β折疊（E）占57.2%，轉(zhuǎn)角（T）占14.0%。ptMYC2-2編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋（H）占65.9%，β折疊（E）占51.3%，轉(zhuǎn)角（T）占14.4%。兩個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)均是混合型。以擬南芥 AtMYC2蛋白（登錄號(hào) NM-102998.3）為參比模板，利用 SWISS-MODEL對(duì) ptMYC2-1和 ptMYC2-2的蛋白質(zhì)三維立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果如下圖所示（圖5、圖6和圖7），金鐵鎖ptMYC2蛋白的bHLH區(qū)域與擬南芥AtMYC2蛋白的bHLH區(qū)域結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)相似。相同bHLH和不同bHLH轉(zhuǎn)錄因子的α-螺旋之間可以相互作用，形成同源或異源二聚體從而與靶基因啟動(dòng)子的不同部位結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

2.2.8 轉(zhuǎn)錄因子基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建?將金鐵鎖 ptMYC2-1和ptMYC2-2與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中多種植物的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行比對(duì)分析后，選取相似性高的植物的MYC2轉(zhuǎn)錄因子，利用 MEGA 5. 0中的 Neighbor-Joining 方法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明ptMYC2-1與藜麥的MYC2親緣關(guān)系接近（圖8）。ptMYC2-2也與藜麥中的MYC2 親緣關(guān)系接近（圖9）。由于藜麥屬于藜科，金鐵鎖屬于石竹科，藜科與石竹科均屬于較原始的類群，親緣關(guān)系較近，所以本研究克隆得到的金鐵鎖ptMYC2與藜麥的cqMYC2聚為一類。

2.2.9 轉(zhuǎn)錄因子與靶基因結(jié)合位點(diǎn)信息分析?MYC類轉(zhuǎn)錄因子對(duì)目的基因的調(diào)控，是通過(guò)與目的基因啟動(dòng)子的E-box特異性結(jié)合域的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。由于金鐵鎖還未進(jìn)行過(guò)全基因組測(cè)序，本研究通過(guò)Blast軟件對(duì)金鐵鎖三萜皂苷合成途徑上的關(guān)鍵酶基因HMGR、SE、FPS、β-AS分別進(jìn)行相似性搜索，其中，金鐵鎖HMGR的基因序列與胡楊（Populus euphratica）的相似性最高，SE1與甜菜 （Beta vulgaris subsp.）的相似性最高，SE2、FPS、β-AS的序列與藜麥（Chenopodium quinoa）的相似性最高，分別下載相似性最高物種基因上游2 000 bp的區(qū)域作為該基因的啟動(dòng)子序列（啟動(dòng)子序列見(jiàn)附錄），分析預(yù)測(cè)可能與ptMYC2互作的靶基因及結(jié)合信息位點(diǎn)，結(jié)果如表4所示。

3?討論

金鐵鎖是西南地區(qū)的珍稀瀕危藥材， 為多種著名中成藥的重要組成，其有效成分為五環(huán)三萜皂苷。由于其顯著的藥理活性，金鐵鎖資源遭到大量的挖掘破壞，已處于瀕危狀態(tài)，目前已被IUCN收錄為瀕危種。MYC類轉(zhuǎn)錄因子是植物茉莉酸類激素響應(yīng)途徑中的核心轉(zhuǎn)錄因子，近年來(lái)，在煙草（Zhang et al.，2012）、擬南芥（Hong et al.，2012）、長(zhǎng)春花（Hedhili et al.，2010）、紅豆杉（Lenka et al.，2015）等植物中克隆得到的MYC2轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)其都參與調(diào)節(jié)了次生代謝產(chǎn)物的合成。在發(fā)現(xiàn)的眾多MYCs轉(zhuǎn)錄因子中，MYC2是研究較多的一類轉(zhuǎn)錄因子。鑒于此，本研究開展對(duì)金鐵鎖轉(zhuǎn)錄因子ptMYC2的研究，以期能夠獲得參與金鐵鎖有效成分調(diào)控的ptMYC2轉(zhuǎn)錄因子，為后期完成金鐵鎖有效成分的定向積累奠定基礎(chǔ)。

本研究克隆得到兩條具有完整開放閱讀框ORF的ptMYC2轉(zhuǎn)錄因子，ptMYC2-1與 ptMYC2-2的 ORF長(zhǎng)度分別為1 713 bp和1 902 bp，分別編碼570個(gè)和633個(gè)氨基酸殘基，分子量為63.75 kD和69.33 kD。 通過(guò)SMART軟件分析，ptMYC2-1與ptMYC2-2都存在一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)功能域bHLH，具有bHLH家族成員共有的典型結(jié)構(gòu)域。從三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖可以看出，所獲得的兩條ptMYC2基因與擬南芥的AtMYC2有相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)，都具有bHLH家族共有的α螺旋1-環(huán)-α螺旋2（ helix-loop-helix）保守結(jié)構(gòu)域，該 helix-loop-helix結(jié)構(gòu)可以與靶基因啟動(dòng)子相結(jié)合，從而發(fā)揮對(duì)基因的調(diào)控作用（Stevens et al.，2010）。同時(shí)，將該兩條序列與其他氨基酸序列進(jìn)行BlastX同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，本研究克隆得到的兩條MYC2編碼的蛋白與煙草（Nicotiana tabacum）的NtMYC2編碼蛋白同源性在50%以上，煙草中該轉(zhuǎn)錄因子主要是參與調(diào)控了煙草中尼古丁的生物合成（Zhang et al.，2012），故推測(cè)該兩條ptMYC2轉(zhuǎn)錄因子也可能與金鐵鎖次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控有關(guān)。

MYC2轉(zhuǎn)錄因子主要是通過(guò)與目的基因DNA的結(jié)合來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。而這些與目的基因的特異性結(jié)合區(qū)域，一般都存在于目的基因的啟動(dòng)子上（沈乾等，2012）。因此，預(yù)測(cè)MYC2啟動(dòng)子與靶基因的特異性結(jié)合區(qū)域是研究轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的前提。bHLH蛋白可分為A，B，C，D，E和F，這取決于bHLH的基本DNA結(jié)合模式。B類 bHLH可與具有5′-CACGTG-3′特征的E-box結(jié)合，其中包括 MYC家族（Ledent & Vervoort，2001）。因此，本研究以E-box作為結(jié)合片段，選取課題組前期研究三萜皂苷合成途徑中的幾個(gè)關(guān)鍵酶基因作為靶基因，通過(guò)Blast軟件對(duì)這些關(guān)鍵酶基因進(jìn)行相似性搜索，以搜索到的相似性最高的物種為參考，選取參考基因上游2 000 bp作為啟動(dòng)子，分析與ptMYC2靶基因的結(jié)合信息位點(diǎn)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，金鐵鎖三萜皂苷合成途徑中的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A 還原酶（HMGR）、鯊烯環(huán)氧酶（SE）、法尼基焦磷酸合成酶（FPS）、β-香樹素合酶（β-AS）等基因啟動(dòng)子中都有可能具有E-box的特異結(jié)合位點(diǎn)，ptMYC2轉(zhuǎn)錄因子有可能與這些基因互作從而對(duì)其進(jìn)行調(diào)控。沈乾等（2016）在對(duì)青蒿MYC類轉(zhuǎn)錄因子的研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子AaMYC2能與青蒿素生物合成途徑中的P450基因CYP71AV1和DBR2基因的啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而參與調(diào)控青蒿素的生物合成過(guò)程。本研究通過(guò)對(duì)ptMYC2與靶基因結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析，為后續(xù)開展的實(shí)驗(yàn)提供了豐富的基因資源。

綜上所述，本研究克隆得到了兩條ptMYC2轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為后期即將開展的酵母雙雜等驗(yàn)證該兩條轉(zhuǎn)錄因子功能的實(shí)驗(yàn)提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

CHINI A， FONSECA S， FERNANDEZ G， et al.， 2007. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling[J]. Nature， 448（7154）： 666-671.

DEVOTO A， TURNER JG， 2010. Jasmonate-regulated Arabidopsis stress signaling network[J]. Physiol Plant， 123（2）： 161-172.

HEDHILI S， MATTEI MVD， COUDERT Y， et al.， 2010. Three non-autonomous signals collaborate for nuclear targeting of CrMYC2， a Catharanthus roseus， bHLH transcription factor[J]. BMC Res Notes， 3（1）： 301-309.

HONG GJ， XUE XY， MAO YB， et al.， 2012. Arabidopsis MYC2 interacts with DELLA proteins in regulating sesquiterpene synthase gene expression[J]. Plant Cell， 24（6）：2635-2648.

LEDENT V， VERVOORT M， 2001. The basic helix-loop-helix protein family： Comparative genomics and phylogenetic analysis[J]. Genome Res， 11（5）： 754-770.

LENKA SK， NIMS NE， VONGPASEUTHK， et al.， 2015. Jasmonate-responsive expression of paclitaxel biosynthesis genes in Taxus cuspidata cultured cells is negatively regulated by the bHLH transcription factors TcJAMYC1， TcJAMYC2， and TcJAMYC4[J]. Front Plant Sci， 6： 115.

NIMS E， VONGPASEUTH K， ROBERTS SC， et al.， 2009. WITHDRAWN： TcJAMYC： A bHLH transcription factor that activates paclitaxel biosynthetic pathway genes in yew[J]. J Biol Chem， 290（33）： 1-19.

SHEN Q， LU X， YAN T， et al.， 2016. The jasmonate-responsive AaMYC2 transcription factor positively regulates artemisinin biosynthesis in Artemisia annua[J]. New Phytol， 210（4）： 1269-1281.

SHEN Q， LU X， ZHANG L， et al.， 2012. Advances in research on the function of MYC2 transcription factors in plants [J]. J Shanghai Jiaotong Univ （Agric Sci Ed）， 30（6）： 51-57.[沈乾， 陸續(xù)， 張凌， 等， 2012. 植物中 MYC2 轉(zhuǎn)錄因子功能研究進(jìn)展 [J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版）， 30（6）：51-57. ].

STEVENS JD， ROALSON EH， SKINNER MK， 2010. Phylogenetic and expression analysis of the basic helix-loop-helix transcription factor gene family： Genomic approach to cellular differentiation [J]. Differentiation， 76（9）： 1006-1022.

THINES B， KATSIR L， MELOTTO M， et al.， 2007. JAZ repressor proteins are targets of the SCF（COI1） complex during jasmonate signalling[J]. Nature， 448（7154）： 661-665.

WANG YF， LI CQ， HAN GY， et al.， 2019. Effect of different treatments of jasmonic acid on rice blast disease control and its effect on rice defense system [J]. J S Agric，50（3）：562-569. [王云鋒， 李春琴， 韓光煜，等， 2019. 茉莉酸不同方式處理水稻對(duì)稻瘟病的防控效果及對(duì)水稻防御體系的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 50（3）：562-569.]

ZHANG H， HEDHILI S， MONTIEEL G， et al.， 2011. The basic helix-loop-helix transcription factor CrMYC2 controls the jasmonate-responsive expression of the ORCA genes that regulate alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus[J]. Plant J， 67（1）： 61-71.

ZHANG HB， BOKOWIEC MT， RUSHTON PJ， et al.， 2012. Tobacco transcription factors NtMYC2a and NtMYC2b form nuclear complexes with the NtJAZ1 repressor and regulate multiple jasmonate-inducible steps in nicotine biosynthesis[J]. Mol Plant， 5（1）： 73-84.

ZHANG J， CAO W， TIAN J， et al.， 2012. Evaluation of novel saponins from Psammosilene tunicoides and their analogs as immunomodulators[J]. Int Immunopharmacol， 14（1）： 21-26.