趙思涵　顏彥　陳志晟　商桑　田麗波　胡偉

摘要：【目的】解析木薯脫落酸（ABA）受體PYR/PYL/RCARs家族基因（MePYL13）在木薯塊根采后生理性變質(zhì)（PPD）過(guò)程中的功能作用，為后續(xù)探索ABA信號(hào)通路在木薯PPD中的功能及作物抗逆育種打下基礎(chǔ)?！痉椒ā繌哪臼砥贩NSC8中克隆MePYL13基因，應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法對(duì)其編碼蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性、保守結(jié)構(gòu)域及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)基因上游啟動(dòng)子進(jìn)行元件分析，通過(guò)亞細(xì)胞定位觀察MePYL13蛋白在植物細(xì)胞中的定位情況，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MePYL13基因在木薯PPD過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)量?！窘Y(jié)果】克隆獲得的MePYL13基因編碼區(qū)（CDS）長(zhǎng)度663 bp，編碼220個(gè)氨基酸，蛋白分子量23.957 kD，理論等電點(diǎn)（Ip）為6.74。MePYL13蛋白與巴西橡膠樹（XP_021654464.1）PYL家族蛋白的氨基酸序列同源性最高，為91.55%，表明MePYL13蛋白氨基酸序列具有高度保守性。從MePYL13基因啟動(dòng)子鑒定獲得與非生物脅迫逆境相關(guān)的響應(yīng)元件，包括厭氧誘導(dǎo)元件（ARE，AAACCA）、光響應(yīng)元件（ATCT-motif，AATCTAATCC）、干旱MYB元件（MBS，TAACTG）及ABA應(yīng)答元件（ABRE，AAACAGA）和分生組織表達(dá)相關(guān)元件（CAT-box，GCCACT）等;MePYL13蛋白在木薯細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)上均有表達(dá)。隨著PPD進(jìn)程的推移，MePYL13基因相對(duì)表達(dá)量整體上呈上升趨勢(shì)，至PPD后期（48 h）其相對(duì)表達(dá)量是0 h時(shí)（PPD前）的16倍，即MePYL13基因受木薯塊根PPD的顯著誘導(dǎo)?！窘Y(jié)論】MePYL13基因是PYR/PYL/RCARs家族成員，可能在木薯塊根PPD過(guò)程中發(fā)揮正向調(diào)控作用，為培育木薯PPD改良品種提供了潛在基因資源。

關(guān)鍵詞： 木薯;PYR/PYL/RCARs家族;MePYL13基因;生理性變質(zhì)現(xiàn)象（PPD）;表達(dá)特征

中圖分類號(hào)： S533.01? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）12-2629-09

Cloning and expression analysis of MePYL13 gene in cassava

ZHAO Si-han1，2， YAN Yan2， CHEN Zhi-sheng1，2， SHANG Sang1， TIAN Li-bo1*， HU Wei2*

（1 College of Horticulture， Hainan University， Haikou? 570228， China; 2Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Haikou? 571101， China）

Abstract：【Objective】In this paper， abscisic acid（ABA） receptor PYR/PYL/RCARs family member（MePYL13） was cloned from cassava genome and its biological information and the expression characteristics in the process of post-harvest physiological deterioration（PPD） in cassava were analyzed， which provided a theoretical basis for further exploring the regulatory mechanism of ABA signaling pathway in cassava PPD and crop breeding for stress tolerance. 【Method】MePYL13 was cloned from cassava variety SC8. The physicochemical properties， hydrophilic/hydrophobic， conserved domain， secondary and tertiary structures of the protein encoded by the gene were predicted， the elements in MePYL13 gene promoter were analyzed through bioinformatics analysis. Subcellular localization of MePYL13 protein was also identified. Besides， the expression pattern of MePYL13 in cassava PPD process was investigated by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The coding regions（CDS） of this gene was 663 bp in length and encoded 220 amino acids， the protein molecular weight was 23.957 kD， and the theoretical isoelectric point（Ip） was 6.74. Multiple sequence alignment indicated that the similarity of MePYL13 protein with Hevea brasiliensis（XP_021654464.1） was the highest（91.55%）. Amino acid sequence of MePYL13 protein was highly conservative. Several elements related to abiotic stress response were identified from the promoter of MePYL13， including anaerobic induction elements（ARE， AAACCA）， light response elements（ATCT-motif，AATCTAATCC）， drought MYB element（MBS， TAACTG）， ABA response elements（ABRE， AAACAGA） and meristem expression-related elements（CAT-box， GCCACT）， and so on. Subcellular location study indicated that MePYL13 protein was distributed in the nucleus and cytoplasm. Totally， MePYL13 was up-regulated at all the three time points in storage roots after harvested， and its relative expression level at 48 h was 16 times of that at 0 h（before PPD）. Thus， MePYL13 was significantly increased in PPD process. 【Conclusion】 It is inferred that MePYL13 is a member of the PYR/PYL/RCARs family and may play a positive role in regulating PPD of cassava storage roots. This study is beneficial in providing potential genetic resources for cultivating improved cassava PPD varieties.

Key words： cassava; PYR/PYL/RCARs family; MePYL13 gene; post-harvest physiological deterioration（PPD）; expression characters

0 引言

【研究意義】木薯（Manihot esculenta）作為世界七大作物之一（方佳等，2010），全球現(xiàn)有90多個(gè)國(guó)家栽培種植，熱帶地區(qū)近8億人口將木薯塊根作為主要糧食（Liu et al.，2017）。在我國(guó)，木薯主要種植在華南地區(qū)，因具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、耐貧瘠和干旱土壤、少有病蟲害等優(yōu)點(diǎn)，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展?jié)摿薮?，目前在食品、飼料及工業(yè)等領(lǐng)域均有開發(fā)利用（Fermont et al.，2009;Burns et al.，2010;El-Sharkawy，2012;Xu et al.，2013）;但木薯塊根極不耐儲(chǔ)藏，采后2～3 d即出現(xiàn)生理性變質(zhì)現(xiàn)象（Post-harvest physiological deterioration，PPD）而造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約木薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展（趙平娟等，2013;Uarrota and Maraschin，2015）?；钚匝醴e累是PPD發(fā)生的根本原因之一，有效激活活性氧清除系統(tǒng)，控制木薯采后塊根活性氧水平，是延緩木薯PPD的有效手段（Reilly et al.，2004，2007;Owiti et al.，2011;Vanderschuren et al.，2014）。脫落酸（Abscisic acid，ABA）除了參與種子萌發(fā)（Feng et al.，2015）、植株發(fā)育（Jia et al.，2016）、果實(shí)成熟（Mou et al.，2016;Tijero et al.，2016）及其他生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)控（Li et al.，2016;顏彥等，2018）外，還廣泛參與植物應(yīng)答多種非生物脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Umezawa et al.，2010;Boneh et al.，2012;Chen et al.，2018;Kuromori et al.，2018），如干旱、低溫、高鹽和氧化脅迫等。PYR/PYL/RCARs蛋白為植物中功能性ABA受體，屬于配體結(jié)合蛋白的START（Star-related lipid-transfer）超家族，在ABA介導(dǎo)的多種非生物脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用（Ma et al.，2009;Park et al.，2009）。因此，克隆木薯PYL13基因（MePYL13）并分析其表達(dá)特征，可為闡明MePYL13基因參與調(diào)控木薯PPD的分子機(jī)制提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今，已有多種植物鑒定獲得PYR/PYL/RCARs家族基因，如從擬南芥中鑒定出14個(gè)（Park et al.，2009;Gonzalez-Guzman et al.，2012），從水稻中鑒定出13個(gè)（Kim et al.，2014），從番茄中鑒定出15個(gè)（González-Guzmán et al.，2014），從棉花中鑒定出22個(gè)（Liang et al.，2017）;并研究證實(shí)PYR/PYL/RCAR基因可增強(qiáng)番茄（González-Guzmán et al.，2014）、水稻（Kim et al.，2014）和擬南芥（Zhao et al.，2016）的耐旱性。在擬南芥中，有研究報(bào)道AtPYL8和AtPYL9基因可影響根部的發(fā)育（Antoni et al.，2013;Xing et al.，2016），AtPYL9基因還參與調(diào)節(jié)植物葉片衰老，當(dāng)擬南芥中過(guò)表達(dá)AtPYL5和AtPYL9基因時(shí)能增強(qiáng)植株對(duì)ABA的敏感性和耐旱性（Santiago et al.，2009;Zhao et al.，2016）。也有研究表明，當(dāng)植物經(jīng)受干旱脅迫時(shí)其內(nèi)源ABA水平增加，進(jìn)而誘導(dǎo)H2O2產(chǎn)生并激活Ca2+通道，引起氣孔關(guān)閉;而pyr1/pyl1/pyl2/pyl4突變體會(huì)抑制ABA誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生和氣孔關(guān)閉（Wang et al.，2013）。Kim等（2014）、顏彥等（2018）研究表明，水稻中OsPYL5基因過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性，且在種子萌發(fā)過(guò)程中對(duì)ABA較敏感。Liang等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下耐旱棉花品種中GhPYL9-11A基因的表達(dá)水平高于不耐旱棉花品種，將該基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株在種子萌發(fā)和幼苗早期對(duì)ABA的敏感性。Yu等（2017）將PtPYRL1和PtPYRL5基因分別在楊樹中過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株具有更強(qiáng)的活性氧清除能力，在逆境脅迫下具有更好的耐受性，說(shuō)明PtPYRL1或PtPYRL5基因在楊樹ABA信號(hào)途徑中發(fā)揮正向調(diào)控作用?？梢姡琍YL基因響應(yīng)多種非生物逆境脅迫，并參與調(diào)節(jié)植物的多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育代謝過(guò)程?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】PYR/PYL/RCARs家族成員作為ABA受體，在ABA介導(dǎo)的非生物脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要功能作用，但至今鮮見有關(guān)木薯PYL基因克隆及其分析表達(dá)特性的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】克隆木薯PYR/PYL/RCARs家族基因MePYL13全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)及表達(dá)分析，旨在解析MePYL13基因在木薯塊根應(yīng)答PPD信號(hào)通路中的功能作用，為后續(xù)探索ABA信號(hào)通路在木薯PPD中的功能及作物抗逆育種打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

木薯品種SC8由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所保存提供。多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，pMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，大腸桿菌（Escherichia coli） TOP10、2×Taq Master Mix酶和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，農(nóng)桿菌GV3101（PSoup+P19）購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司，載體pNC-Green-SubC和Nimble Cloning試劑盒購(gòu)自海南壹田生物科技有限公司，T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1. 2 材料處理

將木薯塊根切下1～2片2 cm左右厚的薄片，放入干凈托盤中并置于相對(duì)濕度75%，溫度26 ℃，16 h光照/8 h黑暗光周期的恒溫培養(yǎng)箱中，分別于第0、6、12、24和48 h時(shí)取樣，用液氮冷凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 RNA提取及cDNA合成

使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取木薯SC8塊根RNA，再以反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1. 4 基因克隆及載體構(gòu)建

以木薯SC8塊根的cDNA第一鏈為模板，利用NCBI設(shè)計(jì)MePYL13基因引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：2×Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（MePYL13-F和MePYL13-R）各1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min?；厥占兓疨CR擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMD18-T載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，選擇陽(yáng)性克隆菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確菌液保存并提取質(zhì)粒。

1. 5 生物信息學(xué)分析

利用NCBI鏈接的BLAST對(duì)MePYL13基因進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測(cè)及查找同源序列，以DNAMAN進(jìn)行翻譯和同源性比對(duì)分析;運(yùn)用NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析;利用在線工具ProtParam預(yù)測(cè)MePYL13蛋白的親/疏水性及等電點(diǎn)等理化性質(zhì)，并以SOPMA和SWISS-MODEL進(jìn)行MePYL13蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（顏彥等，2018）;利用MEGA 5.0中的Neighbor-joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹;用Plant CARE進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析。

1. 6 亞細(xì)胞定位

設(shè)計(jì)MePYL13基因引物（pNC-MePYL13-F和pNC-MePYL13-R），以已有質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與載體pNC-Green-SubC用Nimble Cloning試劑盒連接和轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101（PSoup+P19）感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)法將轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌注射至煙草葉片培養(yǎng)48 h。以空載體pNC-Green-SubC為對(duì)照，利用FluoViewTM FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光在細(xì)胞中的分布情況。

1. 7 基因表達(dá)分析

提取各時(shí)間點(diǎn)保存木薯塊根樣品的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計(jì)熒光定量引物qRT-MePYL13-F和qRT-MePYL13-R（表1）及MeEF1基因引物MeEF1-F和MeEF1-R（Xu et al.，2013），以MeEF1基因?yàn)閮?nèi)參基因，在Mx3005P熒光定量PCR儀（上海吉泰生物科技有限公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20.0 μL：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 7.2 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。設(shè)3次重復(fù)，采用2-△△Ct計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量（胡偉等，2015）。

1. 8 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，以SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）（韓瑞才等，2017）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 MePYL13基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的木薯PYL基因（GenBank登錄號(hào)LOC110618627）設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，以木薯SC8塊根cDNA為模板，擴(kuò)增獲得大小約650 bp的特異條帶（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示，目的基因編碼區(qū)（CDS）長(zhǎng)度663 bp，編碼220個(gè)氨基酸，蛋白分子量23.957 kD，理論等電點(diǎn)（Ip）為6.74，命名為MePYL13基因。

2. 2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

MePYL13蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為56.56，表明其為不穩(wěn)定蛋白;親水性平均值（GRAVY）為-0.183，屬于親水性蛋白。MePYL13蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，α-螺旋占32.27%，延伸鏈占19.09%，β-轉(zhuǎn)角占5.45%，無(wú)規(guī)則卷曲占43.18%。應(yīng)用SWISS-MODEL平臺(tái)預(yù)測(cè)MePYL13蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)結(jié)果（圖3）與其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

通過(guò)BLAST比對(duì)分析MePYL13蛋白與其他已知植物PYL家族蛋白的同源性，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，MePYL13蛋白與巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）（XP_021654464.1）PYL家族蛋白的氨基酸序列同源性最高，為91.55%。使用ClustalX進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果表明MePYL13氨基酸序列具有控制ABA結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域Gate。綜上所述，擴(kuò)增獲得的MePYL13基因即為PYR/PYL/RCARs家族成員，且可能具有該基因家族的生物學(xué)功能。

2. 3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果

為進(jìn)一步探究MePYL13蛋白與其他物種PYR/PYL/RCARs家族的進(jìn)化關(guān)系，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中將MePYL13蛋白氨基酸序列與其他物種進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，MePYL13蛋白氨基酸序列與巴西橡膠樹、蓖麻（Ricinus communis）、毛果楊（Populus trichocarpa）、麻瘋樹（Jatropha curcas）、胡楊（Populus euphratica）的PYL蛋白氨基酸序列相似性分別為91.55%、79.71%、77.88%、75.45%和70.44%?；赑YL蛋白氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖5）也顯示，MePYL13蛋白與巴西橡膠樹、蓖麻和麻瘋樹聚類在同一分支上，均為大戟科植物，說(shuō)明PYL蛋白具有較高的同源性;胡桃（Juglans regia）、雷德氏棉（Gossypium raimondii）、棉花（G. hirsutum）和可可（Theobroma cacao）聚類在另一分支上，其物種均起源于熱帶或亞熱帶地區(qū)。說(shuō)明植物中PYL蛋白氨基酸序列高度保守，木薯MePYL13蛋白與巴西橡膠樹PYL蛋白分子進(jìn)化距離最小，親緣關(guān)系最近，其基因功能可能最相似。

2. 4 MePYL13基因啟動(dòng)子元件分析結(jié)果

通過(guò)PlantCARE預(yù)測(cè)分析MePYL13基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000 bp序列的順式作用元件，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)多個(gè)常見的順式作用元件，如TATA-box和CAAT-box，并鑒定獲得與非生物脅迫逆境相關(guān)的響應(yīng)元件，包括厭氧誘導(dǎo)（ARE，AAACCA）、光響應(yīng)（ATCT-motif，AATCTAATCC）、干旱MYB元件（MBS，TAACTG）等，以及ABA應(yīng)答元件（ABRE，AAACAGA）和分生組織表達(dá)相關(guān)元件（CAT-box，GCCACT），說(shuō)明MePYL13基因的表達(dá)可能受多重信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控。

2. 5 MePYL13蛋白亞細(xì)胞定位分析結(jié)果

將MePYL13基因與載體pNC-Green-SubC連接獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101（PSoup+P19）感受態(tài)細(xì)胞中，再通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)法將菌液注射至煙草葉片中，經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到有熒光分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)上（圖7），說(shuō)明MePYL13蛋白在木薯細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)上均有表達(dá)。

2. 6 MePYL13基因表達(dá)分析結(jié)果

為解析MePYL13基因在木薯PPD過(guò)程中的功能，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MePYL13基因在PPD不同時(shí)段的表達(dá)情況。由圖8可知，在木薯塊根PPD早期（6和12 h），MePYL13基因表達(dá)急劇上升，其相對(duì)表達(dá)量分別是0 h時(shí)（PPD前）的6倍和12 倍;隨后MePYL13基因的相對(duì)表達(dá)量有所回落，至24 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量是0 h時(shí)的4倍;在PPD后期（48 h），MePYL13基因表達(dá)繼續(xù)上升，其相對(duì)表達(dá)量是0 h時(shí)的16倍。受PPD誘導(dǎo)，MePYL13基因在木薯塊根中的表達(dá)整體上呈上調(diào)趨勢(shì)，推測(cè)其在木薯PPD過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

3 討論

木薯是我國(guó)熱帶和亞熱帶地區(qū)最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一（張鵬等，2014），但PPD縮短了木薯的貯存期，嚴(yán)重影響其商品價(jià)值。已有研究表明，ABA可能是果實(shí)成熟衰老的上游調(diào)控信號(hào)，進(jìn)而影響采后生理特性及貯藏品質(zhì)（楊方威等，2016）。PYL基因作為ABA信號(hào)通路的核心組成部分（Ma et al.，2009;Park et al.，2009），在ABA介導(dǎo)的非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如AtPYL9基因過(guò)表達(dá)擬南芥植株在干旱條件下可顯著提高其抗氧化酶活性，而減輕細(xì)胞膜損傷（Zhao et al.，2016）;將PtPYRL1或PtPYRL5基因在楊樹中過(guò)表達(dá)，其轉(zhuǎn)基因植株具有更強(qiáng)的活性氧清除能力（Yu et al.，2017）。木薯塊根的PPD過(guò)程主要與活性氧積累有關(guān)（Reilly et al.，2004，2007;Owiti et al.，2011;Vanderschuren et al.，2014）。為解析PYL家族基因在木薯塊根PPD過(guò)程中是否具有功能作用，本研究對(duì)MePYL13基因進(jìn)行克隆及表達(dá)特征分析，結(jié)果表明，MePYL13基因CDS為663 bp，編碼220個(gè)氨基酸，MePYL13蛋白與巴西橡膠樹、蓖麻、毛果楊和麻瘋樹的PYL蛋白氨基酸序列同源性均在75.00%以上，具有控制ABA結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域Gate，且在MePYL13基因啟動(dòng)子上發(fā)現(xiàn)有響應(yīng)ABA誘導(dǎo)的核心元件ABRE。由于不同植物中PYL蛋白高度保守，故推測(cè)PYL蛋白在不同植物中可能發(fā)揮相似的功能（韓瑞才等，2017;鄧小敏等，2018）。

蛋白質(zhì)修飾和含量變化及蛋白間的相互作用是細(xì)胞行使功能的關(guān)鍵，基因編碼蛋白產(chǎn)物因在植物細(xì)胞中發(fā)揮作用的位置不同，其功能也各不相同（邢浩然等，2006）。本研究通過(guò)亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)MePYL13蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，與在擬南芥（Ma et al.，2009）、大豆（Bai et al.，2013）和水稻（Tian et al.，2015）上報(bào)道的PYL家族基因位置一致，說(shuō)明PYL家族基因的功能在不同植物物種中高度保守。此外，MePYL13基因在木薯塊根PPD過(guò)程中的表達(dá)譜顯示，隨著PPD進(jìn)程的推移MePYL13基因相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)，至PPD后期（48 h）其相對(duì)表達(dá)量是0 h時(shí)的16倍，即MePYL13基因受木薯塊根PPD的顯著誘導(dǎo)，由此推測(cè)MePYL13基因在木薯塊根PPD過(guò)程中發(fā)揮正向調(diào)控作用，與PYL基因受非生物逆境脅迫誘導(dǎo)（Antoni et al.，2013;Wang et al.，2013;Xing et al.，2016;Zhao et al.，2016;顏彥等，2018）的結(jié)論一致，今后可通過(guò)在木薯中過(guò)表達(dá)MePYL13基因進(jìn)一步研究其在木薯塊根采后PPD過(guò)程的調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

MePYL13基因是PYR/PYL/RCARs家族成員，可能在木薯塊根PPD過(guò)程中發(fā)揮正向調(diào)控作用，為培育木薯PPD改良品種提供了潛在基因資源。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）