陳少瑜　吳濤　肖良俊

摘要：【目的】揭示三江并流區(qū)金沙江流域云南核桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性及分布特征，為該區(qū)域核桃資源的合理開(kāi)發(fā)利用及科學(xué)保護(hù)提供參考依據(jù)?！痉椒ā垦亟鹕辰饔虿杉?53份云南核桃資源，根據(jù)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）行政區(qū)劃及資源分布情況將其劃分成5個(gè)群體（YL、DQ、QZ、PTG和YC），采用微衛(wèi)星（SSR）分子標(biāo)記進(jìn)行等位片段檢測(cè);運(yùn)用GenAIEx 6.5計(jì)算等位片段數(shù)，并以POPGENE version 1.32分析群體的遺傳多樣性?！窘Y(jié)果】19對(duì)SSR引物共檢測(cè)到130個(gè)等位片段，各片段在153份樣本中的出現(xiàn)頻率各不相同，其中片段A122出現(xiàn)的頻率最高，達(dá)0.8301;有14個(gè)片段頻率最低（稀有等位片段），僅0.0033。5個(gè)群體等位片段數(shù)量占總數(shù)的比例在70.70%～85.38%，Nei’基因多樣性指數(shù)（H）平均為0.6046，Shannon’s信息指數(shù)（I）平均為1.1709，期望雜合度（He）平均為0.6165。5個(gè)群體遺傳多樣性的分布排序依次為QZ>YL>PTG>YC>TD。其中，TD群體高頻率等位片段頻率達(dá)0.9062，稀有等位片段占總稀有等位片段的比例為21.43%;PTG群體稀有等位片段占總稀有等位片段的比例達(dá)42.86%?！窘Y(jié)論】三江并流區(qū)金沙江流域云南核桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性屬于中等水平，應(yīng)采取積極措施進(jìn)行保護(hù)和利用，尤其應(yīng)加強(qiáng)對(duì)野生核桃資源的保護(hù)和利用。開(kāi)展品種選育及種質(zhì)資源保護(hù)工作時(shí)，在選擇遺傳多樣性高的群體基礎(chǔ)上，應(yīng)結(jié)合表型性狀及稀有等位片段頻率的分布特征，側(cè)重于群體內(nèi)單株的選擇。

關(guān)鍵詞： 云南核桃;種質(zhì)資源;SSR標(biāo)記;遺傳多樣性;分布特征;三江并流區(qū)金沙江流域

中圖分類號(hào)： S664.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）12-2656-09

Genetic diversity and distribution characteristic of Juglans sigillata resources along Jinsha River in Three Parallel

Rivers Belt of Yunnan

CHEN Shao-yu1，2， WU Tao1，2， XIAO Liang-jun3

（1Yunnan Academy of Forestry and Grassland，Kunming? 650201， China; 2Laboratory for Conservation and Breeding for Rare， Endangered and Endemic Forest Plants of State Forestry Administration/Yunnan Provincial Key Laboratory for Cultivation and Utilization of Forest Plants，Kunming? 650201， China; 3Institute of Economic Forest Trees， Yunnan Academy of Forestry and Grassland， Kunming? 650201， China）

Abstract：【Objective】In order to provide scientific information for utilization and protection of walnut resource in the area，genetic diversity and distribution characteristic of Juglans sigillata populations along Jinsha River in Three Parallel Rivers Belt of Yunnan was revealed. 【Method】A total of 153 walnut individuals were sampled along Jinsha River. Based on administrative division and distribution characteristic of resources， they were divided into five populations （YL， DQ， QZ， PTG and YC）. Simple sequence repeat（SSR） molecular technique was used to detect allelic fragments. GenAIEx 6.5 was used to calculate number of allelic fragments and POPGENE version 1.32 was used to analyze diversity of populations. 【Result】130 allelic fragments were detected by 19 pairs of primers. The frequency of each allele in 153 samples was different，among which allelic fragment A122 showed the highest frequency with 0.8301，while there were 14 allelic fragments（rare allelic fragments） showed the lowest frequency with only 0.0033. The allele percentage in total of five populations was from 70.70% to 85.38%. The average Nei’s gene diversity was 0.6046 and average Shannon’s information index was 1.1709. The average expected heterozygosity（He） was 0.6165. The order of genetic diversity from high to low of the five populations was QZ，YL，PTG，YC and TD. It was worth noticing that TD population，of which high frequency allelic fragments reached 0.9062，and the proportion of rare allelic fragments was 21.43%. Another population，PTG population，showed the highest rare allelic fragments proportion of 42.86%. 【Conclusion】The J. sigillata genetic diversity in the area is of medium level，which should be protected and utilized reasonably. During the work of breeding and conservation，based on selecting population with high genetic diversity，individuals within populations should be put particular emphasis on while combining phenotypic characters and distribution characteristic of rare allelic fragments.

Key words： Juglans sigillata; germplasm; SSR markers; genetic diversity; distribution characteristic; Jinsha River in Three Parallel Rivers Belt

0 引言

【研究意義】核桃（Juglans spp.）是世界著名的四大堅(jiān)果之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及生態(tài)意義。全世界核桃共有23個(gè)種，我國(guó)有8個(gè)種，目前廣泛栽培的是核桃（J. regia）和云南核桃（深紋核桃、鐵核桃和泡核桃）（J. sigillata）2個(gè)種。其中，核桃適應(yīng)性強(qiáng)，廣泛分布于我國(guó)北方地區(qū)，云南核桃則是我國(guó)的特有種，云南的主要栽培種，主要分布于我國(guó)西南地區(qū)（王滑等，2009）。三江并流區(qū)是由高黎貢山、怒山、云嶺及怒江、瀾滄江、金沙江等構(gòu)成的位于滇西北橫斷山區(qū)的一縱谷地，是世界上生物多樣性最豐富的地區(qū)之一（歐光龍等，2013）。該區(qū)域核桃資源非常豐富，亦是云南核桃的自然分布區(qū)，但目前對(duì)這些資源尚缺乏系統(tǒng)了解，尤其缺乏對(duì)其遺傳背景的系統(tǒng)研究。遺傳多樣性決定了植物種質(zhì)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力和利用潛力，因此遺傳多樣性研究不僅關(guān)系到種質(zhì)資源的有效收集、保護(hù)和利用，還對(duì)植物新品種選育具有重要的指導(dǎo)意義。【前人研究進(jìn)展】DNA分子標(biāo)記技術(shù)已成為當(dāng)前遺傳多樣性評(píng)價(jià)的一項(xiàng)有力工具，廣泛應(yīng)用于各種植物的多樣性研究中（Agarwal et al.，2008）。其中，簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記是基于PCR的核酸多態(tài)檢測(cè)技術(shù)，因具有高靈敏性、高通用性、共顯性及高重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)（Kelkar et al.，2010;Guichoux et al.，2011），在植物的指紋分析、親子鑒定、基因作圖和遺傳結(jié)構(gòu)分析中得到廣泛應(yīng)用（Jones et al.，2010），在核桃種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究中也有應(yīng)用（Chen et al.，2014）。Dangel等（2005）分析了歐美48份核桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性，同時(shí)采用SSR分子標(biāo)記鑒定不同的核桃品種，結(jié)果顯示這些種質(zhì)資源具有較豐富的遺傳多樣性，篩選出的14個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記可有效用于核桃品種鑒定。Victory等（2006）對(duì)美國(guó)闊葉樹(shù)分布中心區(qū)域43個(gè)黑核桃（J. nigra）群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示研究群體具有較豐富的遺傳多樣性，僅輕度偏離哈迪溫伯格比例，認(rèn)為在分析的樣品范圍內(nèi)，黑核桃具有顯著的遺傳同質(zhì)性。郝艷賓等（2007）對(duì)核桃組（Sect. Juglans）種質(zhì)資源中的29份核桃（J. regia L.）樣品、2份鐵核桃（J. sigillata D.）樣品、4份J. sigillata D.× J. regia L.樣品進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，結(jié)果表明核桃組內(nèi)樣品的雜合度較低，聚類分析結(jié)果顯示秦巴山地核桃應(yīng)分別屬于華北和新疆2個(gè)地理生態(tài)型，且認(rèn)為鐵核桃和西藏核桃作為核桃種下的一個(gè)生態(tài)類型更合適。王滑等（2007）對(duì)中國(guó)核桃8個(gè)天然居群的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)居群的遺傳多樣性及居群間的遺傳分化皆處于較高水平，佐證了核桃和云南核桃為同一個(gè)種不同生態(tài)型的觀點(diǎn)。劉曉麗等（2008）對(duì)新疆地區(qū)3個(gè)核桃群體進(jìn)行SSR分子標(biāo)記的遺傳多樣性分析，探討伊犁野核桃、喀什實(shí)生核桃和栽培品種間的親緣演化關(guān)系，結(jié)果表明，3個(gè)核桃群體均具有較高的遺傳多樣性水平，核桃群體間存在基因滲透和基因交流，進(jìn)一步從分子層面證明了我國(guó)是世界栽培核桃的起源中心之一的論斷。徐永杰等（2016）對(duì)大巴山區(qū)12個(gè)實(shí)生居群的386個(gè)實(shí)生單株的堅(jiān)果表型和SSR分子標(biāo)記的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域核桃堅(jiān)果表型和遺傳多樣性均較豐富，大巴山區(qū)核桃在長(zhǎng)期的實(shí)生繁殖和多樣立地環(huán)境中形成了豐富的堅(jiān)果表型和遺傳變異，是我國(guó)重要的核桃資源多樣性分布區(qū)。彭少兵等（2017）利用SSR分子標(biāo)記對(duì)安康串狀核桃及同屬的其他核桃品種進(jìn)行親緣關(guān)系分析，結(jié)果顯示串狀核桃和西洛3號(hào)的親緣關(guān)系最近。Wang等（2015b）對(duì)西藏86份核桃種質(zhì)資源表型和SSR分子標(biāo)記遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果表明86份資源具有中等水平的遺傳多樣性，表型聚類和遺傳距離聚類結(jié)果顯示86份資源未按地理起源聚類?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】三江并流區(qū)復(fù)雜的地形地貌和多樣的氣候蘊(yùn)育了豐富的核桃種質(zhì)資源，但這些資源尚未得到系統(tǒng)研究，更未得到充分的開(kāi)發(fā)和利用，尤其是分布在偏僻山區(qū)、高山溝壑的野生資源，亟待進(jìn)一步保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在云南省核桃種質(zhì)資源調(diào)查及深紋核桃分子SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)上，開(kāi)展基于SSR分子標(biāo)記的三江并流區(qū)金沙江流域核桃資源多樣性研究，闡明其遺傳多樣性及分布特征，為該區(qū)域核桃種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的153份樣品均為當(dāng)?shù)靥烊簧L(zhǎng)的野生核桃資源，樹(shù)齡大于50年，資源間隔100 m以上，記錄資源的海拔、經(jīng)緯度及生境狀況，以采集的單株葉片為1個(gè)樣本，置于自封袋中，帶回提取DNA。資源分別采自3個(gè)縣8個(gè)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)），玉龍縣（黎明鄉(xiāng)、巨甸鄉(xiāng)和塔城鄉(xiāng)）、德欽縣（拖頂鄉(xiāng)）和維西縣（其宗鎮(zhèn)、塔城鎮(zhèn)、攀天閣鄉(xiāng)和永春鄉(xiāng)）。根據(jù)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）行政區(qū)劃及資源的地理分布情況，將其劃分成5個(gè)群體進(jìn)行分析，其中玉龍縣和德欽縣各為1個(gè)群體（YL和DQ），維西縣的4個(gè)鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）主要按照地理距離和資源分布及數(shù)量情況劃分成3個(gè)群體，其宗鎮(zhèn)和塔城鎮(zhèn)地理距離較小，劃為1個(gè)群體（QZ），地理距離相對(duì)較大的攀天閣鄉(xiāng)和永春鄉(xiāng)分別各為1個(gè)群體（PTG和YC），資源和群體的相關(guān)信息列于表1。CTAB、TEMED、2×ES Taq Master Mix、DNA Marker、Loading Buffer、Taq Polymerase等DNA提取及PCR試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;引物委托昆明碩擎生物工程有限公司合成。主要儀器設(shè)備：Bio-Rad公司的PCR擴(kuò)增儀和凝膠成像儀，Thermo NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)及低溫高速離心機(jī)（Eppendorf A G）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 采用楊恩等（2005）的方法提取核桃葉片DNA，分別以瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品的濃度和純度，將符合純度要求的樣品稀釋至20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè) SSR-PCR反應(yīng)體系參照陳少瑜等（2017）的方法，用篩選出的19對(duì)SSR引物進(jìn)行SSR擴(kuò)增，引物信息參見(jiàn)肖良俊等（2018）。毛細(xì)管電泳參照Chen等（2014）的方法。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)擴(kuò)增片段大小將每對(duì)引物的電泳結(jié)果依次記為A1～Ai，Ai為第i個(gè)等位片段，用Excel 2007統(tǒng)計(jì)分析各引物擴(kuò)增的等位片段種類和數(shù)量、Ai的百分率及Ai在各群體中的分布頻率。

用GenAIEx 6.5計(jì)算等位基因數(shù);用POPGENE version 1.32（Yeh et al.，1997）計(jì)算各群體多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）、觀察等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon’s信息指數(shù)（I）和Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

圖1為引物CUJRA123對(duì)92～95號(hào)資源擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳圖譜。由表2可知，19對(duì)引物共檢測(cè)到130個(gè)等位片段，每對(duì)引物平均擴(kuò)增6.84個(gè)，片段大小在82～248 bp。19對(duì)引物擴(kuò)增的等位片段數(shù)存在差異，其中擴(kuò)增出的等位片段數(shù)最多（15個(gè)）的引物為CUJRB103a，其次是引物CUJRA206a（13個(gè)），CUJRD204a、JH3753、JSI-15和JSI-63等4對(duì)引物擴(kuò)增的等位片段數(shù)最少（各3個(gè)）。由表3還可看出，130個(gè)等位片段在153份樣本中出現(xiàn)的頻率各不相同，其中片段A122出現(xiàn)的頻率最高，達(dá)0.8301，其次是A120，為0.8125;頻率最低的僅為0.0033，共有14個(gè)，占總數(shù)的10.77%。

2. 2 等位片段的分布特征

2. 2. 1 各群體等位片段的總體狀況 由表4可見(jiàn)，QZ群體的等位片段數(shù)量最多（共111個(gè)），占總數(shù)的85.38%;其次是YL群體（99個(gè)），占總數(shù)的76.15%;TD群體的等位片段數(shù)量最少（92個(gè)），占總數(shù)的70.70%。14個(gè)稀有片段中有6個(gè)出現(xiàn)在PTG群體中，占稀有等位片段比例最高（42.86%），其次是TD群體中出現(xiàn)3個(gè)，占稀有等位片段比例為21.43%，YC群體出現(xiàn)1個(gè)，僅占7.14%。

2. 2. 2 等位片段在5個(gè)群體中的分布及頻率 130個(gè)等位片段在5個(gè)群體中的分布及頻率各不相同（圖2）?？傮w上，5個(gè)群體中高頻率片段主要出現(xiàn)在A75～A130，其中5個(gè)群體出現(xiàn)頻率皆大于0.5000的片段有4個(gè)（A1、A75、A120和A122）。值得關(guān)注的是A120和A122在5個(gè)群體中的分布頻率分別高于0.7600和0.7400，兩個(gè)等位片段在TD群體中高達(dá)0.9062。

2. 3 群體遺傳多樣性狀況

表5為5個(gè)群體的遺傳多樣性參數(shù)及總體水平。由表5可看出，5個(gè)群體的Ne、He、I和H的平均值分別為2.8944、0.6165、1.1709和0.6046。5個(gè)群體的遺傳多樣性參數(shù)各不相同，其中QZ群體的Ne、He、I和H在5個(gè)群體中最高（分別為3.2135、0.6405、1.2766和0.6347）;TD群體的以上各參數(shù)最低（分別為2.7444、0.5920、1.0994和0.5828）。說(shuō)明三江并流區(qū)金沙江流域5個(gè)核桃群體中QZ群體的遺傳多樣性相對(duì)較高，TD群體的遺傳多樣性相對(duì)較低。

3 討論

位點(diǎn)多態(tài)性能反映群體的遺傳多樣性或基因庫(kù)的豐富程度。H、I和He是反映群體遺傳多樣性的重要指標(biāo)，其中He不僅可衡量群體的遺傳多樣性狀況，還能反映群體中等位基因的豐富度和均勻度（王滑等，2007;黃勇，2013）。本研究中，153份資源擴(kuò)增出的等位片段總數(shù)為130個(gè)，5個(gè)群體擴(kuò)增片段的數(shù)量占擴(kuò)增片段總數(shù)的比例在70.70%～85.38%;H、I和He 3個(gè)遺傳參數(shù)的平均值分別為0.6046、1.1709和0.6165，與采用SSR分子標(biāo)記對(duì)核桃的相關(guān)研究（表6）進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三江并流區(qū)金沙江流域核桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性屬于中等水平。

對(duì)于某一樹(shù)種的基因保存和優(yōu)樹(shù)選擇來(lái)說(shuō)，準(zhǔn)確估算其在分布區(qū)的遺傳多樣性具有重要意義（廖柏勇等，2016），因此非常有必要掌握多樣性在區(qū)域內(nèi)的分布格局及分布特征。本研究中的5個(gè)核桃群體，其遺傳多樣性分布排序依次為QZ>YL>PTG>YC>TD，其中QZ群體的遺傳多樣性最高，可能與該群體的地理位置、樣品數(shù)量、樣品分布范圍（涵蓋其宗鎮(zhèn)和塔城鎮(zhèn)）、人為影響的程度相關(guān)，在遺傳資源保存和選育時(shí)應(yīng)給予注重。

遺傳多樣性水平及其分布格局受繁育系統(tǒng)、遺傳漂變、基因突變、基因流等內(nèi)因及環(huán)境變化和人為干擾造成的群體隔離、生境片段化等外因的影響（文亞峰等，2010）。研究區(qū)域復(fù)雜的地形地貌和多樣氣候環(huán)境是維持該區(qū)域核桃種質(zhì)資源多樣性的主要原因，而核桃特有的繁育系統(tǒng)（同株異花、雌雄異熟的風(fēng)媒傳粉）及長(zhǎng)期的自然雜交導(dǎo)致核桃群體高度雜合是桃種質(zhì)資源遺傳多樣性較豐富的另一個(gè)主要原因。然而，核桃的風(fēng)媒傳粉距離有限、野生資源砍伐及生境破壞形成的片段化導(dǎo)致其多樣性降低。在資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，許多核桃野生資源由于土地的開(kāi)發(fā)被砍伐，其生境因人為活動(dòng)被破壞。綜合因素的作用導(dǎo)致研究區(qū)域核桃種質(zhì)資源遺傳多樣性僅處于中等水平。

對(duì)等位片段及頻率分布特征的分析結(jié)果顯示，130個(gè)等位片段中A120和A122出現(xiàn)的頻率較高（大于0.7000）、頻率很低的稀有片段（僅0.0033）有14個(gè)，且每個(gè)稀有片段為各群體所特有。其中值得關(guān)注的是TD群體，盡管此群體的遺傳多樣性在5個(gè)群體中最低，但其A120和A122片段的頻率高達(dá)0.9062，稀有片段占稀有片段總數(shù)的比例也達(dá)21.43%，其次是PTG群體，稀有片段占稀有片段總數(shù)的42.86%。等位片段的多態(tài)性及頻率分布特征，不僅能反映群體的遺傳多樣性狀況，還可為進(jìn)一步探索片段差異與相應(yīng)表型多態(tài)性的關(guān)系打下基礎(chǔ)。因此，本研究獲得的結(jié)果，尤其以上16個(gè)等位片段及分布特征將為進(jìn)一步開(kāi)展片段差異與表型多態(tài)性關(guān)系的研究及特異分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)、優(yōu)異資源的挖掘和鑒定提供有益信息。

4 結(jié)論

本研究以19對(duì)SSR引物檢測(cè)三江并流區(qū)金沙江流域5個(gè)群體共153份云南核桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性，結(jié)果表明種質(zhì)資源的遺傳多樣性整體上處于中等水平，其中QZ群體的多樣性最高，TD群體最低;在130個(gè)等位片段中有2個(gè)片段頻率較高、14個(gè)片段的頻率很低。應(yīng)采取積極的措施加強(qiáng)對(duì)該區(qū)域核桃資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用，尤其是對(duì)于野生資源的保護(hù)和利用。在優(yōu)先保護(hù)現(xiàn)有群體的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)對(duì)遺傳多樣性高的群體（QZ群體）的保護(hù)和選擇，尤其應(yīng)結(jié)合表型性狀及稀有片段頻率的分布特征（TD和PTG群體），側(cè)重于群體內(nèi)單株的選擇，以更有助于保存和利用該區(qū)域核桃種質(zhì)資源的多樣性和特異性。

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（責(zé)任編輯 王 暉）