謝小燕　蘇曉娜　王惠梅　江紹琳　吳建利　江紹玫

摘要：【目的】篩選更優(yōu)的ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測方法，分析我國華東地區(qū)野生菰種質(zhì)資源遺傳多樣性，為建立和完善菰植物種質(zhì)庫及合理開發(fā)與利用菰資源提供理論依據(jù)?！痉椒ā刻暨x7條ISSR引物對華東地區(qū)9個(gè)野生菰居群104份材料基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其ISSR-PCR產(chǎn)物分別采用2%瓊脂糖凝膠電泳和5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。【結(jié)果】2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，華東地區(qū)野生菰的多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB）為63.49%、觀測等位基因數(shù)（Na）為1.6349、有效等位基因數(shù)（Ne）為1.3012、Nei’s基因多樣性指數(shù)（He）為0.1871、Shannon’s信息指數(shù)（I）為0.2908、居群間遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.3922、遺傳相似系數(shù)（Gs）變化范圍在0.8293～0.9775;其聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)遺傳相似性系數(shù)閾值為0.885時(shí)，9個(gè)野生菰居群被分為兩大類，SH（上海）和PYH（鄱陽湖）居群歸為一類，其他7個(gè)居群歸為另一類。5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，華東地區(qū)野生菰的PPB為78.03%、Na為1.7803、Ne為1.2762、He為0.1804、I為0.2914、Gst為0.5086、Gs變化范圍在0.7679～0.9837;其聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)遺傳相似性系數(shù)閾值為0.850時(shí)，9個(gè)居群也被分為兩大類，其中PYH居群單獨(dú)為一類，其他8個(gè)居群歸為另一類?！窘Y(jié)論】我國華東地區(qū)野生菰種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富，居群間和居群內(nèi)變異顯著，基于ISSR分子標(biāo)記的野生菰遺傳多樣性采用5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測可獲得更可靠的遺傳圖譜，而2%瓊脂糖凝膠電泳檢測更適合早期的ISSR分子標(biāo)記引物篩選。

關(guān)鍵詞： 野生菰;ISSR分子標(biāo)記;遺傳多樣性;瓊脂糖凝膠電泳;聚丙烯酰胺凝膠電泳;華東地區(qū)

中圖分類號： S519;Q943? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）12-2638-09

Genetic diversity analysis of Zizania latifolia by ISSR in East China based on two electrophoresis detection methods

XIE Xiao-yan1， SU Xiao-na2， WANG Hui-mei3， JIANG Shao-lin4，

WU Jian-li3， JIANG Shao-mei5*

（1College of Art， Jiangxi University of Finance and Economics， Nanchang? 330013， China; 2Nanchang Business College of Jiangxi Agricultural University， Nanchang? 330013， China; 3China National Rice Research Institute， Hangzhou 310006， China; 4Agronomy College， Jiangxi Agricultural University， Nanchang? 330045， China;

5College of Statistics， Jiangxi University of Finance and Economics， Nanchang? 330013， China）

Abstract：【Objective】To select better electrophoretic detection methods for ISSR-PCR amplification products， analyze the genetic diversity of Zizania latifolia germplasm resources in East China， and provide theoretical basis for the establishment and improvement of Z. latifolia germplasm banks and the rational development and utilization of the resources.【Method】Seven ISSR primers were screened out to amplify 104 genomic DNA from 9 Z. latifolia populations in East China. The ISSR-PCR products were analyzed by 2% agarose gel and 5% non-denaturing polyacrylamide gel detection. 【Result】The results of agarose gel electrophoresis showed that the percentage of polymorphic loci（PPB） of Z. latifolia in East China was 63.49%， the number of observed alleles（Na） was 1.6349， and the number of effective alleles（Ne） was 1.3012， Nei’s genetic diversity index（He） was 0.1871， Shannon information index（I） was 0.2908， genetic differentiation coefficient（Gst） between populations was 0.3922， and genetic similarity coefficient（Gs） varied from 0.8293 to 0.9775. The results of cluster analysis showed that when the threshold of genetic similarity coefficient was 0.885， the nine Z. latifolia populations were classified into two categories， the SH（Shanghai） and PYH （Poyang Lake） populations were classified into one group， and the other seven populations were classified into another group. The results of 5% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis showed that the PPB of Z. latifolia in East China was 78.03%， Na was 1.7803， Ne was 1.2762， He was 0.1804， I was 0.2914， Gst was 0.5086， and Gs ranged from 0.7679 to 0.9837. The results of cluster analysis showed that when the threshold of genetic similarity coefficient was 0.850， the nine populations were also divided into two categories， among which the PYH population was classified into one category and the other eight populations were classified into another category. 【Conclusion】The Z. latifolia germplasm resources in East China are rich in genetic diversity， with significant variation between and within populations. The genetic diversity of Z. latifolia based on ISSR markers can be detected by 5% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis to obtain a more reliable genetic map， and 2% agarose gel electrophoresis detection is more suitable for early ISSR molecular marker primer screening.

Key words： Zizania latifolia; ISSR markers; genetic diversity; agarose gel electrophoresis; polyacrylamide gel electrophoresis; East China

0 引言

【研究意義】野生菰（Zizania latifolia）作為重要的宿根性水生草本植物，隸屬于禾本科（Gramineae）稻亞科（Oryzoideae）稻族菰屬（Zizania）（陳守良和徐克學(xué)，1994）。最新調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，華東地區(qū)是我國野生菰種質(zhì)資源的重要分布地區(qū)之一，尤其在鄱陽湖、洪澤湖、太湖和巢湖等湖區(qū)大量分布（蘇曉娜，2017）。菰具有較高的食用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值，其穎果（菰米）早在周朝就成為供奉帝王的珍貴食材（翟成凱等，2000）。野生菰還具有極高的基因資源利用價(jià)值，與水稻生長習(xí)性有許多相似之處，可作為水稻遺傳育種優(yōu)良基因庫的重要源材料（沈瑋瑋等，2010），已受到育種工作者的高度重視。野生菰基因存在自交退化、異交傾向，且穎果易落粒、種子收集難等現(xiàn)象（Kennard et al.，1999），但其分子生物學(xué)理論研究及實(shí)地試驗(yàn)基因改良尚處于起步和探索階段（臧劍等，2017;王惠梅等，2018）。因此，選取瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種電泳方法對華東地區(qū)野生菰遺傳多樣性進(jìn)行分析，選出最優(yōu)檢測方法，探索野生菰種群間的遺傳變異規(guī)律，對菰遺傳改良、種質(zhì)資源庫構(gòu)建及物種保護(hù)與開發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已有較多將分子標(biāo)記用于野生菰遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道。Xu等（2008）利用Adh1a基因測序?qū)ξ覈吧跃尤哼M(jìn)行遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，各居群間存在低至中等水平的核苷酸差異，并證實(shí)我國東北地區(qū)居群Adh1a基因序列變異最豐富。Quan等（2009）開發(fā)了菰自身SSR分子標(biāo)記并驗(yàn)證該標(biāo)記用于野生菰遺傳多樣性具有可行性。Chen等（2012）利用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測長江中下游野生菰SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果表明該流域的野生菰具有高水平的遺傳多樣性。任緒瑞（2014）、吳國林等（2014）建立了菰ISSR和SRAP反應(yīng)體系，擴(kuò)增產(chǎn)物可用1%瓊脂糖凝膠電泳和6%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。王惠梅等（2015）用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測鄱陽湖流域野生菰ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示該流域的野生菰遺傳多樣性較高，在遺傳相似性系數(shù)0.728的水平上可將其分為三大類。蘇曉娜（2017）利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測華東地區(qū)野生菰資源SSR遺傳多樣性，得出多態(tài)性條帶百分比高達(dá)89.06%，每對引物平均擴(kuò)增出8.42個(gè)多態(tài)座位。董琳（2018）利用2%瓊脂糖凝膠電泳分析梁子湖野生菰種質(zhì)資源ISSR遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該湖區(qū)的野生菰具有較高遺傳多樣性，居群內(nèi)遺傳變異大于居群間的變異。至今，瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳仍是分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離和檢測的常用方法（王冬冬等，2017）。李新海等（2001）通過分析3%瓊脂糖凝膠電泳和12%聚丙烯酰胺凝膠電泳對SSR分子標(biāo)記多態(tài)性的影響，證實(shí)瓊脂糖凝膠電泳適合用于遺傳作圖和基因定位研究，而聚丙烯酰胺凝膠電泳可用于遺傳多樣性和指紋圖譜研究。侯思宇等（2011）利用ISSR分子標(biāo)記分析棗樹品種遺傳多樣性時(shí)，發(fā)現(xiàn)5%聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率和多態(tài)性均高于1%瓊脂糖凝膠電泳，且前者可獲得更精細(xì)的棗樹品種間遺傳圖譜。葉春秀等（2014）比較兩種電泳方法對新陸早系列品種SSR分子標(biāo)記結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析效果好且結(jié)果與實(shí)際遺傳背景相近，而瓊脂糖凝膠電泳更適合前期的引物篩選。劉乃新等（2016）研究不同檢測方法對甜菜ISSR引物多態(tài)性的影響，發(fā)現(xiàn)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳適用指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析，2%瓊脂糖凝膠電泳適用于種子純度鑒定。【本研究切入點(diǎn)】至今，國內(nèi)尚未見同時(shí)使用瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳對野生菰ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測的相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過比較兩種凝膠電泳對華東地區(qū)野生菰ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測結(jié)果，篩選出更優(yōu)檢測方法，旨在真實(shí)反映華東地區(qū)野生菰遺傳多樣性特征，進(jìn)一步將該標(biāo)記及優(yōu)選檢測方法用于全國野生菰遺傳多樣性分析，為建立和完善菰植物種質(zhì)庫及合理開發(fā)與利用菰資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

9個(gè)野生菰居群104份樣本采自華東地區(qū)的湖泊、濕地和公園里，同時(shí)詳細(xì)記錄各居群的經(jīng)度、緯度、海拔及樣本數(shù)量（表1）。Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、丙烯酰胺、瓊脂糖、硝酸銀、氫氧化鈉和甲醛購自上海鼎國生物技術(shù)有限公司。主要設(shè)備儀器：PCR擴(kuò)增儀（Tgradient Thermocycler，Biometra）、高速離心機(jī)（Centrifuge 5804，Eppendorf）、凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood II，BIO-RAD）、電泳槽電泳儀（DYY-6B、DYC-280，北京六一儀器廠）和凝膠掃描儀（Epson Perfection V10，EPSON）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 基因組DNA提取及ISSR擴(kuò)增 參照周麗霞等（2013）的CTAB法提取菰基因組DNA，用ddH2O稀釋至濃度為20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。選用的7條ISSR引物（吳國林等，2014）均由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：10×Buffer 2.0 μL，2 mmol/L dNTPs 5.0 μL，2 U/μL Taq DNA聚合酶2.0 μL，20 ng/μL DNA模板1.0 μL，10 μmol/L引物0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：94.0 ℃預(yù)變性3.0 min;94.0 ℃ 45 s，46.8～56.1 ℃ 45 s，72.0 ℃ 90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72.0 ℃延伸7.0 min，4 ℃保存。

1. 2. 2 凝膠電泳檢測 向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2 μL的6×Loading Buffer混勻后，用含核酸染料GelRed的2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測（100 V，1.5 h），電泳結(jié)束后在紫外凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RED）下觀察并拍照記錄。同時(shí)，采用5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測（140 V，3 h），采用AgNO3染色法后分離和鑒定，用凝膠圖像掃描儀拍照，并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1. 2. 3 數(shù)據(jù)處理 以DL2000 DNA Marker為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用人工讀帶方式，在相同遷移率位置譜帶清晰可辨的記為“1”，缺失的記為“0”，在Excel 2007中構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣。參照蘇曉娜等（2018）的方法，采用POPGENE 1.32計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB）、觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（He）、Shannon’s信息指數(shù)（I）、居群間基因多樣性（Ht）、居群內(nèi)基因多樣性（Hs）、居群間遺傳分化系數(shù)（Gst）、居群間基因流（Nm）、遺傳相似系數(shù)（Gs）和遺傳距離（Gd）;利用ARLEQUIN 3.11計(jì)算居群間和居群內(nèi)遺傳變異所占比例;采用MEGA 4.0.2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹;以MVSP 3.1進(jìn)行主成分分析;并利用NTSYS 2.10e中的UPGMA法進(jìn)行聚類分析（Rohlf，1998）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 引物多態(tài)性分析比較

7條引物對104份野生菰DNA的擴(kuò)增結(jié)果表明，擴(kuò)增片段長度在100～2000 bp，但不同ISSR引物或同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物的不同電泳檢測結(jié)果在譜帶總數(shù)、帶型和亮度等方面存在明顯差異。2%瓊脂糖凝膠電泳共檢測到譜帶63條，其中多態(tài)性譜帶40條，PPB為63.49%;5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳共檢測出譜帶132條，其中多態(tài)性譜帶103條，PPB為78.03%（表2）。對于7條引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，兩種電泳檢測方法獲得的PPB范圍分別為33.33%～88.89%和69.23%～95.00%（表3），其中，2%瓊脂糖凝膠電泳和5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測出的最高譜帶數(shù)分別為12條（引物Z89）和26條（引物Z88）。由于5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳具有更高分辨率，因此檢測到的各引物多態(tài)性也較2%瓊脂糖凝膠電泳好。

從居群分析結(jié)果可知，兩種電泳檢測方法均顯示HZH和PYH居群多態(tài)性較高，ZHZ居群多態(tài)性最低。其中，2%瓊脂糖凝膠電泳和5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測得出HZH、PYH、ZHZ居群的PPB分別為42.86%、34.92%、6.35%和47.73%、46.97%、6.06%。從引物Z73對部分野生菰樣本的擴(kuò)增結(jié)果可明顯看出，5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測出的多態(tài)性（圖2）高于2%瓊脂糖凝膠電泳（圖1），因而更易分辨出這31份野生菰樣本的遺傳差異。

2. 2 遺傳多樣性分析比較

He不僅反映一個(gè)物種等位基因的豐富度和均勻程度，還是衡量供試材料遺傳多樣性最常用的指標(biāo)。采用POPGENE 1.32對9個(gè)野生菰居群的遺傳參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（表4）顯示，Na=1.6349，Ne=1.3012，He=0.1871，I=0.2908;5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果（表5）顯示，Na=1.7803，Ne=1.2762，He=0.1804，I=0.2914。兩種檢測方法分析結(jié)果基本一致，說明華東地區(qū)野生菰遺傳多樣性水平較高。

2. 3 遺傳分化比較

2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（表6）顯示，華東地區(qū)野生菰居群間Ht=0.1777，居群內(nèi)Hs=0.1080，Gst=0.3922，表明39.22%的遺傳分化存在于居群間，60.78%則存在于居群內(nèi);5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果（表6）顯示，華東地區(qū)野生菰居群間Ht=0.1661，居群內(nèi)Hs=0.0816，Gst=0.5086，表明50.86%的遺傳分化存在于居群間，49.14%則存在于居群內(nèi)。Nm是基因間的相互交流引起居群內(nèi)部遺傳變異量增加，減少居群間分化。2%瓊脂糖凝膠電泳和5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果（表6）顯示，華東地區(qū)野生菰居群的Nm分別為0.7750和0.4832，均小于1.0000，說明遺傳漂變成為影響居群遺傳結(jié)構(gòu)的主要因素。

分子變異分析（AMOVA）可用于判斷居群間或居群內(nèi)的變異方差分布情況。華東地區(qū)野生菰樣本的AMOVA分析結(jié)果（表7）與POPGENE 1.32分析得出的相關(guān)參數(shù)基本一致，兩種電泳檢測方法所得的野生菰居群間變異比例分別為32.06%和41.23%，居群內(nèi)變異分別為67.94%和58.77%，居群間和居群內(nèi)的變異均達(dá)極顯著水平（P<0.01）。

Gs和Gd是衡量居群間遺傳分化程度的兩個(gè)最重要指標(biāo)。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（表8）顯示，華東地區(qū)野生菰各居群間Gs和Gd分別介于0.8293～0.9775和0.0227～0.1872。其中，ZHZ居群與CX居群的Gd=0.0227，Gs=0.9775，表明兩個(gè)居群間的遺傳差異最小，親緣關(guān)系最近;PYH居群與ZHZ居群的Gd=0.1872，Gs=0.8293，表明兩居群間的遺傳差異最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果（表9）顯示，華東地區(qū)野生菰各居群間Gs和Gd分別介于0.7679～0.9837和0.0165～0.2641。其中，ZHZ居群與CHH居群的Gd=0.0165，Gs=0.9837，表明兩居群間的遺傳差異最小，親緣關(guān)系最近;PYH居群與ZZ居群的Gd=0.2641，Gs=0.7679，表明兩居群間的遺傳差異最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2. 4 聚類分析比較

NTSYS 2.10e聚類分析是通過Similarity程序中的Qualitative data對原始數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行遺傳相似性系數(shù)計(jì)算，然后通過Clustering中SNAN程序的非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，最后借助Graphic中Tree Plot程序生成聚類分析圖。由于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法的不同，導(dǎo)致華東地區(qū)野生菰聚類分析結(jié)果存在一定差異。在遺傳相似性系數(shù)閾值為0.885時(shí)，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果將華東地區(qū)9個(gè)野生菰居群分為兩大類（圖3），其中，第I類由ZZ、HZH、TAIH、CX、ZHZ、HZ和CHH 7個(gè)居群組成，第II類由SH和PYH 2個(gè)居群組成。在遺傳相似性系數(shù)閾值為0.850時(shí)，5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果也將華東地區(qū)9個(gè)野生菰居群分為兩大類（圖4），其中，第I類由ZZ、SH、CX、HZ、CHH、ZHZ、HZH和TAIH 8個(gè)居群組成;第II類僅含PYH居群。

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹是基于共同祖先原則，用于描述生物傳代譜系的常用表達(dá)方式，可直觀反映分類群（物種或基因）間的親緣關(guān)系和進(jìn)化方向（韓鳳俠，2008）。借助MEGA 4.0.2的Neighbour-joining鄰接法，可將居群間遺傳距離轉(zhuǎn)化為系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹?；?%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，華東地區(qū)9個(gè)野生菰居群可明顯聚為兩大分支（圖5），其中，A分支先后分化出SH和PYH居群，而B支先后分化出CHH、TAIH、HZH、ZZ、CX、HZ和ZHZ居群。基于5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也顯示，華東地區(qū)9個(gè)野生菰居群分為兩大分支（圖6），但各自分化出的居群與基于2%瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果不同。其中，A支先后分化出CHH、ZHZ和PYH居群，B支則先后分化出CX、HZH、TAIH、HZ、SH和ZZ居群。

2. 5 主成分分析比較

采用MVSP 3.1對二元數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主成分分析（PCA），其中，基于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測數(shù)據(jù)的主成分分析結(jié)果表明，前3個(gè)主成分所含信息量占總信息量的46.326%，第一主成分（PC1）～第三主成分（PC3）所占比例分別為25.825%、11.352%和9.149%，華東地區(qū)野生菰居群內(nèi)各單株樣本聚集較近，但居群間樣本又存在相互交錯(cuò)，各居群無明顯區(qū)分性（圖7）;基于聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測數(shù)據(jù)的主成分分析結(jié)果顯示，前3個(gè)主成分所含信息量占總信息量的46.575%，PC1～PC3所占比例分別為22.544%、16.011%和8.019%，除居群內(nèi)各單株樣本聚集較近外，居群間又被明顯區(qū)分開（圖8）。可見，華東地區(qū)9個(gè)野生菰居群的兩種電泳檢測數(shù)據(jù)主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

3 討論

聚丙烯酰胺凝膠電泳對ISSR-PCR產(chǎn)物檢測的分辨率和靈敏度均高于瓊脂糖凝膠電泳。李凌雨等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，聚丙烯酰胺凝膠電泳較瓊脂糖凝膠電泳更能真實(shí)地反映玉米自交系間的系譜關(guān)系;宋順華和鄭曉鷹（2005）通過分析不同電泳檢測方法對甘藍(lán)和大白菜品種多態(tài)性的影響，發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測多態(tài)率是瓊脂糖凝膠電泳檢測多態(tài)率的2倍。本研究通過分析華東地區(qū)9個(gè)野生菰居群104份樣本的ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果表明，2%瓊脂糖凝膠電泳共檢測到譜帶63條，其中多態(tài)性譜帶40條，PPB為63.49%，遺傳相似性范圍在0.8293～0.9775;5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳共檢測出譜帶132條，其中多態(tài)性譜帶103條，PPB為78.03%，遺傳相似性范圍在0.7679～0.9837。可見，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測優(yōu)于瓊脂糖凝膠電泳檢測，能更真實(shí)地反映華東地區(qū)野生菰遺傳多樣性。通常情況下，構(gòu)建遺傳多樣性圖譜及品種分析與鑒定等建議選擇使用聚丙烯酰胺凝膠電泳;但瓊脂糖凝膠電泳因操作簡便、成本低，尤其對于多態(tài)性要求不高的大量ISSR分子標(biāo)記早期篩選仍是最常用的檢測方法。

PPB和He是評價(jià)物種遺傳多樣性水平的常用指標(biāo)。本研究采用的5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測得知華東地區(qū)野生菰PPB為78.03%、He為0.1804，與本課題組前期采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測基于SSR分子標(biāo)記的我國華東地區(qū)野生菰種質(zhì)資源遺傳多樣性分析結(jié)果（PPB為89.06%，He為0.2450）（蘇曉娜，2017）基本一致。結(jié)合兩種分子標(biāo)記可更全面、準(zhǔn)確地揭示種質(zhì)遺傳特性，同時(shí)說明SSR和ISSR分子標(biāo)記均適用于我國華東地區(qū)野生菰的遺傳多樣性分析。本研究有效彌補(bǔ)了華東地區(qū)野生菰遺傳多樣性分子標(biāo)記研究方法的不足，鑒于ISSR分子標(biāo)記在菰屬植物材料中表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性和穩(wěn)定性，而適合更廣范圍的野生菰品種鑒定工作。華東地區(qū)野生菰居群遺傳關(guān)系存在明顯的地理相關(guān)性，即地理距離越近的居群，其遺傳距離越小，親緣關(guān)系越近。本研究的聚類分析結(jié)果顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.850處，可將9個(gè)野生菰居群分為兩組，第I組由棗莊、上海、慈溪、杭州、巢湖、漳州、洪澤湖和太湖8個(gè)居群組成，而鄱陽湖為第II組，證實(shí)采用ISSR分子標(biāo)記鑒別野生菰遺傳親緣關(guān)系具有可行性。華東地區(qū)野生菰的生長繁殖及其遺傳演化受制于生活環(huán)境的水文條件變化，除受動物遷徙及風(fēng)媒傳播影響外，種子和根莖還可通過縱橫交錯(cuò)的水體交流。此外，基于5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也顯示華東地區(qū)野生菰居群可分為兩大分支，其中，A支先后分化出巢湖、漳州和鄱陽湖居群;B支先后分化出慈溪、洪澤湖、太湖、杭州、上海和棗莊居群。由此得出的野生菰居群親緣及進(jìn)化關(guān)系，與各野生菰居群所處的地理關(guān)系基本吻合。

華東地區(qū)野生菰遺傳多樣性的科學(xué)評價(jià)可進(jìn)一步完善菰屬植物野生種質(zhì)資源信息。同時(shí)，本研究篩選出的ISSR分子標(biāo)記及其產(chǎn)物的最優(yōu)電泳檢測方法——聚丙烯酰胺凝膠電泳，可用于全國范圍野生菰及其他野生植物種質(zhì)資源的評價(jià)研究，為我國野生植物資源收集、評估和利用打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

我國華東地區(qū)野生菰種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富，居群間和居群內(nèi)變異顯著，基于ISSR分子標(biāo)記的野生菰遺傳多樣性采用5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測可獲得更可靠的遺傳圖譜，而2%瓊脂糖凝膠電泳檢測更適合早期的ISSR分子標(biāo)記引物篩選。

參考文獻(xiàn)：

陳守良，徐克學(xué). 1994. 菰屬Zizania L.植物的分支分類研究[J]. 植物研究，14（4）：385-393. [Chen S L，Xu K X. 1994. A study on cladistic taxonomy of Zizania L.（Gramineae）[J]. Bulletin of Botanical Research，14（4）：385-393.]

董琳. 2018. 基于SSR和ISSR梁子湖野生菰種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[D]. 南昌：江西財(cái)經(jīng)大學(xué). [Dong L. 2018. The studies on genetic diversity of Zizania latifolia germplasm resources in Liangzi lake based on SSR and ISSR[D]. Nanchang：Jiangxi University of Finance and Economics.]

韓鳳俠. 2008. 共同祖先原則和系統(tǒng)發(fā)育樹的解讀[J]. 生物學(xué)通報(bào)，43（9）：14-15. [Han F X. 2008. On the principle of common ancestry to understand the phylogenetic tree[J]. Bulletin of Biology，43（9）：14-15.]

侯思宇，孫朝霞，申潔，王玉國，韓淵懷. 2011. 30個(gè)棗樹種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，47（3）：275-280. [Hou S Y，Sun Z X，Shen J，Wang Y G，Han Y H. 2011. Genetic variation among thirty Ziziphus jujuba Mill. cultivars as revealed by ISSR marker assays[J]. Plant Physiology Journal，47（3）：275-280.]

李凌雨，暢志堅(jiān)，榎宏征，濃沼圭一，邢亞靜，閆彩清，王學(xué)雄，王河成. 2003. 不同凝膠電泳對玉米自交系DNA多態(tài)檢測的影響[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，31（2）：15-18. [Li L Y，Chang Z J，Henoki H Y，Koinuma K I，Xing Y J，Yan C Q，Wang X X，Wang H C. 2003. Effects of the polymorphism detection for DNA of maize inbred lines with different gel[J]. Journal of Shanxi Agricultural Sciences，31（2）：15-18.]

李新海，焦少杰，傅駿驊，張世煌，袁力行，李明順. 2001. 兩種凝膠電泳系統(tǒng)對SSR標(biāo)記多態(tài)性的影響[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，16（2）：43-48. [Li X H，Jiao S J，F(xiàn)u J H，Zhang S H，Yuan L X，Li M S. 2001. Comparative analysis of polymorphism of SSRs detected on two gel electrophoresis systems[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica，16（2）：43-48.]

劉乃新，余虹瑩，韋黎，馬龍彪，吳則東. 2016. 不同檢測方法對甜菜ISSR引物多態(tài)性的影響[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，32（33）：143-146. [Liu N X，Yu H Y，Wei L，Ma L B，Wu Z D. 2016. Effects of different detection methods on ISSR primers polymorphism of sugar beet[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，32（33）：143-146.]

任緒瑞. 2014. 三江平原菰遺傳多樣性研究[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué). [Ren X R. 2014. Analysis of genetic diversity on wild rice Zizania latifolia of the Sanjiang plain[D]. Hefei：Anhui Agricultural University.]

沈瑋瑋，宋成麗，陳潔，付亞萍，吳建利，江紹玫. 2010. 轉(zhuǎn)菰候選基因克隆獲得抗白葉枯病水稻植株[J]. 中國水稻科學(xué)，24（5）：447-452. [Shen W W，Song C L，Chen J，F(xiàn)u Y P，Wu J L，Jiang S M. 2010. Transgenic rice plants harboring genomic DNA from Zizania latifolia confer bacterial blight resistance[J]. Chinese Journal of Rice Science，24（5）：447-452.]

宋順華，鄭曉鷹. 2005. 檢測方法對甘藍(lán)和大白菜品種RAPD標(biāo)記鑒別多態(tài)性的影響[J]. 種子，24（11）：14-17. [Song S H，Zheng X Y. 2005. Influences of detection methods RAPD markers polymorphism of cabbage and Chinese cabbage cultivars[J]. Seeds，24（11）：14-17.]

蘇曉娜. 2017. 基于SSR的中國野生菰種質(zhì)資源遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析[D]. 南昌：江西財(cái)經(jīng)大學(xué). [Su X N. 2017. Genetic diversity and genetic structure of Zizania latifolia based on SSR analysis[D]. Nanchang：Jiangxi University of Finance and Economics.]

蘇曉娜，王惠梅，黃雪雯，謝小燕，張孝天，牛戀，董琳，江紹琳，吳建利，江紹玫. 2018. 利用SSR標(biāo)記分析東北野生菰遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，40（3）：579-589. [Su X N，Wang H M，Huang X W，Xie X Y，Zhang X T，Niu L，Dong L，Jiang S L，Wu J L，Jiang S M. 2018. Genetic diversity and genetic structure of Zizania latifolia Griseb（Turcz） from northeast China based on SSR analysis[J]. Journal of Jiangxi Agricultural University，40（3）：579-589.]

王冬冬，劉佳偉，陸曉玉，姚丹. 2017. 微衛(wèi)星PCR凝膠電泳染色方法的比較[J]. 分子植物育種，15（8）：3179-3182. [Wang D D，Liu J W，Lu X Y，Yao D. 2017. Comparison of microsatellite PCR gel electrophoresis staining me-thods[J]. Molecular Plant Breeding，15（8）：3179-3182.]

王惠梅，吳國林，江紹琳，黃奇娜，奉保華，黃長干，江紹玫，吳建利. 2015. 基于SSR和ISSR的鄱陽湖流域野生菰資源的遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，16（1）：133-141. [Wang H M，Wu G L，Jiang S L，Huang Q N，F(xiàn)eng B H，Huang C G，Jiang S M，Wu J L. 2015. Genetic diversity of Zizania latifolia Griseb. from Poyang Lake basin based on SSR and ISSR analysis[J]. Journal of Plant Genetic Resources，16（1）：133-141.]

王惠梅，謝小燕，蘇曉娜，江紹玫，吳建利. 2018. 中國菰資源研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，19（2）：279-288. [Wang H M，Xie X Y，Su X N，Jiang S M，Wu J L. 2018. Current status and application prospect of Zizania latifolia（Griseb.） Turcz. ex stapf in China[J]. Journal of Plant Genetic Resources，19（2）：279-288.]

吳國林，王惠梅，黃奇娜，奉保華，江紹琳，吳建利，黃長干，江紹玫. 2014. 菰（Zizania latifolia）ISSR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，15（6）：1395-1400. [Wu G L，Wang H M，Huang Q N，F(xiàn)eng B H，Jiang S L，Wu J L，Huang C G，Jiang S M. 2014. Establishment and optimization of an ISSR reaction system for the wild-rice Zizania latifolia Griseb（Turcz）[J]. Journal of Plant Gene-tic Resources，15（6）：1395-1400.]

葉春秀，李有忠，莊振剛，謝宗銘. 2014. 兩種電泳方法在分析新陸早系列品種SSR標(biāo)記結(jié)果中的比較與應(yīng)用[J]. 分子植物育種，12（5）：909-913. [Ye C X，Li Y Z，Zhuang Z G，Xie Z M. 2014. Comparation and application of the two electrophoresis on SSR of earliness cultivars in upland cotton in Xinjiang[J]. Molecular Plant Breeding，12（5）：909-913.]

臧劍，顏育民，張志剛，鄒世湘，彭瓊. 2017. 菰均一化全長cDNA文庫的構(gòu)建[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，18（4）：11-13. [Zang J，Yan Y M，Zhang Z G，Zou S X，Peng Q. 2017. Establishment of a normalized full-length cDNA library of Zizania latifolia[J]. Hunan Agricultural Sciences，18（4）：11-13.]

翟成凱，孫桂菊，陸琮明，蔣兆坤，張小強(qiáng). 2000. 中國菰資源及其應(yīng)用價(jià)值的研究[J]. 資源科學(xué)，22（6）：22-26. [Zhai C K，Sun G J，Lu C M，Jiang Z K，Zhang X Q. 2000. Study on Chinese Zizania L. resources and their utilization value[J]. Resources Science，22（6）：22-26.]

周麗霞，肖勇，楊耀東，馬子龍. 2013. 油棕基因組DNA 3種提取方法的比較研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，25（8）：9-11. [Zhou L X，Xiao Y，Yang Y D，Ma Z L. 2013. Comparison of three extract methods for genomic DNA of Elaeis guineensis[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，25（8）：9-11.]

Chen Y Y，Chu H J，Liu H，Liu Y L. 2012. Abundant genetic diversity of the wild rice Zizania latifolia in central China revealed by microsatellites[J]. Annals of Applied Biology，161（2）：192-201.

Kennard W C，Phillips R L，Porter R A，Grombacher A W. 1999. A comparative map of wild rice（Zizania palustris L. 2n=2x=30）[J]. Theoretical and Applied Genetics，101（5-6）：677-684.

Quan Z W，Pan L，Ke W D，Liu Y M，Ding Y. 2009. Sixteen polymorphic microsatellite markers from Zizania latifolia Turcz.（Poaceae）[J]. Molecular Ecology Resources，9（3）：887-889.

Rohlf F J. 1998. NTSYSpc numerical taxonomy and multivariate analysis systemversion 2.0[D]. New York：State University of New York.

Xu X W，Ke W D，Yu X P，Wen J，Ge S. 2008. A preliminary study on population genetic structure and phylogeography of the wild and cultivated Zizania latifolia（Poaceae） based on Adh1a sequences[J]. Theoretical and Applied Genetics，116（6）：835-843.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）