李媛 劉國(guó)祥 佟英 蔣彩虹

摘? 要：為精準(zhǔn)鑒定國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)中種質(zhì)資源的黑脛病抗性，采用田間人工接種煙草黑脛病0號(hào)生理小種的方法，對(duì)77份原標(biāo)記為抗病的烤煙種質(zhì)資源進(jìn)行了抗病性再鑒定。結(jié)果表明，大青筋和尖葉柳2份材料表現(xiàn)為高抗黑脛病;黑柳子等23份材料表現(xiàn)為抗黑脛病，其中大黑柳、胎里肥2412、彎梗子、大白筋0522、大黃金0295和黃苗二苯煙2221的抗性強(qiáng);落地黃等20份材料表現(xiàn)為中抗黑脛病;中感黑脛病和高感黑脛病材料各12份;8份材料表現(xiàn)為感黑脛病。對(duì)25份抗性材料進(jìn)行農(nóng)藝性狀鑒定和遺傳多樣性分析表明，供試種質(zhì)遺傳多樣性豐富，其中葉寬的遺傳多樣性指數(shù)最高。研究結(jié)果為煙草黑脛病抗性育種提供了材料基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：烤煙;黑脛病;種質(zhì)資源;抗性鑒定

中圖分類號(hào)：S572.03????????? 文章編號(hào)：1007-5119（2019）02-0001-07????? DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2019.02.001

Abstract： In order to identify the resistance to black shank of germplasm resources from the National Bank of Tobacco Germplasm Resources accurately， race 0 of Phytophthora nicotianae was used to re-identify the resistance of 77 flue-cured tobacco germplasm resources previously identified as being resistant by field inoculation method. The results indicated that， among all the variety resources， Daqingjin and Jianyeliu were highly resistant. 23 of the varieties including Heiliuzi were resistant， among which Daheiliu， Tailifei 2412， Wangengzi， Dabaijin 0522， Dahuangjin 0295 and Huangmiaoerbenyan 2221 had stronger resistance. 20 of the tested varieties including Luodihuang were moderate resistant. The number of moderate susceptible and highly susceptible varieties were both 12. And 8 varieties were susceptible. Agronomic traits of the 25 resistant materials were characterized and analyzed for genetic diversity. The results showed that the tested germplasms had a high level of genetic diversity， and the width of leaves had the highest diversity index. These results could provide foundation for improvement of resistance to black shank disease in tobacco.

Keywords： flue-cured tobacco; black shank disease; germplasm; resistance evaluation

煙草黑脛病遍布世界各主要產(chǎn)煙區(qū)，是煙草生產(chǎn)上最具毀滅性病害之一，如果防治措施不到位，黑脛病引起的損失可達(dá)100%[1]。就目前而言，種植抗病品種是防治黑脛病最經(jīng)濟(jì)有效的措施。我國(guó)有近400年的煙草栽培歷史，具有豐富的煙草種質(zhì)資源[2]，有利于抗黑脛病煙草種質(zhì)的篩選。近年來(lái)學(xué)者們對(duì)煙草種質(zhì)進(jìn)行了大量的黑脛病抗病性鑒定。張竹林[3]最早于1989—1993年從20個(gè)烤煙品種（系）中篩選到10個(gè)高抗品種（系）;許美玲等[4]采用田間人工接種0號(hào)生理小種的方法從213個(gè)烤煙品種資源中篩選出17個(gè)高抗品種和55個(gè)中抗品種;于海芹等[5]從新引進(jìn)的288份煙草資源中篩選出16份抗病資源和23份中抗資源;向世鵬等[6]利用黑脛病1號(hào)生理小種從49份種質(zhì)資源中篩選出24份抗病材料。

煙草黑脛病病原菌的致病力與外界環(huán)境因素相關(guān)，不同年份、不同地點(diǎn)的抗性鑒定結(jié)果往往存在較大差異，抗性材料的精準(zhǔn)鑒定是抗病品種選育的關(guān)鍵。我國(guó)的煙葉生產(chǎn)以烤煙生產(chǎn)為主，截至2017年6月，全國(guó)共審（認(rèn)）定152個(gè)煙草品種，其中烤煙120個(gè)[7]。鑒于以往是對(duì)烤煙和其他類型煙草種質(zhì)資源的混合鑒定以及病原生理小種的不同（有的是0號(hào)生理小種，有的是1號(hào)生理小種），本研究以國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)保存的煙草種質(zhì)資源為基礎(chǔ)，采用成株期人工接種黑脛病0號(hào)生理小種的鑒定方法，從原標(biāo)記為高抗和抗病的烤煙種質(zhì)中選取77份進(jìn)行了黑脛病抗性再鑒定，以期篩選優(yōu)異抗病材料，為后續(xù)的抗病遺傳研究以及抗病育種提供材料基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 供試材料

本研究所用試驗(yàn)材料來(lái)自國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)，均為烤煙，全國(guó)統(tǒng)一編號(hào)、種質(zhì)名稱、原產(chǎn)地、種質(zhì)類型詳見(jiàn)表1。供試黑脛病病菌：黑脛病0號(hào)生理小種。

1.2? 研究地點(diǎn)與方法

1.2.1? 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)? 試驗(yàn)于2016年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所青島試驗(yàn)基地黑脛病病圃進(jìn)行。2016年7月5日做菌谷，7月19日接種，8月10日調(diào)查。

1.2.2? 接種與調(diào)查方法? 采用郭璇等[8]方法制備菌谷，待煙苗生長(zhǎng)至團(tuán)棵期，劃傷莖基部，每株接種3～5 g菌谷，立即覆土并灌水保濕。接種后3周調(diào)查每株在田間的發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)。病害嚴(yán)重度的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23222—2008[9]執(zhí)行。各鑒定種質(zhì)在試驗(yàn)田隨機(jī)排列，3次重復(fù)，每重復(fù)植煙20株，行株距為1.1 m×0.55 m，大田常規(guī)管理。

1.2.3? 抗性劃分具體標(biāo)準(zhǔn)? 根據(jù)病情指數(shù)將品種的抗性劃分為6級(jí)：高抗，病情指數(shù)為0;抗病，病情指數(shù)為0.1～20.0;中抗，病情指數(shù)為20.1～40.0;中感，病情指數(shù)為40.1～60.0;感病，病情指數(shù)為60.1～80.0;高感，病情指數(shù)為80.1～100.0。

1.2.4? 植物學(xué)性狀及農(nóng)藝性狀調(diào)查? 植物學(xué)性狀包括株型、葉形、葉面、葉緣、葉片主脈粗細(xì)、葉片厚薄、葉色、花序密度、花序形狀、花色和蒴果形狀。農(nóng)藝性狀包括：株高、莖圍、節(jié)距、葉數(shù)、葉長(zhǎng)、葉寬、花冠長(zhǎng)度、花冠直徑、花萼長(zhǎng)度[10]。

1.2.5? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析? 利用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、SPSS 20.0進(jìn)行方差分析，采用張倩男等[11]的方法計(jì)算Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H'）。

2? 結(jié)? 果

2.1? 種質(zhì)資源的抗病性評(píng)價(jià)

77份烤煙種質(zhì)的黑脛病抗性評(píng)價(jià)表明（表2），大青筋和尖葉柳抗病性最強(qiáng)，平均病指為0.00，高抗黑脛病。黑柳子等23份材料表現(xiàn)為抗黑脛病，占供試材料總數(shù)的29.87%，其中大黑柳、胎里肥2412、彎梗子、大白筋0522、大黃金0295和黃苗二苯煙2221的抗性強(qiáng)（病情指數(shù)<4）;落地黃等20份材料表現(xiàn)為中抗黑脛病，占25.97%;小黃金0009等12份材料表現(xiàn)為中感黑脛病，占15.58%;大柳葉2022等8份材料表現(xiàn)為感黑脛病，占10.39%;小黃金等12份材料表現(xiàn)為高感黑脛病，占15.58%。

本試驗(yàn)結(jié)果與中期庫(kù)原抗性鑒定結(jié)果相比，僅有黑柳子等19個(gè)種質(zhì)抗病性沒(méi)有變化，占供試烤煙種質(zhì)總數(shù)的24.68%;大多數(shù)種質(zhì)的抗病性有不同程度的減弱，其中分別有12個(gè)種質(zhì)表現(xiàn)為高感黑脛病和中感黑脛病，與原鑒定結(jié)果差異最大;原鑒定結(jié)果為高抗的9個(gè)種質(zhì)中有5個(gè)表現(xiàn)為中抗，4個(gè)表現(xiàn)為抗病;落地黃等15個(gè)種質(zhì)本試驗(yàn)結(jié)果為中抗，原鑒定結(jié)果為抗病;大青筋和尖葉柳表現(xiàn)為高抗黑脛病，與原鑒定結(jié)果有一定差異。

2.2? 抗病資源的地理分布與主要質(zhì)量性狀分析

供試烤煙種質(zhì)來(lái)自中國(guó)9個(gè)省份（表3），其中抗病以上的資源共25份，主要來(lái)自山東（11份）、安徽（8份）、河南（5份）和云南（1份）。就本研究來(lái)說(shuō)，我國(guó)烤煙抗黑脛病資源主要分布在華東地區(qū)。

通過(guò)對(duì)25份抗病資源進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出一定的多樣性（表4），遺傳多樣性指數(shù)變化范圍在0.17～1.21（表5）。株型涉及塔形（13份）和筒形（12份）;葉片主葉脈粗細(xì)程度主要為中（19份）和細(xì)（6份）;葉緣主要為微波（19份），遺傳多樣性指數(shù)為0.66;花色主要為淡紅色（24份），遺傳多樣性指數(shù)最小，僅為0.17。葉形和葉面褶皺程度的變異類型較為豐富，遺傳多樣性指數(shù)相對(duì)較高，分別為1.21和1.17，其中葉形主要以橢圓和寬橢圓為主，共占總材料數(shù)的72%;葉面褶皺程度主要以較平和較皺為主。

2.3? 數(shù)量性狀變異及遺傳多樣性分析

根據(jù)表型性狀田間調(diào)查結(jié)果，對(duì)株高、莖圍、節(jié)距等9個(gè)數(shù)量性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示（表6），株高的變異幅度最大，標(biāo)準(zhǔn)差也最高，具有較高的離散程度?；ㄝ嚅L(zhǎng)度、節(jié)距、花冠直徑的變異系數(shù)相對(duì)較高，依次為33.83%、28.01%、27.61%;葉數(shù)和葉長(zhǎng)的變異系數(shù)較小，分別為12.85%和14.99%，說(shuō)明變異程度低。

3? 討? 論

目前，煙草黑脛病防治措施主要有化學(xué)防治、生物防治和農(nóng)業(yè)防治。其中，農(nóng)業(yè)防治中種植抗病品種是黑脛病防治的最經(jīng)濟(jì)有效的方法。抗源是抗病育種的基礎(chǔ)，我國(guó)抗黑脛病品種的抗源主要來(lái)自Florida 301，導(dǎo)致我國(guó)抗黑脛病品種遺傳多樣性較差，環(huán)境適應(yīng)力和抗病性都有所下降[12-13]。此外研究表明，利用抗黑脛病基因Ph和Wz可實(shí)現(xiàn)抗性和品質(zhì)的同步改良[14-15]。本試驗(yàn)通過(guò)人工定量注射接種黑脛病0號(hào)生理小種的方法，從77個(gè)烤煙種質(zhì)中篩選到2個(gè)高抗種質(zhì)：大青筋和尖葉柳，可以作為抗源加以利用，拓寬抗性種質(zhì)資源的遺傳背景。另外，大黑柳、胎里肥2412、彎梗子、大白筋0522、大黃金0295和黃苗二苯煙2221也可以作為抗性種質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行抗病基因挖掘和遺傳規(guī)律的研究，有利于培育品質(zhì)優(yōu)良的抗黑脛病新品種。

本試驗(yàn)結(jié)果與種質(zhì)庫(kù)原鑒定結(jié)果差異較大，大多數(shù)種質(zhì)的抗病性有不同程度的減弱，共有32個(gè)原標(biāo)記為抗病的種質(zhì)表現(xiàn)為高感、感病和中感黑脛病，占供試材料總數(shù)的41.56%。對(duì)照前人研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，落地黃和革新三號(hào)的抗病性與報(bào)道一致，分別為中抗和抗黑脛病[16-17];在許美玲等[4]報(bào)道中，中煙9203為高抗，煙變子、峨山烤煙和鎮(zhèn)雄烤煙為抗病，均與本文結(jié)果不同;中煙90在黃成江等[18]報(bào)道中為中感，而本試驗(yàn)結(jié)果為中抗。鑒定結(jié)果存在差異一方面可能由于氣候條件、試驗(yàn)地環(huán)境以及抗性鑒定方法的不同，導(dǎo)致煙草黑脛病病原菌的致病力不同[19]。另一方面，煙草黑脛病菌具有多個(gè)生理小種，在煙草生產(chǎn)過(guò)程中，病菌的重組和突變可能使抗病品種喪失抗性。因此，精準(zhǔn)鑒定種質(zhì)庫(kù)中種質(zhì)資源的抗病性信息有利于煙草的大田生產(chǎn)和抗性遺傳研究。

本研究獲得的25份抗病資源分布于我國(guó)的9個(gè)省份，主要集中在華東地區(qū)，在一定程度上反映出我國(guó)煙草抗黑脛病資源分布的廣泛性。煙草抗黑脛病資源還具有豐富的形態(tài)多樣性，這為以后的抗黑脛病育種提供了豐富的遺傳材料。

煙草黑脛病抗性易受環(huán)境和栽培措施等因素影響，在抗性鑒定上還具有一定的局限性，因此，在后續(xù)的研究中將結(jié)合與抗病基因連鎖的SSR分子標(biāo)記及SNP標(biāo)記進(jìn)一步檢測(cè)各種質(zhì)資源的抗病性，以期為煙草品種改良提供有效依據(jù)，為煙草種質(zhì)資源研究和育種奠定基礎(chǔ)。

4? 結(jié)? 論

本研究篩選到的2個(gè)高抗黑脛病種質(zhì)，大青筋和尖葉柳可作為抗源加以利用;大黑柳、胎里肥2412、彎梗子、大白筋0522、大黃金0295和黃苗二苯煙2221的抗性也較強(qiáng)，可作為抗性種質(zhì)進(jìn)一步研究。煙草抗黑脛病種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性，為實(shí)現(xiàn)抗性和品質(zhì)的同步改良提供了豐富的遺傳材料。

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