林世杰，周 虎，張麗峰，冷 靜

（1.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，同時(shí)也是全球第二大死亡原因。其中，肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是肝臟最常見的原發(fā)性腫瘤，它是導(dǎo)致癌癥相關(guān)性死亡的第二大病因，也是全球第16大常見死因［1-2］。我國(guó)是肝細(xì)胞癌（下簡(jiǎn)稱“肝癌”）的高發(fā)國(guó)家，肝癌是我國(guó)發(fā)病率第5位、死亡率第3位的惡性腫瘤［3-4］，目前肝癌的主要治療方法是手術(shù)切除，但由于多數(shù)患者被確診時(shí)已處于中晚期，所以肝癌患者的生存率普遍不高［5］，免疫治療是肝癌治療的熱門研究領(lǐng)域，近年來(lái)取得了一定的進(jìn)展［6］。

外泌體（Exosomes）是一種由不同細(xì)胞分泌的囊泡小體，直徑一般為30～100 nm［7］，其含有大量與其來(lái)源及功能相關(guān)的蛋白質(zhì)、RNA等成分［8］。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體含有親代腫瘤細(xì)胞物質(zhì)，并通過(guò)將其內(nèi)容物轉(zhuǎn)運(yùn)至受體細(xì)胞，從而影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用［9］。

樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DC）在啟動(dòng)先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。眾所周知，經(jīng)腫瘤誘導(dǎo)的DC是一把雙刃劍，一方面，不成熟的DC捕獲抗原并逐漸成熟，然后遷移到淋巴結(jié)激活T細(xì)胞，刺激宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)［10］；另一方面，腫瘤微環(huán)境中的特異性信號(hào)可能會(huì)抑制DC成熟，導(dǎo)致形成具有免疫抑制或免疫耐受的DC［11-12］。腫瘤來(lái)源外泌體（Tumor-derived exosomes，TEXs）在腫瘤免疫逃逸中有著重要作用，其自身攜帶的生物學(xué)信號(hào)可作用于腫瘤微環(huán)境、遠(yuǎn)處組織及細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞功能紊亂［13］。研究表明TEXs可誘導(dǎo)DC免疫耐受或成熟障礙及活化特異性T細(xì)胞的功能缺陷［14-18］?；谏鲜鲅芯?，本課題組擬探索肝癌外泌體是否也可誘導(dǎo)DC的成熟障礙和功能減退。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞系 人肝癌細(xì)胞系HepG2由廣西醫(yī)科大學(xué)組織與胚胎學(xué)教研室提供，無(wú)癌活性的永生化肝細(xì)胞MIHA購(gòu)自上海素爾生物科技有限公司，細(xì)胞用含有10%FBS（Gibco）的 RPMI-1640（Gibco）培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中；樹突狀細(xì)胞取自健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%FBSRPMI-1640培養(yǎng)基，于培養(yǎng)基中加入濃度為20 ng/ml的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、10 ng/ml的白介素4（Interleukin-4，IL-4）、105U/ml的 β 干擾素（Interferon-β，IFN-β）。

1.2 主要試劑 無(wú)外泌體FBS、ExoQuick-TC外泌體提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)SBI公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE快速凝膠配制試劑盒購(gòu)自碧云天公司；抗體Anti-CD63、Anti-Alix購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司；抗體 FITC anti-Human CD83、FITC anti-Human CD80、APCanti-Human CD86、APCanti-HLA DR、Human Trustain FCX購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；Human CD14 Positive selection kit、Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)Stemcell公司；Human IL-12 p70 ELISA Kit購(gòu)自中國(guó)欣博盛公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天公司。

2 方法

2.1 外泌體的提取 收集含10%無(wú)外泌體FBS的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加入15 ml離心管中，300×g離心5 min去除細(xì)胞碎片，收集上清液于另一離心管，使用0.22μm無(wú)菌濾頭過(guò)濾上清液并收集進(jìn)新管，于4℃10 000×g離心30 min。將收集的上清液加入10 kb超濾管中，水平離心機(jī)上3 000×g離心15 min，收集過(guò)濾后的上清液，加入提取試劑，將混合液放于4℃冰箱過(guò)夜，次日將混合液置于離心機(jī)上，1 500×g、4℃離心30 min，棄去上清液，用PBS緩沖液重懸沉淀，BCA蛋白濃度測(cè)定后將樣本置于-80℃冰箱保存。通過(guò)透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，用PBS稀釋外泌體樣本，于銅網(wǎng)上滴加10μl樣本，室溫放置1～2 min，濾紙吸去多余液體。向銅網(wǎng)上滴加30μl 2%磷鎢酸，室溫負(fù)染1～2 min，并用濾紙吸干多余的負(fù)染液。室溫下用PBS沖洗網(wǎng)格3遍，白熾燈下晾干后電鏡下觀察。

2.2 Nano FCM檢測(cè)外泌體粒徑分布及顆粒濃度 Nano FCM是類似于流式細(xì)胞儀工作原理的微小顆粒分析儀器，檢測(cè)范圍在20～200 nm之間。本研究使用Nano FCM儀器檢測(cè)ExoQuick-TC試劑盒法提取的HepG2細(xì)胞外泌體，步驟如下：樣本獲得的外泌體樣本用200μl PBS重懸后，取10μl用PBS稀釋500倍，先用單純PBS上樣，檢測(cè)溶液粒徑值，作為外泌體上機(jī)檢測(cè)背景值，將稀釋好的外泌體樣本上機(jī)，檢測(cè)其粒徑分布及顆粒濃度。

2.3 Western Blot檢測(cè)外泌體及細(xì)胞的標(biāo)記蛋白 提取細(xì)胞總蛋白，方法為：用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次，在細(xì)胞中加入200μl RIPA蛋白裂解液（含2μl PMSF），冰上裂解10 min，12 000×g、4 ℃離心15 min，收集上清液，BCA法測(cè)定樣本蛋白濃度后待用。取50 ml外泌體樣本，加入50μl RIPA蛋白裂解液。取20μg蛋白樣本加入上樣緩沖液中，于99℃金屬浴中煮10 min，經(jīng)SDS-PAGE分離電泳，半干轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后，分別加入一抗（按1∶1 000稀釋）：Anti-CD63、Anti-Alix、Cytochrome C，4 ℃孵育過(guò)夜。按1∶2 500稀釋二抗，室溫孵育2 h，顯影收集數(shù)據(jù)。

2.4 DC的誘導(dǎo) 取健康志愿者的外周血10 ml經(jīng)過(guò)Ficoll密度離心后分離出人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs），經(jīng)磁珠分離后獲得CD14+細(xì)胞。將分離的細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，接種于 48 孔板，500 μl/孔；于培養(yǎng)基中加入 GM-CSF 20 ng/ml、IL-4 10 ng/ml、IFN-β 105U/ml，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。向不成熟的DC中加入50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的 HepG2外泌體，同時(shí)加入10 ng/ml的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激 DC成熟，培養(yǎng)72 h后收獲DC待檢，將上清液凍存于-80℃。

2.5 DC表面分子染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè) 將DC收集于1.5 ml EP管中，使用1 ml 0.1%FBSRPMI-1640清洗1次，用200μl完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。各管平分為2組，并從各管中分別取出10μl細(xì)胞懸液放于1個(gè)新管中作為不染色的空白對(duì)照，各管加入3.5μl FC封閉抗體，冰上孵育15 min。分2組加入熒光標(biāo)記抗體，冰上孵育 30 min：① anti-CD83 FITC、anti-CD86 APC；② anti-CD80 FITC、anti-HLA DR APC。各管加入1 ml 1%FBSRPMI-1640洗細(xì)胞1次，離心棄上清液后加入500μl 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，流式上機(jī)檢測(cè)。

2.6 ELISA檢測(cè)DC培養(yǎng)上清液中IL-12的水平 從-80℃冰箱中取出DC培養(yǎng)上清液，解凍。按照Human IL-12 p70 ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.7 CCK-8檢測(cè)DC刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力 提取與DC來(lái)源不同的健康個(gè)體的PBMCs，用2%FBSRPMI-1640重懸后接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，取未貼壁的細(xì)胞即為淋巴細(xì)胞。完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后加入96孔板，每孔100μl，2×105個(gè)/孔；取已刺激成熟的DC加入96孔板，每孔100 μl，2×104個(gè)/孔；即 DC∶淋巴細(xì)胞=1∶10；培養(yǎng)72 h后，各孔加入20μl CCK-8溶液，放置于培養(yǎng)箱3～4 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)A450OD值。按公式計(jì)算：刺激指數(shù)（Stimulating Indext，SI）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-未刺激組OD值）/未刺激組OD值。SI值越大則DC刺激異體T細(xì)胞增殖的能力越強(qiáng)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用SPSS 21.0和GraphPad Prism 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組實(shí)驗(yàn)組間計(jì)量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析；兩組數(shù)據(jù)之間的差異比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性意義。

3 結(jié) 果

3.1 HepG2細(xì)胞來(lái)源外泌體電鏡鑒定 見圖1。

圖1 外泌體的電鏡觀察圖

如圖1所示，在透射電鏡下觀察，本研究所提取的外泌體大小在30～100 nm以內(nèi)，其呈現(xiàn)出外泌體獨(dú)特的杯狀形態(tài)，有著雙膜結(jié)構(gòu)，可根據(jù)其形態(tài)特征證明其為外泌體［19］。

3.2 外泌體粒徑分布及濃度 采用Nano FCM儀器檢測(cè)ExoQuick-TC試劑盒法提取的HepG2細(xì)胞外泌體樣本，顯示其平均粒徑為75.81±26.47 nm（圖2），濃度為 4.98×1010個(gè)/ml（10 ml培養(yǎng)上清液所得外泌體用200μl PBS稀釋）。同時(shí)，提取MIHA細(xì)胞外泌體，Nano FCM檢測(cè)顯示其粒徑分布在50～150 nm之間，平均粒徑74.91±25.38 nm（圖3）。

3.3 Western Blot檢測(cè)外泌體特征性蛋白的表達(dá) 見圖4、圖5。

圖4、圖5顯示，HepG2和MIHA細(xì)胞及其來(lái)源的細(xì)胞外泌體表達(dá)CD63與Alix，并且外泌體中無(wú)細(xì)胞色素C（Cytochrome C），表明了本研究所提取的外泌體并無(wú)細(xì)胞碎片的污染［20］，可為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)排除了細(xì)胞裂解物的干擾。

圖2 HepG2外泌體的Nano FCM檢測(cè)結(jié)果

圖3 MIHA外泌體的Nano FCM檢測(cè)結(jié)果

圖4 HepG2細(xì)胞及外泌體相關(guān)蛋白表達(dá)

圖5 MIHA細(xì)胞及外泌體相關(guān)蛋白表達(dá)

3.4 HepG2細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)DC成熟的影響 流式檢測(cè)DC各表面分子表達(dá)結(jié)果見圖5。流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與僅加入LPS的對(duì)照組相比，HepG2外泌體刺激的DC表達(dá)CD80和CD83的細(xì)胞比例明顯下降，差異有顯著性意義（P＜0.01），并呈一定的濃度依賴性，即外泌體含量越高陽(yáng)性率越低；MIHA-EXO組較單獨(dú)LPS組無(wú)明顯差異，結(jié)果見表1。而HepG2外泌體刺激的DC表達(dá)CD86、HLA-DR的比例與LPS對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，陽(yáng)性率均在95%以上（圖5）。

表1 HepG2細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)DC中CD80、CD83表達(dá)的影響 （±s）

表1 HepG2細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)DC中CD80、CD83表達(dá)的影響 （±s）

注：與LPS組比較，①P＜0.01

組 別LPS 50μg/ml HepG2 EXO 100μg/ml HepG2 EXO 200μg/ml HepG2 EXO 200μg/ml MIHA EXO n 3 3 3 3 3 CD80陽(yáng)性表達(dá)率（%）6.80±0.16 4.27±0.14①3.24±0.16①2.76±0.10①5.47±0.38 CD83陽(yáng)性表達(dá)率（%）74.78±1.13 71.49±1.30①68.91±1.31①66.09±2.05①72.85±0.50

3.5 HepG2外泌體對(duì)DC分泌IL-12的影響 見表2。結(jié)果顯示，與LPS對(duì)照組相比，濃度為200μg/ml的HepG2 EXO干預(yù)組DC培養(yǎng)上清液中IL-12的量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），50 μg/ml、100 μg/ml HepG2 EXO干預(yù)組則無(wú)明顯差異（P＞0.05），提示肝癌細(xì)胞外泌體濃度較高時(shí)對(duì)DC分泌IL-12有抑制作用。200μg/ml的MIHA EXO組較單獨(dú)LPS組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

3.6 HepG2外泌體對(duì)DC刺激淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響 見表3。

結(jié)果表明，與LPS對(duì)照組比較，200μg/ml HepG2 EXO對(duì)DC刺激淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)的刺激指數(shù)明顯降低（P＜0.05），而50μg/ml、100μg/ml HepG2 EXO干預(yù)后差異不明顯（P＞0.05），這說(shuō)明較高濃度的肝癌細(xì)胞外泌體可以抑制DC刺激異體T細(xì)胞增殖的能力。200μg/ml MIHA EXO組較單獨(dú)LPS組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

4 討論

圖5 流式檢測(cè)DC表面分子表達(dá)結(jié)果

表2 ELISA檢測(cè)DC培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-12的濃度 （±s）

表2 ELISA檢測(cè)DC培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-12的濃度 （±s）

注：與LPS組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組 別Immature LPS 200μg/ml MIHA EXO 50μg/ml HepG2 EXO 100μg/ml HepG2 EXO 200μg/ml HepG2 EXO n 3 3 3 3 3 3濃度（pg/ml）21.23±3.37②183.46±36.82 173.55±47.03 168.07±55.64 176.11±56.81 93.98±9.25①

表3 HepG2外泌體對(duì)DC刺激淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)的刺激指數(shù) （±s）

表3 HepG2外泌體對(duì)DC刺激淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)的刺激指數(shù) （±s）

注：與LPS組比較，①P＜0.05

組 別Immature LPS 200μg/ml MIHA EXO 50μg/ml HepG2 EXO 100μg/ml HepG2 EXO 200μg/ml HepG2 EXO n 3 3 3 3 3 3刺激指數(shù)（%）30.02±11.03①70.09±10.98 67.93±6.47 58.17±5.81 56.51±13.02 38.96±10.12①

DC是人體內(nèi)最重要的抗原提呈細(xì)胞，對(duì)天然免疫與特異性免疫有著重要的連接作用，DC可以活化初始T淋巴細(xì)胞，在人體抗腫瘤特異性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)中發(fā)揮著重要作用［21］。不成熟的DC通過(guò)表達(dá)模式識(shí)別受體，可識(shí)別并攝取外源性抗原，還有很強(qiáng)的抗原加工能力，但是由于其低表達(dá)MHCⅡ類分子、黏附分子以及CD80、CD83、CD86等共刺激分子，所以不成熟的DC激活免疫應(yīng)答的能力較弱［22-23］。當(dāng)不成熟的DC接觸到LPS等炎性刺激劑后可以逐漸發(fā)育成熟。成熟的DC識(shí)別、攝取和加工抗原的能力減弱，但是高表達(dá)MHCⅡ類分子、黏附分子和共刺激分子，因此能有效地提呈抗原、誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答。在腫瘤微環(huán)境中DC常常是不成熟的，因此無(wú)法誘導(dǎo)有效的特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答，原因主要有兩個(gè)方面：一方面是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞存在抗原的缺失和抗原調(diào)變，使不成熟DC難以識(shí)別和攝取腫瘤抗原；另一方面，腫瘤微環(huán)境中的特異性抑制信號(hào)可以抑制DC的成熟，并且使得其變成具有免疫抑制作用的DC。TEXs作為腫瘤細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸與信息傳遞的載體，在腫瘤免疫抑制中發(fā)揮重要作用，其不僅能促進(jìn)局部腫瘤微環(huán)境的形成，還因其具有脂質(zhì)雙層膜的結(jié)構(gòu)，可以穩(wěn)定地遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，作用于全身，這一功能與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究表明多種惡性腫瘤的TEXs可以誘導(dǎo)DC的成熟抑制、免疫耐受、抗原提呈功能下降或喪失等［17，24-25］，但是肝癌來(lái)源的 TEXs對(duì) DC 功能抑制的研究還較少。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞HepG2來(lái)源的外泌體對(duì)DC表面CD80、CD83的表達(dá)有一定抑制作用。CD80是DC提供T細(xì)胞活化“第二信號(hào)”的重要分子，如果缺乏CD80等共刺激分子提供的“第二信號(hào)”，則接受了“第一信號(hào)”的T細(xì)胞不但不能被激活產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，反而會(huì)發(fā)生失能［26-27］。CD83是DC的成熟標(biāo)記之一，腫瘤組織中的樹突狀細(xì)胞CD83分子表達(dá)量的高低是評(píng)判腫瘤預(yù)后的指標(biāo)之一，CD83表達(dá)越低則預(yù)后越差［28-29］。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌外泌體降低了DC這兩種分子的表達(dá)，提示肝癌細(xì)胞通過(guò)外泌體途徑誘導(dǎo)全身性的免疫抑制是一種促進(jìn)腫瘤發(fā)展與轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。IL-12又稱細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞成熟因子（cytotoxic lymphoctyto maturation factor，CLMF）或自然殺傷細(xì)胞刺激因子（natural killer cell stimulation factor，NKSF），其是在 Th1 細(xì)胞分化和Th1型細(xì)胞因子介導(dǎo)的抗腫瘤免疫和抗炎癥免疫中發(fā)揮作用的最重要細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞、DC和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，可通過(guò)促進(jìn)IFN-γ的產(chǎn)生誘導(dǎo)CD4+Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，在Th1反應(yīng)中處于不可或缺的地位［30-32］。IL-12作為一種細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子有直接抗腫瘤作用，在原發(fā)性、繼發(fā)性腫瘤的抗腫瘤免疫反應(yīng)中均發(fā)揮重要作用［33-34］，我們發(fā)現(xiàn)，肝癌外泌體有較強(qiáng)的抑制DC分泌IL-12的免疫抑制效應(yīng)，說(shuō)明肝癌外泌體可以導(dǎo)致DC的抗腫瘤免疫功能降低。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中，我們利用CCK-8試劑檢測(cè)各孔淋巴細(xì)胞的相對(duì)增殖數(shù)量，CCK-8試劑中含有WST-8，在電子載體PMS的作用下可以與細(xì)胞中線粒體內(nèi)的某些脫氫酶發(fā)生反應(yīng)，生成甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye），該物質(zhì)具有高度水溶性，呈橙黃色。當(dāng)活細(xì)胞數(shù)量越多時(shí)，甲瓚的生成也越多，顏色就越深，根據(jù)這一特性可以用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度來(lái)判斷各孔中活細(xì)胞相對(duì)數(shù)量，并且CCK-8試劑對(duì)細(xì)胞毒性也非常小，一般不會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)造成影響［35］?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)可以直接反映DC誘導(dǎo)同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力，成熟的DC誘導(dǎo)異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力較強(qiáng)，本研究觀察到較低劑量（50μg/ml、100μg/ml）的肝癌細(xì)胞外泌體沒(méi)有明顯影響DC刺激異體T淋巴細(xì)胞的能力，而高劑量（200μg/ml）肝癌細(xì)胞外泌體可以使DC刺激指數(shù)降低，進(jìn)一步驗(yàn)證了肝癌細(xì)胞外泌體對(duì)DC的免疫功能抑制。

綜上，肝癌細(xì)胞外泌體對(duì)DC表面成熟相關(guān)分子表達(dá)、介導(dǎo)抗腫瘤免疫的細(xì)胞因子IL-12的分泌、刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力均有一定的抑制作用，這為我們理解肝癌的免疫逃逸及發(fā)展、轉(zhuǎn)移提供了思路，同時(shí)也為肝癌的免疫治療，特別是DC相關(guān)的免疫治療提供了理論基礎(chǔ)。