夏鈺淇，楊 洋，尚振中，李中華

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 南通 226000）

肝纖維化是一種可逆的傷口愈合反應(yīng)，是肝臟在不同的代謝、病毒和毒性刺激下發(fā)生急性或慢性損傷的特征。肝纖維化最終會導(dǎo)致肝硬化和各種并發(fā)癥，如肝衰竭和門脈高壓、肝細(xì)胞癌［1-3］。據(jù)報道，肝星狀細(xì)胞（HSCs）的增殖和活化在肝纖維化的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用［4］。HSCs活化引起透明質(zhì)酸、層粘連蛋白和膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的合成、降解異常和過分沉積，形成肝纖維化［5］。目前已有研究表明，PI3K/Akt信號通路和肝纖維化之間存在著密切的聯(lián)系，通過抑制PI3K/Akt信號通路可以減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，并且抑制HSCs的增殖，促進(jìn)其凋亡，從而達(dá)到治療的目的［6-11］。復(fù)方半枝蓮顆粒由半枝蓮、墨旱蓮、柴胡、黃芪、黨參等組成，臨床用于治療肝炎療效良好，為進(jìn)一步明確其藥理作用，本研究基于PI3K/Akt信號通路，探討復(fù)方半枝蓮顆粒的抗肝纖維化作用機制，以豐富其治療肝纖維化的理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠56只，體質(zhì)量180～200 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格許可證號：SCXK桂2009-0002。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠6只，進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，養(yǎng)殖環(huán)境室內(nèi)溫度設(shè)置為22～26℃、相對濕度40%～70%。

1.2 主要藥物、試劑和儀器設(shè)備

1.2.1 藥物 復(fù)方半枝蓮顆粒由半枝蓮30 g、墨旱蓮15 g、柴胡9 g、黃芪9 g、黨參6 g、三棱3 g、莪術(shù)3 g、當(dāng)歸3 g、白芍9 g、大棗9 g組成，采用江陰天江藥業(yè)有限公司的配方顆粒調(diào)劑而成，將顆粒加蒸餾水配置成含生藥量為1 g/ml的溶液，保存?zhèn)溆?；秋水仙堿（云南號邦制藥有限公司生產(chǎn)，每片0.5 mg，國藥準(zhǔn)字H53021798）；大黃?蟲丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠生產(chǎn)，每丸3 g，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z11021241）。

1.2.2 試劑 四氯化碳（CCl4）、10%水合氯醛、4%多聚甲醛溶液、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、肝素鈉、亞硝酸鈉、免疫組化試劑盒、PI3 Kinase p85一抗（CST）、Antirabbit IgG二抗（CST）、二甲苯、無水乙醇、甲醇、抗體稀釋液、蛋白檢測試劑盒、ECL顯影試劑盒、聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。

1.2.3 儀器 低溫離心機、精密電子天平儀、電熱恒溫干燥箱、電熱恒溫水浴箱、電子天平、微波爐、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、搖床、超低溫冰箱、顯影儀、光學(xué)電子顯微鏡。

2 實驗方法

2.1 分組與造模及取樣方法 經(jīng)適應(yīng)性養(yǎng)殖后，將56只大鼠按隨機法分為7組：正常對照組（A組）、模型對照組（B組）、秋水仙堿對照組（C組）、大黃?蟲丸對照組（D組）、復(fù)方半枝蓮顆粒高劑量組（E組）、復(fù)方半枝蓮顆粒中劑量組（F組）、復(fù)方半枝蓮顆粒低劑量組（G組），每組8只。除正常對照組外，余組采用40%CCl4復(fù)合因素干預(yù)法制備大鼠肝纖維模型［12］：予造模大鼠首次腹腔注射40%CCl4油劑，劑量為5 ml/kg，以后每隔3日腹腔注射1次，劑量不變。與此同時，采用高脂低蛋白食物喂養(yǎng)，除正常對照組正常飲食外，余各組實驗大鼠均予15%的酒精飲料替代飲用水。4 w之后，病理檢查結(jié)果證實肝纖維化模型已經(jīng)建立成功。成模后，正常對照組及模型對照組正常飲食；秋水仙堿對照組灌胃給予秋水仙堿溶液，劑量為0.0025 g/kg；大黃?蟲丸對照組灌胃給予大黃?蟲丸溶液，劑量為0.315 g/kg；復(fù)方半枝蓮顆粒高、中、低劑量組根據(jù)體重分別灌胃給予復(fù)方半枝蓮顆粒溶液，劑量為28 g/kg、14 g/kg、7 g/kg。每天上午空腹灌胃1次，共4周。末次用藥24 h后，根據(jù)大鼠體重按3 ml/kg劑量予10%水合氯醛溶液腹腔注射，麻醉后摘取大鼠肝臟，斷頸處死。

2.2 免疫組化法 將肝組織石蠟切片整個置于二甲苯中脫蠟5 min；依次置于無水酒精、95%酒精、75%酒精中進(jìn)行梯度脫水，各5 min；用PBS沖洗3次，每次3 min；將干組織切片置于沸騰（98～100℃）的0.01M枸櫞酸緩沖液中，冷卻5～10 min，反復(fù)2次；滴加3%去離子水孵育10 min；用PBS沖洗3次，每次3 min；滴加封閉用正常山羊血清，室溫封閉15 min；滴加稀釋后的一抗，4℃環(huán)境下孵育過夜；用PBS沖洗3次，每次3 min；滴加生物素化二抗，37℃環(huán)境下孵育15 min；用PBS沖洗3次，每次3 min；滴加辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，37℃環(huán)境下孵育15 min；用PBS沖洗3次，每次3 min；DAB顯色。

2.3 蛋白免疫印跡法（Western blot） 取綠豆大小的肝臟組織放在1.5 ml EP管中置于冰上，加入RIPA裂解液和PMSF（PMSF∶RIPA=1∶100），進(jìn)行勻漿。將加入裂解液的EP管放入冰盒內(nèi)保存，進(jìn)行超聲。4℃低溫離心，12 000 rpm，10 min。離心結(jié)束后用20μl槍頭小心吸取透明部分上清液（即蛋白）移至新的EP管中并插入冰中等待下一步檢測。采用BCA試劑盒檢測標(biāo)記好的樣本蛋白濃度。蛋白變性：按蛋白檢測結(jié)果計算加入Buffer量，調(diào)整至所需的蛋白濃度，混勻,并將蛋白樣品進(jìn)行金屬浴，98℃，8 min；配制8%的分離膠。電泳：先80 V，30～40 min；再120 V，1 h。轉(zhuǎn)膜：一般300 mA 1 h。室溫封閉1 h。一抗孵育：將膜從封閉液中取出，在標(biāo)記好的孵育盒中加入6 ml的TBST，搖床洗3次，每次10 min。按標(biāo)記順序取出膜加入相對應(yīng)稀釋好的一抗，做好標(biāo)記后4℃孵育過夜。二抗孵育：取出膜，在標(biāo)記好的孵育盒加入6 ml的TBST，搖床洗3次，每次10 min，加入按相應(yīng)比例稀釋好的二抗，室溫，搖床孵育1 h。顯影。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用非配對t檢驗比較各實驗組數(shù)據(jù)，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié) 果

3.1 各組動物的一般情況 經(jīng)病理切片鑒定造模成功后，對各治療組實驗大鼠進(jìn)行為期4 w的相對應(yīng)藥物的灌胃治療，經(jīng)過4 w治療后觀察到，與模型對照組（B組）大鼠的一般狀況相比較，C、D、E、F組大鼠精神萎靡的情況好轉(zhuǎn)較為明顯，活動逐漸活躍，飲食狀況改善，尤其以D組實驗大鼠一般情況改善最明顯。

3.2 免疫組化檢測各組大鼠肝組織中PI3K和Akt蛋白表達(dá)情況 見表1。模型對照組大鼠肝臟組織PI3K、Akt表達(dá)量均顯著高于正常對照組（P＜0.05）；經(jīng)治療后，各治療組大鼠肝臟組織PI3K、Akt表達(dá)量均顯著低于模型對照組（P＜0.05）。

3.3 Western blot法檢測各組大鼠肝組織中PI3K和Akt蛋白表達(dá)情況 見圖1、表2。模型對照組大鼠肝臟組織PI3K、Akt表達(dá)量均顯著高于正常對照組（P＜0.05）；與模型對照組比較，各治療組大鼠肝組織PI3K的蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），除復(fù)方半枝蓮顆粒低劑量組外，其余各治療組的Akt蛋白表達(dá)量也顯著下降（P＜0.05）。

表1 免疫組化檢測各組大鼠肝組織中PI3K及Akt的蛋白表達(dá)結(jié)果 （± s）

表1 免疫組化檢測各組大鼠肝組織中PI3K及Akt的蛋白表達(dá)結(jié)果 （± s）

注：與正常對照組比較，①P＜0.05；與模型對照組比較，②P＜0.05

組 別正常對照組模型對照組秋水仙堿對照組大黃?蟲丸對照組復(fù)方半枝蓮顆粒高劑量組復(fù)方半枝蓮顆粒中劑量組復(fù)方半枝蓮顆粒低劑量組n 8 8 8 8 8 8 8 PI3K 23.42±3.34 71.23±11.13①29.22±4.37②27.82±3.66②11.73±3.61②20.58±2.68②45.18±7.35②Akt 19.50±5.93 57.73±10.03①33.30±5.75②26.27±3.47②12.09±3.51②27.25±5.72②31.00±8.82②

圖1 各組PI3K/Akt蛋白表達(dá)

表2 Western blot檢測各組大鼠肝組織中PI3K及Akt的蛋白表達(dá)結(jié)果 （±s）

表2 Western blot檢測各組大鼠肝組織中PI3K及Akt的蛋白表達(dá)結(jié)果 （±s）

注：與正常對照組比較，①P＜0.05；與模型對照組比較，②P＜0.05

組 別正常對照組模型對照組秋水仙堿對照組大黃?蟲丸對照組復(fù)方半枝蓮顆粒高劑量組復(fù)方半枝蓮顆粒中劑量組復(fù)方半枝蓮顆粒低劑量組n 8 8 8 8 8 8 8 PI3K 0.97±0.44 2.31±0.47①1.77±0.59②1.43±0.49②1.20±0.29②1.66±0.37②1.74±0.26②Akt 1.19±0.22 1.60±0.16①1.50±0.21②1.30±0.25②1.17±0.36②1.38±0.20②1.52±0.31

4 討論

肝纖維化是由于肝臟持續(xù)損傷，肝組織自我修復(fù)時引起的肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的異常合成降解與過度沉積［13］。中醫(yī)文獻(xiàn)中并沒有關(guān)于肝纖維化的相關(guān)記載，根據(jù)其臨床癥狀及表現(xiàn)，肝纖維化屬于中醫(yī)文獻(xiàn)中“積聚”“肝積”“黃疸”“脅痛”“臌脹”等范疇。肝纖維化的中醫(yī)病因病機較為復(fù)雜，多為情志不暢、正氣虛損、感受濕熱毒邪等導(dǎo)致的濕熱內(nèi)蘊、肝失疏泄、氣滯血瘀、肝脾受損、臟腑氣機失調(diào)。復(fù)方半枝蓮顆粒中半枝蓮消炎除積為君藥，墨旱蓮、三棱、莪術(shù)抗炎消腫、活血通絡(luò)、軟堅消癥為臣藥，佐以黃芪補虛扶正，黨參、柴胡疏肝健脾益氣，當(dāng)歸、白芍、大棗養(yǎng)血柔肝，緩和藥性，共奏抗炎消積、軟堅消癥、益氣柔肝之效。

PI3K/Akt信號通路是肝纖維化形成過程中的一條重要信號通路，該通路通過調(diào)控HSCs的活化和凋亡來干預(yù)肝纖維化的進(jìn)程，HSCs的增殖在肝纖維化形成過程中起到了關(guān)鍵作用，治療的關(guān)鍵也是通過抑制HSC的增殖，促進(jìn)其凋亡。從大量文獻(xiàn)［6-11］的實驗結(jié)果可知，PI3K/Akt信號通路參與了肝纖維化的進(jìn)程，參與介導(dǎo)調(diào)控HSCs細(xì)胞的增殖與凋亡。本研究通過復(fù)方半枝蓮顆粒干預(yù)CCl4造模的肝纖維化大鼠，深入研究復(fù)方半枝蓮顆粒對PI3K/Akt信號通路，調(diào)控HSCs活化、凋亡和ECM合成降解的影響。免疫組化檢測結(jié)果顯示，模型對照組PI3K及Akt表達(dá)量一直維持高表達(dá)，而復(fù)方半枝蓮顆粒各劑量組的PI3K及Akt蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)明顯的抑制。Western blot檢測結(jié)果顯示，與模型對照組比較，各治療組的PI3K蛋白表達(dá)量均顯著下降，除復(fù)方半枝蓮顆粒低劑量組的Akt蛋白表達(dá)量下降不明顯外，余治療組的Akt蛋白表達(dá)量也顯著下降。檢測結(jié)果提示，復(fù)方半枝蓮顆粒在作用于PI3K/Akt信號通路時也可能參與抑制了與該通路緊密相關(guān)的HSCs增殖或促進(jìn)了其凋亡，從而抑制了肝纖維化的進(jìn)程。