丁世彬，高麗云，李玉春，卜勇軍，張國富

(1. 新鄉(xiāng)醫(yī)學院，河南新鄉(xiāng) 453003； 2. 河南省分子診斷與檢驗醫(yī)學協同創(chuàng)新中心，新鄉(xiāng) 453003)

大氣細顆粒物2.5(particulate matter 2.5, PM2.5)是指空氣動力學直徑小于2.5 μm的大氣顆粒物，是目前我國空氣污染物的主要組成(霧霾)。由于PM2.5粒徑較小，它可以隨著呼吸過程到達呼吸道細支氣管和肺泡腔并沉積[1]，因此PM2.5對人體健康的危害程度遠大于其他粒徑較大的顆粒物。流行病學和臨床研究證實，大氣顆粒物(particulate matter，PM)污染水平升高與呼吸疾病的入院率及死亡率密切相關[2-4]。動物實驗顯示：急性和亞慢性PM2.5暴露均能導致肺炎癥[5-6]；但慢性PM2.5暴露對動物肺炎癥的影響尚無報道。機體的先天免疫系統(tǒng)包含多種受體，稱為模式識別受體(PRRs)，PRRs能檢測即將發(fā)生的危險(如環(huán)境污染物或內源性有毒物質)，并引發(fā)保護性反應[7]。目前，NLRP3炎性小體是PRRs中研究較多的一種。越來越多的證據顯示，NLRP3炎性小體與許多呼吸系統(tǒng)疾病(如慢性阻塞性肺疾病，呼吸系統(tǒng)炎癥)的發(fā)生關系密切[8-9]，并且PM2.5能激活肺組織NLRP3炎性小體[6]，但NLRP3炎性小體在PM2.5導致肺損傷的機制尚不十分清楚。本研究旨在明確慢性PM2.5暴露對肺炎癥和NLRP3炎性小體活性的影響，為PM2.5暴露所致肺毒性及其可能分子機制提供動物實驗證據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體重23～25 g，來自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK(京) 2015-0012】。小鼠飼養(yǎng)在室溫21～25℃和濕度60%～70%的環(huán)境中，自由攝食普通飼料和飲水。全部動物實驗操作均嚴格遵守新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物倫理管理條例，并經過新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物倫理委員會許可【XXMU-2016-0007】。

1.1.2 試劑與儀器

白細胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18 ELISA試劑盒(eBioscience，美國)，Caspase-1活性檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，中國)，引物合成(上海生工生物技術有限公司，中國)，RNA提取試劑盒和SYBR試劑盒(大連寶生物工程有限公司，中國)，兔單克隆F4/80抗體(Cell Signaling Technology，美國)；石英纖維濾膜(PALL，美國)，低溫離心機(Eppendorf，德國，5424R)，血細胞檢測儀(Rayto，美國)，熒光定量PCR儀(羅氏，Light Cycler 480，瑞士)，全自動酶標儀(Thermo，美國，Enspire)。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5樣品采集及處理

2016年10月至2017年3月間，在新鄉(xiāng)醫(yī)學院7樓樓頂使用大流量PM2.5采樣器(Tisch Environmental，美國，TE-6070C)收集PM2.5，用石英纖維濾膜(20.3×24.5 cm)作為收集介質。每日連續(xù)收集24 h后更換濾膜，并于-20℃保存。將載有PM2.5的濾膜剪碎，于超純水中超聲20 min，真空干燥后稱重，用生理鹽水配成2.25 mg/mL和7.15 mg/mL的PM2.5懸液待用。

1.2.2 動物分組及PM2.5染毒

選取6周齡雄性C57BL/6J小鼠，小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房【SYXK(豫)2014-0005】，適應性喂養(yǎng)一周后將小鼠隨機分為三組(每組10只)：對照組給予生理鹽水，低劑量PM2.5組[2 mg/(kg·bw)]和高劑量PM2.5組[10 mg/(kg·bw)]。小鼠采用氣管滴注的方式染毒，每3 d染毒一次，連續(xù)染毒20次。氣管滴注方法如下：小鼠經乙醚麻醉后，用鑷子將小鼠舌頭拉出暴露口腔和氣管，用氣管滴注套管將50 μL液體滴入氣管。

1.2.3 動物血液和肺組織提取及指標檢測

小鼠染毒結束后，用戊巴比妥(20 mg/kg)麻醉，心臟取血后，脫臼處死，血細胞檢測儀進行血細胞計數。迅速分離肺組織，稱取100 mg肺組織，按1∶9比例加入生理鹽水進行勻漿。將勻漿液6000 r/min離心后取上清液，按照IL-1β和 IL-18的ELISA檢測試劑盒說明書測定肺組織勻漿中IL-1β和IL-18的水平；用試劑盒測定肺組織中caspase-1的活性。

1.2.4 肺組織免疫熒光染色

小鼠處死后，迅速分離右肺組織固定于4%多聚甲醛溶液，經酒精梯度脫水、石蠟包埋后進行F4/80抗體的免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察肺組織F4/80水平。

1.2.5 肺組織RNA提取及NLRP3炎性小體相關基因檢測

向50 mg肺組織中加入0.8 mL TRIzol，并用玻璃勻漿器勻漿后按說明書提取肺組織總RNA。NLRP3炎性小體相關基因的引物設計：NLRP3基因的引物序列為F5′-TGGGTTCTGGTCAGACACGAG-3′， R5′-GGCGGGTAATCTTCCAAATGC-3′; 銜接分子凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)的引物序列為F5′-GGAGTCGTATGGCTTGGAGC-3′，R5′-CGTCCACTT CTGTGACCCTG-3′; Caspase-1的引物序列為F5′-TGCCGTGGAGAGAAACAAGG-3′，R5′-CCCCTGACA GGATGTCTCCA-3′; GAPDH基因的引物序列為F5′-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，R5′-TGCCTG CTTCACCACCTTCT-3′。按照RNA逆轉錄試劑盒說明書，將1 μg總RNA加入20 μL反應體系逆轉錄成cDNA；并依據熒光實時定量PCR試劑盒說明書，將25 μL反應體系(10 ng cDNA，0.5 μmol引物和SYBR Green PCR混合試劑)下完成目的基因的擴增和檢測。將GAPDH基因作為內參基因。目的基因的表達用2-△△CT法進行計算。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 PM2.5暴露對小鼠血細胞的影響

由表1可見，低劑量PM2.5組和高劑量PM2.5組小鼠的血中性粒細胞百分比明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)；并且兩組小鼠的血單核細胞百分比明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)。但三組小鼠的血白細胞總數和淋巴細胞百分比無明顯差異(P> 0.05)。

2.2 PM2.5暴露對小鼠肺組織巨噬細胞表達的影響

由圖1的肺組織F4/80免疫熒光染色可見，與對照組小鼠相比，低劑量PM2.5組和高劑量PM2.5組小鼠肺組織F4/80表達明顯增多，這些結果表明低劑量PM2.5暴露和高劑量PM2.5暴露能明顯增加小鼠肺組織的巨噬細胞浸潤。

表1 慢性PM2.5染毒對小鼠血細胞的影響Table 1 Effect of PM2.5 exposure on blood cells in the s，n =8)

注：與對照組比較，*P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.01.

圖1 三組小鼠肺組織F4/80表達情況(免疫熒光染色，×400)Figure 1 Expression of F4/80 in the mouse lung tissues of three groups(Immunofluorescence staining，×400)

2.3 PM2.5暴露對小鼠肺組織IL-1β和IL-18表達水平及caspase-1活性的影響

由圖2可見，與對照組相比較，低劑量PM2.5組和高劑量PM2.5組小鼠的肺組織IL-1β和IL-18表達水平及caspase-1活性均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)；然而，低劑量PM2.5組和高劑量PM2.5組小鼠的肺組織IL-1β和IL-18表達水平及caspase-1活性差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。

2.4 PM2.5暴露對小鼠肺組織NLRP3炎性小體相關基因表達的影響

由圖3可見，與對照組相比較，低劑量PM2.5組和高劑量PM2.5組小鼠的肺組織NLRP3和ASC的mRNA表達水平均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)。但三組小鼠的肺組織caspase-1的mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。

注：A. IL-1β水平；B. IL-18水平；C. Caspase-1活性；與對照組比較，*P<0.01。圖2 PM2.5暴露對小鼠肺組織IL-1β和IL-18表達水平及caspase-1活性的影響Note. A. IL-1β. B. IL-18. C. Caspase-1 activity. Compared with the control group,*P<0.01.Figure 2 Effects of PM2.5 exposure on IL-1β, IL-18 expression and caspase-1 activity in the mouse lung tissues

注：A. 肺NLRP3 mRNA水平；B. 肺ASC mRNA水平；C. 肺Caspase-1 mRNA水平；與對照組比較，*P<0.01。圖3 PM2.5暴露對小鼠肺組織NLRP3炎性小體相關基因 mRNA表達的影響Note. A. NLRP3 mRNA. B. ASC mRNA. C. Caspase-1 mRNA. Compared with the control group，*P<0.01.Figure 3 Effects of PM2.5 exposure on the mRNA expression of NLRP3 inflammasome-related genes in the mouse lung tissues

3 討論

近年來，由于工業(yè)生產，化石燃料的燃燒及汽車尾氣的排放等造成我國中北部平原，長江三角洲和珠江三角洲地區(qū)經常頻繁遭受空氣污染(尤其是霧霾)的困擾[10]。PM2.5是霧霾的主要組成，由于其粒徑較小，并且能在空氣中懸浮較長時間，因此PM2.5暴露對肺等靶器官的影響受到越來越多研究者的關注。之前的研究已經證明，炎癥在PM暴露導致的人和動物的肺部疾病發(fā)生、發(fā)展的全過程都發(fā)揮至關重要作用[11-12]。許多動物實驗研究都關注急性PM2.5暴露對肺的影響，并發(fā)現急性PM2.5暴露能導致動物的肺損傷發(fā)生[13-15]。本實驗主要研究慢性低劑量PM2.5暴露對肺炎癥和NLRP3炎性小體活性的影響，并分析慢性PM2.5暴露造成肺損傷的可能機制。

本實驗根據小鼠的生理參數和世界衛(wèi)生組織(WHO)的第一個過渡階段標準(24 h平均PM2.5濃度為75 μg/m3)將10 mg/(kg·bw)的PM2.5暴露劑量作為高劑量[16]，將2 mg/(kg·bw)的PM2.5劑量作為低劑量開展暴露研究。肺泡巨噬細胞是肺組織的第一道免疫屏障，其可對進入肺內的細菌、多種顆粒物(例如PM2.5)等異物進行吞噬。本實驗我們通過對小鼠肺組織F4/80免疫熒光染色發(fā)現，慢性PM2.5暴露能導致肺組織巨噬細胞增多，這表明慢性PM2.5暴露導致小鼠肺組織發(fā)生了廣泛的炎癥。NLRP3炎性小體是先天免疫系統(tǒng)中的細胞內多蛋白細胞質復合物組成的NOD樣受體，它由NLRP3蛋白、銜接分子凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和絲氨酸蛋白酶caspase-1組成[17-18]。NLRP3炎性體控制IL-18的分泌及IL-1β的成熟和分泌[18-19]；而促炎細胞因子IL-1β募集巨噬細胞，中性粒細胞和肥大細胞以引發(fā)炎癥反應[20]。據報道，PM2.5可激活人單核細胞白血病細胞(THP-1)中的NLRP3并誘導BALB/c小鼠的肺纖維化[6]。此外，急性5 mg/(kg·bw)劑量的PM2.5暴露能增加NLRP3表達，并導致了肺炎癥；而0.5 mg/(kg·bw)和2.0 mg/(kg·bw)兩個劑量的PM2.5急性暴露未能影響NLRP3表達，不會導致肺炎癥[21]。我們還發(fā)現：兩個劑量的PM2.5慢性暴露均能顯著增加肺組織NLRP3和ASC的mRNA表達和caspase-1的活性，這表明慢性低劑量PM2.5暴露也能激活肺組織NLRP3炎性小體。研究報道，PM2.5[5、10、15 mg/(kg·bw)]暴露3 d能導致大鼠肺巨噬細胞caspase-1表達增加[21]，但本研究中只觀察到caspase-1的活性增加，沒有觀察到肺組織中caspase-1表達增加，這表明慢性低劑量PM2.5可能通過調節(jié)caspase-1活性參與NLRP3炎性小體的活性上調。促炎細胞因子IL-1β是肺中炎性細胞因子IL-1家族的重要成員，它是介導炎癥的關鍵因子；IL-18可與IL-12協同作用，通過激活T細胞和NK細胞誘導干擾素-γ的產生[7]。Wang等[22]的研究發(fā)現，PM2.5急性暴露能導致BALB/c小鼠急性肺炎癥，增加肺泡灌洗液和肺組織IL-1β表達水平。與之前的研究一致，我們觀察到慢性低劑量PM2.5暴露能增加肺組織的IL-1β和IL-18的蛋白表達水平。以上結果表明：PM2.5可能激活肺組織NLRP3炎性小體，并增加IL-1β和IL-18分泌；即使低劑量的PM2.5長期暴露也會造成肺組織的炎癥損傷。據報道，急性PM2.5暴露能升高中性粒細胞百分比，降低單核細胞百分比和淋巴細胞百分比[23]。與之前的結果一致，本研究發(fā)現：慢性PM2.5[2，10 mg/(kg·bw)]暴露能導致白細胞分類中中性粒細胞百分比升高，單核細胞百分比降低。以上研究結果表明：慢性PM2.5暴露有可能導致系統(tǒng)炎癥發(fā)生。

綜上所述，慢性PM2.5暴露可能通過激活肺組織NLRP3炎性小體進而導致肺組織炎癥發(fā)生，這提示抑制NLRP3炎性小體的活性及其調控可能成為防治PM2.5所致呼吸系統(tǒng)疾病的新靶點。