李彥霖，譚思然，何麗雯，曹科，張倩，譚冬梅，譚毅

(重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，重慶 400016)

音樂構成要素復雜，不同頻率音樂刺激對動物將會產(chǎn)生不同的生物效應[5]。音樂頻率對人體自主神經(jīng)系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用，研究表明高頻段音樂和低頻段音樂相比，高頻段音樂緩解女大學生焦慮的效果更好[6]。不同頻率的音樂對動物影響也存在差異，高頻音樂能提高斷奶仔豬的日增重量及飼料轉(zhuǎn)化率，低頻音樂次之，中頻音樂不明顯[5]。頻率這一物理特性對于音樂刺激的效果存在進一步的研究價值。目前關于不同頻率音樂對小鼠抑郁模型行為學影響的研究基本處于空白。本研究選取莫扎特K448奏鳴曲進行音頻處理，過濾保留高頻段部分，初步探究其改善小鼠抑郁癥狀的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體重20～25 g，來源并飼養(yǎng)觀察于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證和使用許可證分別是【SCXK(渝)2017-0001】、【SYXK(渝)2017-0023】。實驗方案已獲得重慶醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會審批通過。

1.1.2 實驗儀器及試劑

山水(SANSUI)A38S迷你插卡小音箱(山水電子有限公司)、小鼠自主活動測試儀(成都泰盟科技有限公司)、泰仕聲量計(臺灣泰仕電子工業(yè)股份有限公司)、微量離心機(Thermo Scientific，美國)、酶標儀(Thermo Scientific，美國)、HDR-XR150E數(shù)碼相機(Sony，日本)、Adobe Audition CC 2014、SMART3.0視頻行為學分析軟件。鹽酸氟西汀(大連美侖生物制藥有限公司，CAS號：56296-78-7)、小鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 音樂選取

將莫扎特K448奏鳴曲進行音頻處理，按照美國音樂期刊The Absolute Sound與 Stereophile所確立的標準過濾為高頻段。音頻處理軟件為Adobe Audition CC 2014，處理方式為頻段分離。頻譜分析如圖1。

3.評價指標權重和分值?？荚u內(nèi)容比較全面準確地反映出一個工程科技人員的能力和業(yè)績現(xiàn)狀，較好地體現(xiàn)了國家和中國石化有關工程技術職務條例和對晉升各級職務的要求。根據(jù)多年職稱評審工作實踐總結，結合工程技術職務自身特點，筆者認為，按照5∶5的比例確定定性和定量部分所占比重較為合理，按總分數(shù)由高到低依次排列參評人員順序。具體分值和權重情況如表1所示。

注：A，正常音樂頻譜；B，過濾之后保留的高頻段音樂頻譜(6000 Hz以上)。圖1 音樂的頻譜分析Note. A. Frequency spectrum of the normal music. B. High-frequent spectrum of the music (above 6000 Hz).Figure 1 Frequency spectrum analysis of the music

1.2.2 小鼠造模方法

C57BL/6小鼠于實驗前適應性飼養(yǎng)3 d，采用自主活動測試進行初步篩選，將后3 min內(nèi)水平活動大于120次或小于30次的予以剔除。符合要求的小鼠共分為兩組，空白組和實驗組，其中空白組10只，模型組36只。實驗采用慢性輕度應激建立模型[7-9]，為避免小鼠對單一或有規(guī)律的應激刺激產(chǎn)生耐受性，本實驗采取多種不可預知的刺激方式交替進行。刺激方式結合參考文獻及具體實驗條件確定，包括束縛(4 h)、禁食(24 h)、禁水(16 h)、晝夜顛倒、噪聲刺激(1 h)、夾尾(5 min)、濕墊料(24 h)、熱水游泳(5 min)、冷水游泳(5 min)、鼠籠傾斜(24 h)10種。除空白組外，其余小鼠每天隨機安排三種應激刺激，并持續(xù)5周。在此期間，保持每種刺激在各組內(nèi)最少出現(xiàn)8次。

1.2.3 干預措施

造模成功后，模型組隨機均衡分為模型對照組、氟西汀組和音樂組，每組12只?？瞻捉M：保持安靜的生活環(huán)境，充足的飲食飲水，正常的晝夜節(jié)律。模型對照組：繼續(xù)每天8：00時開始給予慢性溫和不可預知刺激，共2周，同時每天腹腔注射生理鹽水。氟西汀組：每天腹腔注射鹽酸氟西汀溶液(10 mg/kg)，同時繼續(xù)慢性溫和不可預知刺激。音樂組：每天15：00～17：00時在籠盒中播放調(diào)制好的莫扎特K448高頻段聲波，音量保持在60～70 dB(2 h/d)，同時繼續(xù)慢性溫和不可預知刺激并注射生理鹽水。

1.2.4 體重及行為學實驗

(1)體重：實驗前3 d及實驗中每周(共7周)稱量體重并記錄。稱重在17：00～19：00時進行。

(2)自主活動測試：自主活動測試主要用于正式實驗前的動物篩選。測試環(huán)境為分離反應箱，配有相應的微電腦控制系統(tǒng)，每次可測試6只小鼠，測試時間為5 min，統(tǒng)計后3 min中的活動以及站立次數(shù)。每次測試完畢后，用75%乙醇充分清潔黑箱，避免氣味產(chǎn)生干擾。

(3)懸尾實驗(tail suspension test，TST)：懸尾實驗能反映動物的“失望”情緒及 “抑郁”狀態(tài)，用于觀察小鼠為克服不正常體位而進行掙扎的體力及心理疲勞程度，是較為經(jīng)典的反映小鼠心理抑郁程度的行為學評定方法。實驗在暗光、無噪聲的環(huán)境下進行，將小鼠的尾端用膠帶固定懸掛，小鼠尾尖距地面30 cm左右。每只小鼠單獨接受懸尾實驗，以防相互干擾。實驗持續(xù)6 min，用數(shù)碼相機記錄實驗過程，使用SMART 3.0 視頻行為學分析軟件統(tǒng)計后4 min內(nèi)小鼠不動總時間。懸尾實驗在第1周(造模開始前)、第5周末(即造模成功后)和第7周末(即音樂組干預完成后)進行。

(4)強迫游泳實驗(forced swimming test，F(xiàn)ST)：強迫游泳實驗為小鼠提供了一個不可回避的環(huán)境，讓它們處于壓迫狀態(tài)，一段時間后，小鼠表現(xiàn)出“行為絕望狀態(tài)”。每只小鼠在實驗前24 h進行15 min的適應性游泳。泳桶高30 cm，直徑15 cm，內(nèi)裝20 cm高的清水，水溫保持在25℃左右。左手托住小鼠，右手輕輕將其放入水面。實驗持續(xù)5 min，用數(shù)碼相機記錄實驗過程，使用SMART 3.0視頻行為學分析軟件統(tǒng)計后4 min內(nèi)小鼠不動總時間。強迫游泳實驗在第1周(造模開始前)、第5周末(即造模成功后)和第7周末(即音樂組干預完成后)進行。

1.2.5 小鼠腦組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)含量測定

第7周末行為學實驗結束后，迅速將各組小鼠頸椎脫臼處死。在冰袋上剪開頭皮，打開顱腔取出腦組織，剔除小腦后稱重，用冰冷的生理鹽水沖洗并用濾紙吸干，放入冰下的勻漿管中。按照1∶9的比例加入冰冷的生理鹽水，充分研磨，形成10%的組織勻漿液。將制備好的組織液放入4℃離心機中以2500 r/min離心10 min，取上清液，放入-80℃冰箱待用。采用ELISA法進行BDNF測定，嚴格按照試劑盒中說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 實驗小鼠的體重變化趨勢

重復測量方差結果顯示(圖2)，處理效應與時間的交互作用有統(tǒng)計學意義(F=23.695，P< 0.01)。處理主效應有統(tǒng)計學意義(F=5.674，P< 0.01)，各組小鼠體重變化不完全相同。造模前3 d，各組小鼠體重基本一致，差異無顯著性(P> 0.05)，基線具有可比性。造模第1周，接受了慢性溫和不可預知刺激的模型組小鼠，體重基本沒變，隨后有一定程度的增加，但在造模4周末，模型組小鼠體重明顯低于空白組(P< 0.05)，在第5周，模型組的體重出現(xiàn)明顯增加。治療的第2周(即實驗第7周)，與模型對照組相比，氟西汀組和音樂組的體重有一定程度的增加。

圖2 各組小鼠在造模和治療過程中的體重變化Figure 2 Body weight of the mice at baseline and 7 week later

圖3 抑郁造模的行為學評價Figure 3 Behavioral evaluation of the CUMS mouse models

2.2 慢性溫和不可預知刺激(chronic unpredictable and mild stress, CUMS)模型評價

如圖3所示，應激后小鼠表現(xiàn)為活動遲鈍，興趣喪失和快感缺乏。方差分析表明，第5周后模型組的行為學實驗結果與空白組相比存在顯著差異，提示造模成功。模型組和空白組的懸尾實驗的不動時間分別是(147.28 ± 24.29)s、(124.37 ± 13.03)s，不動時間顯著延長(P< 0.01)。模型組和空白組的強迫游泳實驗的不動時間分別是(161.47 ± 18.40)s、(143.89 ± 19.95)s，不動時間也顯著延長(P< 0.05)。

2.3 各組干預效果

如圖4所示，模型對照組第7周的懸尾不動時間和強迫游泳不動時間，較第5周均無明顯差異(P> 0.05)，提示慢性溫和不可預知刺激保持了小鼠的抑郁狀態(tài)。第7周與第5周相比，氟西汀組懸尾不動時間降低，差異具有顯著性(P< 0.01)，強迫游泳不動時間降低，但差異不具有顯著性(P> 0.05)；音樂干預組懸尾不動時間降低，差異具有顯著性(P< 0.05)，強迫游泳不動時間無明顯變化。

圖4 音樂干預效果的行為學評價Figure 4 Behavioral evaluation of the music intervention

2.4 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)含量測定結果

行為學實驗結束后，通過ELISA法檢測各組小鼠腦組織中的BDNF的含量，BDNF標準品回歸方程y=0.0011x + 0.1035，線性范圍31.25～500 pg/mL, 相關系數(shù)r2=0.9449。結果發(fā)現(xiàn)(表1)，模型對照組與空白組小鼠相比，腦組織勻漿中的BDNF含量降低，差異具有極顯著性(P< 0.01)；氟西汀組較模型對照組，BDNF含量極明顯回升(P< 0.01)，較空白組無差異(P> 0.05);音樂組的BDNF含量較模型對照組有增加，但其差異無顯著性。

表1 各組腦組織勻漿BDNF含量檢測結果與比較Table 1 Comparison of the BDNF content in brain tissue of

注：**P< 0.01，與空白組相比。##P< 0.01，與模型對照組相比。

Note.**P<0.01vs. the blank group.##P< 0.01vs. the control group.

3 討論

抑郁癥是一種以情緒低落為主要特征的精神障礙，涉及到多種病理生理過程。由于其復雜性，病因機制尚未明確。目前研究中抑郁癥的動物模型主要分為藥物誘發(fā)模型、孤養(yǎng)模型、轉(zhuǎn)基因模型和CUMS模型等。1981年，Katz等[10-11]模擬抑郁癥誘因首次建立了CUMS模型，即將動物長時間置于一系列慢性溫和不可預知刺激中，從而模擬人類在長期生活中遭受的慢性低強度刺激，刺激的多樣性和不可預知性是造模成功的關鍵。相比于其他模型，CUMS模型的性狀可以更加接近人類抑郁癥，故被廣泛應用于抑郁癥研究中[12]。然而，目前對刺激類型、方式、強度、持續(xù)時間及造模周期，并沒有一個統(tǒng)一的標準，且在CUMS造模過程中，需要各種不同的應激方式不定時地對小鼠進行刺激，不僅過程繁瑣，周期過長，耗時費力，還可能存在動物抑郁表現(xiàn)不穩(wěn)定的情況。因此，在模型的建立和應用過程中，對模型進行評價顯得至關重要。

音樂是一種不僅限于藝術欣賞和審美領域的藝術形式，經(jīng)過多年發(fā)展，已經(jīng)逐步滲透到醫(yī)療、心理等領域，音樂治療也成為了一門獨立學科[13]。國內(nèi)外已有很多音樂治療的研究，在音樂選取上，多為莫扎特K448奏鳴曲或莫扎特鋼琴曲[14]。研究表明，成年小鼠在接受連續(xù)30 d的莫扎特K448奏鳴曲刺激后，海馬、大腦皮質(zhì)基因表達受到顯著影響[15]。出生后的早期音樂刺激，可增強大鼠NMDA受體介導的神經(jīng)可塑性，使其在聽覺分辨學習任務中聽覺能力增強[16]。音樂的元素多種多樣，頻率作為其中一種重要的組成因素，目前已成為研究音樂治療的一個部分。但現(xiàn)有的研究大都體現(xiàn)不同曲目的不同頻率的差異，混雜因素較多。本研究在前期研究的基礎上[17-18]，通過頻段過濾，去除了節(jié)奏、音色等因素的影響，并結合嚙齒類動物200～ 90 000 Hz的聲頻范圍[19]，選擇莫扎特K448奏鳴曲中的高頻段聲波干預抑郁小鼠，初步探究其改善小鼠抑郁癥狀的效果。

已有動物實驗證明，嚙齒類動物在遭受長期應激后，會出現(xiàn)體重降低的現(xiàn)象。本實驗中也發(fā)現(xiàn)，接受慢性應激的模型組小鼠較空白組的體重增長明顯變緩。但在造模的第4、5周，模型組小鼠出現(xiàn)體重增長明顯加快的短暫時期，這可能與小鼠對應激刺激的暫時適應有關，這也與我們觀察到的，在造模第4周小鼠抑郁狀態(tài)出現(xiàn)短暫的恢復相一致。因此我們在第5周末對小鼠的抑郁狀態(tài)進行了行為學評價，并給予了不同的干預。經(jīng)過氟西汀和音樂干預2周后，此兩組小鼠的體重較模型對照組出現(xiàn)上升趨勢，提示藥物和音樂改善了小鼠的抑郁狀態(tài)。

目前，行為學評價是判定抑郁癥模型的主要標準[20]。常見的行為學實驗有糖水消耗與偏好實驗、曠場實驗、高架迷宮實驗、水迷宮實驗、懸尾實驗和強迫游泳實驗。其中曠場實驗和高架迷宮實驗主要用于評價動物的焦慮狀態(tài)，水迷宮實驗主要用于評價空間學習記憶能力。糖水消耗與偏好實驗、懸尾實驗和強迫游泳實驗通過表面效度(抑郁樣表型改變)評價抑郁模型。本次實驗中選取懸尾實驗和強迫游泳實驗對造模是否成功及干預是否有效進行評價，接受慢性溫和不可預知刺激的模型組小鼠與空白組相比，懸尾不動時間及強迫游泳不動時間顯著延長，證實了慢性溫和不可預知刺激造模的有效性。與第5周(即造模成功后)相比，第7周(即干預結束后)氟西汀組懸尾實驗及強迫游泳實驗不動時間均減少，證實了藥物治療的有效性，而音樂組懸尾實驗不動時間減少，說明音樂在一定程度上具有緩解抑郁作用，但強迫游泳實驗不動時間變化不明顯，可能與強迫游泳實驗反映抑郁的敏感性或者樣本數(shù)量有關。

BDNF與神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)素來源于同一基因家族[21]。作為一種最為常見的神經(jīng)營養(yǎng)因子，BDNF在神經(jīng)細胞的生長發(fā)育、損傷修復中發(fā)揮重要角色。另外，BDNF和5-羥色胺能神經(jīng)元之間可互相調(diào)節(jié)達成動態(tài)平衡。研究表明BDNF可通過5-羥色胺能神經(jīng)系統(tǒng)與抑郁相關[22]。BDNF免疫陽性神經(jīng)元廣泛分布在腦內(nèi)，包括大腦皮層、海馬齒狀回、黑質(zhì)紋狀體、下丘腦、小腦、中腦頂蓋區(qū)、腦干等，其中以海馬齒狀回和皮層的含量為最高。抑郁癥患者通常會出現(xiàn)海馬體積縮小，BDNF含量降低[23]。實驗室動物模型表明海馬神經(jīng)的減少和抑郁行為之間存在關聯(lián)[24]。本研究模型對照組腦組織BDNF含量明顯低于空白組，可進一步說明CUMS造模有效。氟西汀組含量明顯高于模型對照組，可反映藥物治療的有效性。但音樂組腦組織BDNF含量雖高于模型對照組，但差異并無顯著，可能與音樂干預起效較慢、治療時間不夠長，樣本數(shù)量較少和個體差異等有關，還可能是單純的音樂干預無法達到預期效果，需要與藥物配合才能更好地發(fā)揮作用，此需要進一步的研究。

綜上所述，本研究成功構建了CUMS抑郁小鼠模型，發(fā)現(xiàn)莫扎特K448奏鳴曲的高頻段聲波對改善抑郁模型小鼠行為學有積極效應，為優(yōu)化抑郁癥的治療方法提供了線索，同時也為音樂在動物福利中的應用提供了思路。