趙晨，趙嬌，趙曉波，白燕，金潤銘

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院兒科，武漢 430022)

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。是環(huán)境因素作用于遺傳易感個(gè)體，在炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子炎癥介質(zhì)的相互作用下所導(dǎo)致的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。大量研究表明哮喘的炎癥反應(yīng)與氣道一系列炎癥細(xì)胞浸潤有關(guān)，而這些炎癥細(xì)胞在很大程度上受Th2型淋巴細(xì)胞活化的驅(qū)動(dòng)。有研究表明在支氣管哮喘病人的呼吸道中，Th1和Th2細(xì)胞比例是失衡[2]。Th2主要分泌的IL-4、IL-5細(xì)胞因子，IL-4對于IgE的產(chǎn)生發(fā)揮重要作用。Th1細(xì)胞分泌IFN-γ抑制嗜堿性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的增殖和分化。

另外，研究顯示氧化應(yīng)激在哮喘的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[3-5]，如氣道“自由基損傷”、“氧化/抗氧化失衡”學(xué)說。過度的活性氧自由基/活性氮自由基的產(chǎn)生會(huì)造成氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道微血管高通透性和氣道黏液高分泌，以及組織損傷和形態(tài)的改變[6]。減輕氧化應(yīng)激或增加抗氧化能夠減輕氣道嗜酸粒細(xì)胞浸潤，減少黏液分泌，從而緩解支氣管哮喘[7-8]。

復(fù)方太子參止咳益氣散(TZY)能夠緩解支氣管哮喘[9]，其是否是通過抗炎和抗氧化機(jī)制來改善支氣管哮喘癥狀尚不為人所知。本文通過給予支氣管哮喘動(dòng)物模型不同劑量的TZY，探討其緩解癥狀的機(jī)制，為TZY在臨床的使用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡雄性SD大鼠70只，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司【SCXK(遼)2015-0001】，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級環(huán)境【SYXK (鄂) 2015-0035】，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理編號為安評中心動(dòng)(福)第HK2018001號。

1.1.2 試劑與儀器

卵白蛋白(OVA，美國Sigma公司)；普米克令舒(批號：1010429850，規(guī)格： 2 mL:1 mg, AstraZeneca Pty公司)；TZY(批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字B20170004，武漢貝參藥業(yè)股份有限公司)。致敏液配制：將OVA溶于新鮮配制的10% Al(OH)3溶液中，充分?jǐn)嚢杌靹?，使OVA的終濃度為0.2%。注意混懸液制備后為保證致敏效果應(yīng)于1 h內(nèi)使用。霧化液配制：將OVA與0.9% NaCl溶液攪拌使其混合均勻，使OVA的終濃度為1%。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將SD雄性大鼠隨機(jī)分為7組，分別為對照組，哮喘模型(OVA誘導(dǎo))組，低劑量TZY灌胃+哮喘模型組，中劑量TZY灌胃+哮喘模型組，高劑量TZY灌胃+哮喘模型組，普米克令舒霧化+哮喘模型組，普米克令舒霧化+TZY灌胃+哮喘模型組。

1.2.2 哮喘模型的建立

通過卵白蛋白(OAV)致敏并激發(fā)建立哮喘模型。致敏：第1和8天采用傳統(tǒng)的十點(diǎn)致敏法[10]，包括兩前后足趾4點(diǎn)，兩側(cè)腹股溝2點(diǎn)，頸部1點(diǎn)，背部左、中、右3 點(diǎn)，每點(diǎn)皮下注射0.05 mL OVA 凝膠，另腹腔注射0.5 mL OVA凝膠，OVA 致敏總體積為1 mL/只。激發(fā)：第14天至第21天，將大鼠置于密閉容器中并以1%OVA溶液霧化30 min/d。(對照組給予生理鹽水做對照，其余各組制備哮喘模型)。

1.2.3 各組給藥方式

各組均在激發(fā)前1～2 h進(jìn)行干預(yù)。TZY：小劑量1.25 g/kg，中劑量為2.5 g/kg，大劑量為5 g/kg。用生理鹽水配置成2～3 mL，每天一次灌胃。普米克令舒組給予普米克令舒霧化，1 mg/只，每天一次。對照組給予生理鹽水，每天一次。所有干預(yù)均于激發(fā)前30 min完成。

1.2.4 標(biāo)本的獲取

將大鼠進(jìn)行頸椎脫臼處死。用0.5 mL鹽水灌洗大鼠支氣管肺泡4次，肺泡灌洗液(BALF)1200 r/min離心5 min，4℃，上清液保存在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 病理學(xué)觀察

取大鼠近肺門處的左肺組織，在4%的多聚甲醛中進(jìn)行固定約4～6 h，進(jìn)行常規(guī)的石臘包埋及切片，以行染色檢測。將制備好的切片常規(guī)固定、脫水，以進(jìn)行HE染色，用來觀察氣道的病理學(xué)改變。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)

收集大鼠主動(dòng)脈外周血, 制備單個(gè)核細(xì)胞懸液后，加入流式抗體，Th1細(xì)胞用CD4/IFN-γ標(biāo)記，Th2細(xì)胞用CD4/IL-4標(biāo)記。CD4抗體帶有APC標(biāo)記(APC Mouse anti-rat CD4，貨號17-0040-82，Invitrogen廠家提供)，IFN-γ抗體帶有FITC標(biāo)記(FITC Mouse anti-rat IFN-γ，貨號559498，BD廠家提供)，IL-4抗體帶有PI(PE)標(biāo)記(PE Mouse anti-rat IL-4，貨號555082，BD廠家提供)。充分混勻后室溫避光孵育30 min，上機(jī)檢測大鼠外周血中淋巴細(xì)胞的百分率。

1.2.7 生化檢測

試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，購得GSH試劑盒(貨號A006-2)、T-AOC試劑盒(貨號A015-2)、MDA試劑盒(貨號A003-1)、SOD試劑盒(貨號A001-3)，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GSH、T-AOC、MDA、SOD的濃度。

1.2.8 ELISA檢測

將獲取的每組大鼠BALF使用IL-4、IL-5、IgE、IFN-γ ELISA試劑盒(R&D Systems)來測定各組細(xì)胞因子的濃度，按照說明書進(jìn)行操作。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞因子的蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 病理觀察結(jié)果

病理切片經(jīng)HE染色后，對照組可觀察到肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔內(nèi)無滲出液，間隔無增寬，肺泡上皮細(xì)胞排列有序，肺泡壁厚度正常，無炎性細(xì)胞浸潤。哮喘模型組光鏡下可觀察到肺泡壁結(jié)構(gòu)受損，肺泡壁增厚，支氣管腔狹窄，大量黏膜上皮細(xì)胞脫落，支氣管與血管周邊疏松水腫及纖維化形成，支氣管上皮杯狀細(xì)胞化生，支氣管與血管周圍重度炎性細(xì)胞浸潤，可見增生的淋巴濾泡。TZY中劑量組可見肺泡腔較模型組變大，支氣管腔未見脫落的上皮細(xì)胞，支氣管壁水腫程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤程度明顯降低，可見部分增生的淋巴濾泡，腔內(nèi)出血，較多滲出物紅染。TZY高劑量組可見部分肺泡壁增厚，支氣管腔狹窄程度有所減輕，部分支氣管與血管周邊疏松水腫及纖維化形成，炎性細(xì)胞浸潤區(qū)域明顯減少。TZY和普米克令舒聯(lián)用組可見支氣管管腔未見明顯狹窄，肺泡間隔較薄，肺泡腔變大，肺泡區(qū)炎性細(xì)胞浸潤明顯減少(圖1)。

2.2 Th淋巴細(xì)胞的比例比較

由圖2、圖3可知，通過對不同組別的分析，我們發(fā)現(xiàn)給予哮喘大鼠TZY中劑量組和高劑量組灌胃，均可以明顯提高外周血Th1細(xì)胞比例，降低Th2細(xì)胞比例(P<0.05)，其中TZY中、高劑量組與普米克令舒霧化組相比較，Th1/Th2細(xì)胞比例上調(diào)，兩組無顯著差異(P>0.05)。聯(lián)用普米克令舒霧化和TZY灌胃，Th1細(xì)胞上升，Th2細(xì)胞下降，Th1/Th2細(xì)胞比例上調(diào)作用與單用低劑量TZY灌胃或單用普米克令舒霧化相比，都更為顯著(P<0.05)，說明TZY和普米克令舒霧化有疊加作用。

2.3 細(xì)胞因子水平的變化

與對照組相比，哮喘組BALF IL-4、IL-5、IgE水平明顯增加(P< 0.05)；與哮喘組比較，中藥組BALF IL-4、IL-5、IgE的蛋白水平顯著降低(P< 0.05)，且隨著中藥濃度的增加，其蛋白水平降低更顯著。普米克令舒組和高劑量中藥組BALF IL-4、IL-5、IgE的蛋白水平無顯著差異。

與對照組相比，哮喘組BALF IFN-γ水平明顯減少 (P< 0.05)；與哮喘組相比，中藥組BALF IFN-γ水平顯著增加 (P< 0.05)，且隨著中藥濃度的增加，其蛋白水平上升幅度更顯著。普米克令舒組和高劑量中藥組BALF IFN-γ的蛋白水平無顯著差異。(圖4)

注：A.對照組；B.哮喘組；C.TZY低劑量組；D.TZY中劑量組；E.TZY高劑量組；F.普米克令舒組；G.普米克令舒+TZY組。(下圖同)圖1 TZY對哮喘大鼠支氣管肺組織病理的影響 (×200)Note. (A) control group (B) asthma group (C) low dose group of TZY (D) medium dose group of TZY (E)high dose group of TZY (F) Pulmicort respules group (G) group of Pulmicort respules and TZY. (The same in the following figures)Figure 1 Effect of TZY on bronchial histopathology in the asthmatic rats (×200)

注：與對照組相比差異有顯著性，*P<0.05；與哮喘組相比差異有顯著性，#P<0.05；與普米克令舒組相比差異有顯著性，&P<0.05。圖3 TZY對CD4+ IL-4+細(xì)胞水平的影響Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the asthma group,#P<0.05. Compared with the Pulmicort respules group,&P<0.05.Figure 3 Effect of the drugs on CD4+IL-4+ cells

注：與對照組相比差異有顯著性，*P<0.05；與哮喘組相比差異有顯著性，#P<0.05；與普米克令舒組相比差異有顯著性，&P<0.05。圖4 TZY對細(xì)胞因子表達(dá)的影響Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the asthma group,#P<0.05. Compared with the Pulmicort respules group,&P<0.05.Figure 4 Effect of TZY on the expression of inflammatory cytokines

2.4 氧化應(yīng)激水平

相對于對照組，哮喘組GSH、T-AOC、SOD含量顯著降低(P<0.05)；相對哮喘組，中劑量TZY、高劑量TZYGSH、T-AOC、SOD含量顯著增加(P<0.05)。高劑量組和普米克令舒組之間GSH、T-AOC、SOD含量無顯著性差異(P<0.05)。

相對于對照組，哮喘組MDA含量顯著增加(P<0.05)；相對于哮喘組，中劑量TZY、高劑量TZYMDA顯著減少(P<0.05)。高劑量組和普米克令舒組之間MDA含量無顯著性差異(P<0.05)。(圖5)

注：與對照組相比差異有顯著性，*P<0.05；與哮喘組相比差異有顯著性，#P<0.05；與普米克令舒組相比差異有顯著性，&P<0.05。圖5 TZY對氧化應(yīng)激相關(guān)因子水平的影響Note. Compared with the control group,*P<0.05. Compared with the asthma group,#P<0.05. Compared with the Pulmicort respules group,&P<0.05.Figure 5 Effect of TZY on the levels of oxidative stress related factors

3 討論

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病[1]，是兒童常見的喘息性疾病之一。由于兒童氣道解剖結(jié)構(gòu)、生理及免疫的特殊性，支氣管哮喘在兒童中發(fā)生率較高。研究表明，約34%的兒童在3周歲之前出現(xiàn)過至少1次喘息，將近一半的兒童在6歲前會(huì)出現(xiàn)喘息[11]。支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制主要包括氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、支氣管痙攣和氣道重塑幾個(gè)方面。治療支氣管哮喘常用藥物包括糖皮質(zhì)激素、白三烯調(diào)節(jié)劑、支氣管舒張劑、抗組胺藥物等[12]。其中，吸入性糖皮質(zhì)激素(ICS)是目前最強(qiáng)的氣道局部抗炎藥物，其通過對炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞和分子產(chǎn)生影響而發(fā)揮抗炎作用。

中醫(yī)學(xué)理論將支氣管哮喘歸納為“哮病”，該病屬“吼病”、“痰飲”的范圍，從中醫(yī)外治法角度探究兒童哮喘的防治方法已成為國內(nèi)眾多學(xué)者的研究方向。目前常用的中醫(yī)方法包括針灸治療、穴位敷貼、穴位注射、敷臍治療、推拿治療、耳壓治療、灌腸治療、霧化吸入治療等，這些方法在治療兒童哮喘方面均取得了較好的療效[13]。

TZY是由太子參、冬蟲夏草、浙貝母、天花粉、檳榔、白及、甘草等7味純原生植物藥整體組方。中醫(yī)角度，TZY從根本上針對腎、脾兩虛加以治療。臨床上治療哮喘已得到廣泛認(rèn)可[5]。鑒于此，本文開展TZY治療大鼠哮喘的作用研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與哮喘模型組相比，TZY可降低氣道支氣管細(xì)胞的炎性浸潤，提示其具有良好的治療哮喘作用。

炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是哮喘的可能發(fā)病機(jī)制之一，在哮喘發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[14-15]。IgE類抗體是引起支氣管哮喘的主要效應(yīng)分子之一。當(dāng)變應(yīng)原初次進(jìn)入機(jī)體后,刺激B細(xì)胞增殖并分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生IgE類抗體，IgE可與嗜酸性粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞表面的IgE Fc受體高親和力結(jié)合，使機(jī)體致敏；當(dāng)機(jī)體受到相同變應(yīng)原再次刺激后，其與連接在嗜酸性粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞表面的IgE交叉結(jié)合，導(dǎo)致受體交聯(lián)，啟動(dòng)激活信號，從而導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞活化和脫顆粒, 釋放多種組胺、活性介質(zhì)等引發(fā)I型變態(tài)反應(yīng)[16-18]。同時(shí)有報(bào)道顯示炎癥因子IL-4、IL-5、IFN-γ可用于研究哮喘所致的炎癥反應(yīng)，與本文結(jié)果一致[19-20]。本文結(jié)果顯示，TZY 組IL-4、IL-5、IgE水平顯著降低，但I(xiàn)FN-γ水平顯著升高 (P<0.05)，且呈劑量依賴性，提示TZY可以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子。此外，氧化應(yīng)激是哮喘炎癥發(fā)生發(fā)展的另一重要機(jī)制[21-22]。本文檢測了哮喘大鼠TZY治療后GSH、T-AOC、SOD及MDA表達(dá)，考察其氧化應(yīng)激水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與哮喘組相比，TZY組GSH、T-AOC、SOD水平顯著升高，MDA水平顯著降低，提示該復(fù)方具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的作用。

本文進(jìn)一步研究了大鼠外周血不同Th細(xì)胞比例，Th1、Th2細(xì)胞是參與哮喘發(fā)生發(fā)展的主要免疫細(xì)胞，Th1/Th2比例可反應(yīng)哮喘個(gè)體免疫紊亂程度及功能[23-24]。結(jié)果顯示，TZY可下調(diào)Th2(CD4+IL-4+)細(xì)胞水平、上調(diào)Th1(CD4+IFN-γ+)細(xì)胞水平及Th1/Th2比例，提示TZY能調(diào)節(jié)哮喘大鼠免疫紊亂，提高免疫功能。

綜上，TZY可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，提高機(jī)體免疫功能從而治療大鼠哮喘，本文結(jié)果為進(jìn)一步臨床推廣該復(fù)方(或和激素聯(lián)合應(yīng)用)治療支氣管哮喘奠定基礎(chǔ)。